KR101474216B1

KR101474216B1 - 피부노화 방지 및 피부주름 개선효과를 갖는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101474216B1
Application number: KR1020070095023A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 문지영; 김재우; 김주호; 유권종; 김철수; 김대신
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2007-09-19
Publication date: 2014-12-18
Also published as: KR20090029873A

Abstract

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 서어나무속(Carpinus) 추출물에 관한 것으로, 서어나무속 식물 잎의 추출물이 계면활성제에 대한 피부세포 보호효과가 우수하며, MMP-1활성을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

서어나무속, 화장료, 노화 방지, 피부주름, 콜라겐합성촉진

Description

피부노화 방지 및 피부주름 개선효과를 갖는 화장료 조성물 {Cosmetic compositions used for antiaging and antiwrinkle}

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름 개선 효과를 갖는 서어나무속(Carpinus) 추출물에 관한 것으로, 서어나무속 식물 잎의 추출물이 라디칼 소거활성이 뛰어나고, 계면활성제에 대한 피부세포 보호효과가 우수하며, MMP-1활성을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

사람의 피부는 25세를 전후해서 피부노화가 촉진된다. 피부노화를 설명하는 이론들은 주로 프리 라디칼 반응에 초첨을 두고 있다. 세포대사과정중에 생성된 프리 라디칼은 각종 반응기구를 통해 노화에 관여한다. DNA에 손상을 입혀 돌연변이를 유발하며 막지질을 산화시켜 세포내 소기관들을 파괴한다. 이러한 일련의 과정들은 세포가 정상적으로 분열, 성장하는데 큰 위협이 되며 이것들이 축적되어 노화가 일어나기 시작한다. 또한 피부가 자외선에 노출 되었을 때 섬유아세포에서 프리 라디칼의 한 종류인 활성산소종이 생성되어 콜라게네이즈(collagenase, 이하 MMP-1)의 발현이 유도된다.(Yoshiharu Kawaguchi et al. ,1996)

MMP-1은 세포외 기질인 콜라겐을 분해하는 효소로서 기질 금속단백질분해효소 (matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함) 의 한 종류이다. MMP-1은 콜라겐 타입 I을 분해한다. 따라서 MMP-1의 발현이 유도되면 콜라겐의 합성이 감소하여 피부에 주름이 발생하게 된다.(Laure Rittie et al., 2002)

따라서 피부 노화와 주름을 예방하기 위해서는 생체내에서 생성되는 프리라디칼의 발생을 억제하고 MMP-1의 작용을 저해하는 물질의 개발이 필요하다.

지금까지 연구보고 된 주름완화 및 피부노화 예방 물질로는 레티놀, 아데노신, AHA 등이 개발되어 있으나 안정성이 떨어지며 피부자극을 유발하고 뚜렷한 가시적인 효과가 미흡하다는 문제점을 안고 있다. 따라서 앞선 문제점들을 보완할 수 있는 주름개선 및 피부노화예방 소재 연구가 필요한 상황이다.

서어나무 (Carpinus )속은 40 종으로 구성되며 북반구의 온대 지역에 분포하는데, 개서어나무(C. tschonoskii ), 서어나무(C. laxiflora ), 까치박달나무(C. cordata), 소사나무(C. turczaninovii) 및 섬개서어나무(C. fauriei)의 5 종이 한반도에 분포한다(Lee et al., 1989). Carpinus 속으로부터 플라보노이드를 분리하였다는 보고가 있으며, 여기에는 플라보놀(flavonols) 미리세틴(myricetin), 캄페롤(kaempferol) 및 쿠에르세틴(quercetin), 그리고 플라본(flavones) 아피게닌(apigenin) 및 루테올린(luteolin)이 존재한다고 알려져 있다.(Chang et al., 2004)

한편, 한국특허등록번호 제478136호(2005.3.11)에는 항산화 활성을 가지는 식물유래추출물을 기재하고 있으며, 여기에 본 발명과 같은 속 식물인 서어나무(C. laxiflora)와 소사나무(C. turczaninovii)추출물도 항산화활성을 가지는 것으로 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 피부주름개선효과를 나타내는 콜라겐합성촉진효과와 콜라게나제의 활성저해효과는 개시되어 있지 않다.

