KR20220139512A - 떨꿩나무 잎 유래 화합물 및 이를 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력 조성물 - Google Patents

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Abstract

떨꿩나무 잎 유래 신규 화합물, 상기 화합물을 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 조성물, 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 떨꿩나무 잎 유래 신규 화합물은 낮은 세포 독성을 나타내고, 타이로시나제 저해 활성화능을 가지므로, 타이로시나제 억제 기능성을 갖는 식품, 의약품, 화장품 등에 안전하게 사용될 수 있다. 다른 양상에 따른 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 조성물은 떨꿩나무 잎 유래 신규 화합물이나 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함함으로써 타이로시나제에 의한 질환을 개선하거나 피부 미용 목적으로 사용될 수 있다

Description

떨꿩나무 잎 유래 화합물 및 이를 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력 조성물{Compound extracspted from the leave of Viburnum erosum Thunb and tyrosinase activity inhibitory ability composition comprising the same}
본 발명은 떨꿩나무 잎 유래 화학물, 상기 화합물을 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력 조성물, 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력 조성물에 관한 것이다.
멜라닌은 동물체내에서 페놀화합물의 산화중합에 의하여 생성되는 흑갈색 색소이며 인간의 피부, 털, 눈 등의 색을 결정짓고, 자외선에 의한 피부 손상으로부터 보호해 주는 역할을 한다.
그러