개서어나무(Carpinus tschonoskii)는 중국, 일본, 우리나라 남부에 자생하며 낙엽 교목으로 높이 15m, 지름 1m.이다. 수피는 회색이며, 잎은 난형*타원형으로 길이 5~12cm, 너비 3~4cm이며 점첨두, 원저이고 불규칙한 복거치가 있으며 뒷면에 털이 있고, 측맥은 14~16쌍이다. 수꽃은 처지고 각 포에 1개씩 달리며, 암꽃은 대가있고 처지고 2개씩 달리며 길이 4~8cm의 화서를 이루고 4~5월에 개화한다. 과수축에는 털이 있으며, 과포는 난상 피침형으로 길이 2~3.2cm이며 첨두이고 가장자리 한측면만 거치가 있고, 견과는 삼각상 난형으로 윗부분에 털이 있으며 10월에 성숙한다. 주로 기구재·곡목(曲木)·세공·활자, 표고버섯 재배용 목재 등으로 쓰고 수형이 깔끔하여 공원수로 심는다. 개서어나무 잎의 주요 성분으로는 미리세틴(myricetin), 캄페롤(kaempferol) 및 쿠에르세틴(quercetin) 등이 동정되었다.(Chang et al., 2004)

서어나무(Carpinus laxiflora)는 중국, 일본, 우리나라 남부에 자생하며 낙엽 교목으로 높이는 15m, 지름은 1m에 달한다. 나무 껍질은 회색이고 근육처럼 울퉁불퉁하다. 잎은 어긋나고 길이 5.5∼7.5cm의 타원 모양 또는 긴 달걀 모양이며 끝이 길게 뾰족하고 가장자리에 겹톱니가 있으며 뒷면 맥 위에 털이 있다. 꽃은 암수한그루이고 5월에 피며 미상꽃차례를 이루며 달린다. 수꽃이삭은 작은 가지에 달리고 밑으로 처지며, 수꽃은 각 포에 1개씩 달리고 8개의 수술이 있으며 수술대는 2개로 갈라진다. 암꽃이삭은 자루가 있으며, 암꽃은 각 포에 2개씩 들어 있고 암술머리는 2개이다. 열매이삭은 긴 원기둥 모양이고 길이가 4∼8cm이며 밑으로 처지고, 포는 4∼8개이고 한쪽에 깊이 패어 들어간 톱니가 있으며 반대쪽 밑에 1개의 돌기가 있다. 열매는 소견과이고 길이 3mm의 넓은 달걀 모양이며 10월에 익는다. 서어나무 잎의 주요 성분으로는 캄페롤(kaempferol), 쿠에르세틴(quercetin), 나린제닌(naringenin), 제니스틴(genistein) 등이 동정되었다.(Chang et al., 2004)

까치박달나무(Carpinus cordata)는 중국, 일본, 우리나라에 자생하며 낙엽 교목으로 높이 약 15~18m, 지름 약 60cm이다. 나무껍질은 잿빛이다. 잎은 어긋나고 긴 달걀 모양으로 길이 7∼14cm, 나비 7cm이며 가장자리에 불규칙한 톱니가 있다. 꽃은 5월에 잎과 함께 피며 암수한그루이다. 수꽃이삭은 노란빛이 도는 녹색이고 포마다 1송이씩 수꽃이 핀다. 암꽃이삭은 새가지 끝에 달리고 포마다 2송이씩 암꽃이 핀다. 열매는 작은 견과로 원형이며 10월에 익는다. 목재는 심재와 변재의 구별 없이 잿빛이 도는 황백색으로 조직이 치밀하고 굳으며 탄력성이 좋고 질겨서 잘 쪼개지지 않는다. 기구재·목기재·가구재·등으로 쓰인다. 까치박달나무 잎의 주요성분으로는 carpinontriols A, B, casuarinondiol, (+)-catechin, methyl gallate, methyl gallate 3-O-beta-D-glucopyranoside, methyl gallate 4-O-beta-D-glucopyranoside, and methyl gallate 3-O-beta-D-(6'-O-galloyl) -glucopyranoside, 캄페롤(kaempferol), 쿠에르세틴(quercetin)이 분리 동정되었다.(Chang et al., 2004) (Lee et al., 2002)

소사나무(Carpinus turczaninovii)는 한국 특산종으로 제주에서 자라며 낙엽 교목으로 작은 가지와 잎자루에 털이 밀생하고 턱잎은 선형이다. 잎은 어긋나고 달걀모양이며 끝이 뾰족하거나 둔하고 밑은 둥글다. 잎 길이는 2∼5 cm로서 겹톱니가 있고 뒷면 맥 위에 털이 있다. 꽃은 5월에 피고 열매는 견과로 달걀모양이며 10월에 익는다. 열매이삭은 길이 2∼3 cm이고 4∼6개의 포(苞)가 달린다. 포는 반달걀모양이고 끝이 둔하며 톱니가 있고 밑부분이 약간 열매를 둘러싼다. 소견과(小堅果)는 달걀모양이며 길이 5 mm 정도로서 지점(脂點)이 있다. 소사나무 잎의 주요 성분으로는 쿠에르세틴(quercetin)이 분리 동정되었다.

섬개서어나무(Carpinus fauriei)는 한국, 중국 일본에 분포하며 낙엽 교목으로 높이 약 15m, 지름 약 70cm이다. 나무껍질은 잿빛이고 울퉁불퉁하다. 작은 가지에 누운 털이 나고 흰색 피목이 있다. 잎은 어긋나고 타원 모양이거나 달걀처럼 생긴 타원 모양이며 길이 4∼8cm, 나비 2∼4cm이다. 서어나무보다 약간 두껍고 끝부분이 점점 뾰족해지며 가장자리에 날카로운 잔 겹톱니가 있다. 곁맥은 12∼15쌍이고 잎자루는 길이 8∼12mm로서 털이 난다. 겉면과 뒷면 맥 위에 누운 털이 난다. 꽃은 암수한그루로서 5월에 피는데, 미상꽃차례로 달린다. 수꽃이삭은 묵은 가지의 꽃겨드랑이에 달리며, 길이 4∼5cm로서 밑으로 처진다. 암꽃이삭은 새가지 끝에 달리며 역시 밑으로 처진다. 열매는 견과로서 넓은 달걀 모양이고 길이 4∼4.5mm이며 10월에 익는다. 건축재·기구재·표고버섯 재배 원목으로 쓴다.

본원 발명은 천연유래추출물을 함유하는 피부노화 예방 및 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하고자 하는 것으로, 서어나무 속 식물 추출물이 피부주름개선에 효과가 있음을 밝혀 이를 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 서어나무속(Carpinus) 식물 추출물에 관한 것으로, 서어나무속(Carpinus) 잎의 추출물이 라디칼 소거활성이 뛰어나고, 계면활성제에 대한 피부세포 보호효과가 우수하며, MMP-1을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 서어나무속 추출물은 개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무 잎을 60~95중량% 에탄올, 메탄올, 1,3-부틸렌글리콜 등을 추출용매로 사용하여 추출한 것으로 본 발명자는 서어나무속인 개서어나무, 서어나무, 소사나무, 섬개서어나무의 지표성분이 쿠에시트린(quercitrin) 임을 처음으로 밝혔다.

본 발명에 따른 피부주름개선용 화장료 조성물에 함유되는 서어나무속 잎 추출물의 함량은 조성물 전체중량의 0.0005 내지 5 중량% 포함되는 것이 바람직하다.

0.0005 중량%이하 함유하면 본 발명의 효과를 기대하기 어렵고, 5중량% 이상 함유하면 화장료조성물의 제제화에 어려움이 있다.

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 서어나무속(Carpinus ) 추출물에 관한 것으로, 서어나무속(Carpinus ) 식물들의 잎 추출물은 라디칼 소거활성이 뛰어나고 계면활성제에 대한 피부세포 보호효과가 우수하며, MMP-1활성을 저해하고 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있어 피부주름개선에 유용한 화장품은 물론 식품으로도 사용 가능하다.

실시예 1 : 서어나무속 잎 식물들의 에탄올추출물 제조

개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무 잎은 각각 제주시 소재 한라수목원에서 채취하였다.

시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 잎 2g을 80% 에탄올 30㎖로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (제조판매원:Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과한다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 각 서어나무속 잎 추출물 약 215.8㎎을 얻었다. 각 서어나무속 식물들은 최소 3개체 이상을 선별하여 본 연구를 실시하였다.

실시예 2 : 서어나무속 잎 에탄올 추출물들의 용매분획물 제조

실시예 1에서 얻은 서어나무속 잎 에탄올추출물들에 대해 용매분획을 실시하였다.

서어나무 속 잎 에탄올추출물들 150mg을 각각 헥산과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 통상적인 방법으로 용매분획을 실시하여 약 16.1mg, 5.0mg, 25.9mg, 33.6mg, 21.8mg의 용매분획 층을 얻었다.

실시예 3 : 서어나무속 식물 잎 추출물로부터 지표성분 분리 및 구조 확인

실시예 2에서 얻은 각 분획물 중 주름개선효과가 우수한 서어나무 속 식물들 인 개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 지표성분을 분리, 동정하였다.

주름개선 효과가 우수한 개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획을 역상실리카겔(Silica gel 100 C₁₈- Reversed phase)을 충진한 칼럼(5×10)을 이용하여 분리하였다. 용출용매는 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올을 순차적으로 사용하였다. 이렇게 얻어진 분획들을 회전농축기로 농축하여 5개의 분획들을 얻을 수 있었다. 5개의 분획 중 한 개의 분획을 ODS column을 장착한 분취용 고성능액체크로마토그래피 기기로 분리 하였다. 이 때 이동상은 정제수/아세토니트릴 6/1에서 4/6으로 50분 동안 기울기 통과법을 이용하여 분리하였다. 각 식물에 대한 분리 분획 중 정제율이 좋았던 분획의 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석을 하였다.(도 1a 및 도 1b 참조)

3-1. 서어나무 속 잎 추출물의 지표성분 분석

개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 분리한 정제 분획들의 구조를 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 확인하였다.

¹H-NMR(400MHz CD₃OD) 분석 결과 6.18~7.34ppm 사이에 나타나는 4개의 시그널로 보아 방향족 고리의 수소가 있음이 예상되었고, 0.94ppm에서 rhamnose CH₃ 수 소 시그널이 나타남을 확인하였고, 3.31~ 5.34ppm 사이에 나타나는 시그널로 rhamnose에 기인하는 전형적인 수소가 있음을 예상할 수 있었다. ¹³C-NMR(100MHz CD₃OD)분석 결과 탄소의 수가 21개임을 확인하였고, 90~170ppm에서 나타나는 시그널로 불포화탄화수소 및 방향족 고리의 탄소가 존재함을 예상할 수 있었다. 또한 17ppm 근처에 나타나는 시그널로 메틸 탄소가 존재함을 예상할 수 있었다. 이러한 데이터 분석과 이미 보고된 문헌 (Yang et al., 2001, Lee et al., 2003)과 비교한 결과 쿠에시트린(quercitrin)으로 동정하였다.

쿠에시트린(quercitrin)은 이미 항산화효과, 항암효과 등 다양한 생리 활성이 밝혀진 물질이다.

까치박달나무(Chang et al., 2004)를 제외하고, 개서어나무, 서어나무, 소사나무, 섬개서어나무로부터 쿠에시트린(quercitrin)을 분리 동정한 것은 본 연구결과가 처음이다.

3-2. 서어나무 속 잎 추출물에서 지표성분 함량 측정

서어나무 속 잎 추출물들에 대해 본 실시예 3에서 동정한 쿠에시트린(quercittrin) 함량을 HPLC로 분석하였다. 지표성분으로 동정한 쿠에시트린(quercitrin) 표준품(Sigma Co.)을 구입하여 사용하였다. 쿠에시트린(quercitrin)의 머무름시간은 19.64분이며 PDA검출기를 통해 UV 고유 흡수 파장 254.9nm와 347.6nm를 확인하였다. 분석조건은 표1과 동일하다.

서어나무 속 잎 추출물들에 포함되어 있는 쿠에시트린(quercitrin)의 HPLC 분석조건

시간(분)	유속(㎖/min)	증류수(%)	아세토니트릴(%)
0	0.6	90	10
50	0.6	40	60
51	0.6	0	100
55	0.6	0	100
컬럼	RP-C18
검출기	photo diode array detector(PDA)

서어나무 속 식물 잎 추출물들의 쿠에시트린(quercitrin) 함량

시료	에탄올 추출물 총 건조중량에 대한 쿠에시트린의 함량(%)
개서어나무	0.50
서어나무	0.22
섬개서어나무	0.47
소사나무	0.42
까치박달나무	2.74

표 2에서와 같이 개서어나무, 서어나무, 까치박달나무, 소사나무, 섬개서어나무, 5종의 서어나무 속에서 쿠에시트린(quercitrin)이 공통으로 함유되어 있음을 확인하였다. 이 중 까치박달나무 추출물에서 쿠에시트린(quercitrin) 함량이 가장 많았으며, 서어나무속 잎 에탄올 추출물 총 건조중량에 대한 쿠에시트린(quercitrin) 함량 분포는 0.1~3% 임을 확인 하였다.

실험예 1 : DPPH 라디칼 소거활성능력 측정실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화력을 확인하였다. 추출물들의 항산화능력을 기존의 항산화제인 vitamin C와 비교 측정하였다.

DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진) 2.96mg을 에탄올 50㎖에 녹여 0.2mM DPPH 용액을 만들었다. 항산화능을 측정하고자 하는 시료를 에탄올에 녹여 희석하고 96공 평판 플레이드에 150㎕씩 분주한 다음 DPPH 용액 150㎕를 시료액과 30분간 반응시키고 microplate reader를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료대신 에탄올을 넣은 반응액을 대조군으로 하여 라디칼 소거능력을 측정하였다. 이때 사용된 계산식은 아래와 같다.

Scavenge(%) = {1-(A-B)/C}×100

A : 시료액과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

B : 시료액 자체 흡광도

C : 에탄올과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

표 3에서 같이 서어나무 속 추출물들을 정제할 경우 기존항산화제인 vitamin C와 비교하여 유사한 항산화 효과를 보임을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 개서어나무 잎 추출물에 대한 세포보호작용 효과를 확인한 연구 결과를 논문에 보고한 바 있다.(Zhang. et al., 2007)

서어나무속 식물 잎 추출물의 항산화능

시료	농도 (㎍/㎖)	Scavenge (%)	SC₅₀ (㎍/㎖)	시료	농도 (ug/ml)	Scavenge (%)	SC₅₀ (㎍/㎖)
개서어나무 에탄올 추출물	1	4.45	13.31	개서어나무-에틸아세테이트 분획	1	3.96	5.10
	10	42.85			10	87.86
	25	75.48			25	90.31
	50	90.80			50	92.31
섬개서어나무 에탄올 추출물	1	17.35	16.70	섬개서어나무-에틸아세테이트 분획	1	18.99	5.73
	10	37.00			10	77.93
	20	56.16			20	95.59
	50	91.38			50	96.06
서어나무 에탄올 추출물	1	12.80	8.37	서어나무 -에틸아세테이트 분획	1	18.04	5.29
	10	58.62			10	85.08
	20	85.22			20	95.72
	50	95.52			50	96.03
소사나무	1	12.32	6.69	소사나무	1	19.92	4.97
에탄올 추출물	10	71.77	6.69	-에틸아세테이트 분획	10	88.33	4.97
	20	94.15			20	95.52
	50	95.45			50	95.59
까치박달나무 에탄올 추출물	1	11.70	7.71	까치박달나무 -에틸아세테이트 분획	1	21.36	5.67
	10	42.85			10	76.42
	20	71.94			20	95.38
	50	95.31			50	95.96
Vitamin C	1	14.07	4.98	-	-	-	-
	10	59.96			-	-
	20	96.54			-	-
	50	96.68			-	-

실험예 2 : 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 측정 실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 효과를 관찰하기 위해 수행 하였으며 정제된 콜라게나제와 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 하였다. 먼저, 반응 완충액(0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ^TM콜라겐 용해액(Molecular probes, USA) 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 5 Unit의 콜라게나제(GIBCO, USA) 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광 분광광도계를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차추출물(김지은, 인체피부 섬유아세포에서 열자극에 의해 유도되는 type Ⅰprocollagen, MMP-1과 TIMP-1 발현에 대한 녹차추출물(epigallocatechin-3-gallate)의 효과: 고려대학교 생명환경과학대학원 생명유전공학과, 2004. 2)을 사용하였다.

참고로, 녹차 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소생성억제 작용은 대한민국 특허 특1999-0056976에 개시되어 있다. 각 시료의 콜라게나제의 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 형광값으로 하였다.

서어나무속 식물 추출물들의 MMP-1 저해효과

시료	농도	저해율 (%)	IC₅₀ (㎍/㎖)	시료	농도	저해율 (%)	IC₅₀ (㎍/㎖)
개서어나무 에탄올 추출물	10	9.1	52.8	개서어나무-에틸아세테이트 분획	10	21.5	26.17
	50	48.2			50	92.4
	100	80.3			100	99.0
	150	95.8			150	99.3
소사나무 에탄올 추출물	10	17.2	112.7	소사나무-에틸아세테이트 분획	10	10.4	83.3
	50	20.9			50	36.1
	100	47.6			100	56.9
	150	57.1			150	73.5
서어나무 에탄올 추출물	10	21.83	>150	서어나무-에틸아세테이트 분획	10	20.3	113.7
	50	22.5			50	26.7
	100	30.8			100	44.0
	150	38.7			150	65.9
섬개서어나무 에탄올 추출물	10	16.0	>150	섬개서어나무-에틸아세테이트 분획	10	22.6	29.8
	50	11.7			50	77.6
	100	30.0			100	98.7
	150	37.2			150	100.0
까치박달나무 에탄올 추출물	10	22.7	>150	까치박달 나무-에틸아세테이트 분획	10	20.4	96.5
	50	17.1			50	26.8
	100	24.2			100	51.8
	150	38.5			150	63.9
녹차 추출물	10	3.49	145.4	-	-	-	-
	50	16.15			-	-
	100	31.04			-	-
	150	51.94			-	-

표 4에서 나타난 바와 같이 서어나무 속 잎 추출물들 중에서 개서어나무와 소사나무 추출물은 기존의 MMP-1 저해제로 알려진 녹차 추출물보다 우수한 MMP-1 저해물임을 확인하였다. 특히 개서어나무 추출물은 녹차추출물보다 약 3배 우수한 효과를 나타내었다. 서어나무, 섬개서어나무, 까치박달나무의 각 추출물에서는 녹차추출물보다 효과가 낮았지만 정제한 에틸아세테이트 분획물들은 녹차추출물보다 MMP-1저해 효과가 높게 나타나는 것을 확인하였다. 정제된 에틸아세테이트 분획물들 중에서는 개서어나무와 섬개서어나무가 녹차 추출물보다 약 5배 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 3 : SLS에 의해 유발되는 세포독성 완화 효과

SLS(Sodium lauryl sulfate)는 화장품에 첨가되는 계면활성제이며 접촉성 피부염을 일으키는 대표적인 부식성 자극물질로 피부장벽 기능의 손실을 유발하며 경표피 수분손실을 증가시킨다. 본 실험예에서는 수득한 시료들의 인간 정상섬유아세포에 대한 SLS 자극완화 효과를 평가하고자 세포 배양 기술을 이용하여 실험을 수행하였다.

사람의 정상 섬유아세포 (Human normal fibroblast)를 IMDM 배지가 들어 있는 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (10000 세포/well), 10% CO₂ 조건에서 37℃로 24시간 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입하였다. 먼저 예비 실험을 통해 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 10㎍/㎖ 농도 이내에서 세포 독성이 없음을 동일조건의 실험을 통해 확인하였다. 그 후 100㎍/㎖ SLS와 농도별로 희석된 각 시료를 동시에 처리하고 음성대조군으로 100㎍/㎖ SLS를 단독으로 처리하여 24시간동안 추가 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 각 웰 당 MTT 용액 [3-(4,5-Dimethyl-thiazole-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide : 2.0 ㎎/㎖] 50㎕를 첨가하였다. 4시간 동안 반응 후, MTT 용액을 제거하고. 각 웰당 200㎕의 디메틸설폭시드 (DMSO :Dimethyl sulfoxide)용액을 가하여 20분간 교반하여 생성된 formazan을 녹였다. 마이크로플레이트 리더 (microplate Reader)를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 시료의 SLS에 의한 세포 독성 완화 효과를 확인하였다.

서어나무속 식물 추출물들의 SLS에 의해 유도된 세포독성 완화효과

시료	농도(㎍/㎖)	세포생존률(%)
개서어나무 에탄올 추출물	0.1	99.8
	1	102.2
	5	104.0
	10	103.6
소사나무 에탄올 추출물	0.1	51.61
	0.5	53.11
	1	60.79
	10	67.53
서어나무 에탄올 추출물	0.1	46.92
	0.5	49.15
	1	58.98
	10	57.72
섬개서어나무 에탄올 추출물	0.1	41.49
	0.5	43.88
	1	47.53
	10	64.12
까치박달나무 에탄올 추출물	0.1	42.18
	0.5	44.99
	1	50.69
	10	63.91
SLS	100	38.86
control	-	100.00

표 5의 결과로부터 서어나무 속 잎 추출물들은 화장료 조성물에 포함 되었을 때 계면활성제에 의해 나타날 수 있는 피부자극을 완화하는 물질임을 확인하였다. 특징적으로 서어나무 속 잎 추출물들 중 개서어나무 잎 추출물은 다른 추출물들에 비해 그 효과가 가장 우수함을 확인하였다.

실험예 4 : 콜라겐 합성 촉진 효과 측정 실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 콜라겐 합성 촉진효과를 측정하기위해 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판배양기(96-well plate)에 5% 우태아혈청이 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbesco's Media) 배지와 함께 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입한 인간의 정상섬유아세포(CCD-985sk)를 10000 세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 시료를 우태아혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지에 농도별로 희석하여 2일 동안처리하고 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Procollagen Type I-C-peptide EIA Kit(MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(Procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide : PICP) 합성양을 측정하였다.

측정방법은 우선 콜라겐 항체가 균일하게 도포되어 있는 96공 평판배양기에 POD(perosidase)효소가 결합된 항체용액 100㎕와 채취된 세포배양액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 상등액을 모두 제거하고 각 well을 400㎕의 PBS로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well에 POD와 반응하는 기질용액 100㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위해 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 콜라겐 측정 키트에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준농도곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

서어나무 속 식물 추출물의 콜라겐 합성 촉진 효과

시료	농도 (㎍/㎖)	콜라겐합성률 (%,control)	시료	농도 (㎍/㎖)	콜라겐합성률 (%,control)
개서어나무 에탄올 추출물	1.0	241.0	개서어나무-에틸아세테이트 분획	1.0	135.0
소사나무 에탄올 추출물	1.0	83.65	소사나무-에틸아세테이트 분획	1.0	174.25
서어나무 에탄올 추출물	1.0	164.89	서어나무-에틸아세테이트 분획	1.0	144.46
섬개서어나무 에탄올 추출물	1.0	57.90	섬개서어나무-에틸아세테이트 분획	1.0	164.50
까치박달나무 에탄올 추출물	1.0	120.77	까치박달나무-에틸아세테이트 분획	1.0	140.74
대조군	-	100	-	-	-

표 6에서 나타난 바와 같이 서어나무 속 잎 추출물들 중 개서어나무, 서어나무, 까치박달나무 추출물을 각각 1㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과가 있음을 확인하였다. 그 중 개서어나무 잎 추출물은 대조군에 비해 약 2배 정도 콜라겐 합성량을 증가시켰음을 확인하였다. 서어나무 속 잎 추출물들을 더욱 정제한 에틸아세테이트 분획물들은 모두 대조군에 비해 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과를 보였으나 개서어나무와 서어나무의 경우는 에탄올 추출물과 비교하여 감소하는 경향을 보였다.

도 1a : 서어나무 속 잎 추출물의 에틸아세테이트 정제 분획물에서 분리한 분획의 ¹H NMR 스펙트럼(400MHz NMR, CD₃OD)

도 1b : 서어나무 속 잎 추출물의 에틸아세테이트 정제 분획물에서 분리한 분획의 ¹³C- NMR 스펙트럼(100MHz NMR, CD₃OD)

도 2a : 쿠에시트린(quercitrin) 표준품(sigma Co.)의 HPLC 크로마토그램

도 2b : 서어나무 속 잎 추출물의 HPLC 크로마토그램

(도 2a 및 도 2b는 유속: 0.6ml/min, 정제수/아세토니트릴 1/9에서 4/6으로 50분 동안 기울기 통과법으로 분리)

Claims

소사나무, 섬개서어나무, 까치박달나무 중에서 선택되는 서어나무속 식물 잎 추출물을 조성물 전체중량의 0.0005 내지 5 중량% 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 서어나무속 식물 잎 추출물은 에탄올추출물이며, 지표성분은 쿠에시트린(quercitrin) 임을 특징으로 하는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료조성물.
제1항에 있어서, 서어나무속 식물의 잎 추출물은 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획이며, 지표성분은 쿠에시트린(quercitrin)임을 특징으로 하는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료조성물.
제1항에 있어서, 피부세포 독성 완화 효과가 있는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료조성물.
제1항에 있어서, 피부주름개선효과가 MMP-1의 활성저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료조성물.
제1항에 있어서, 피부주름개선효과가 콜라겐 합성 촉진효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 갖는 화장료조성물.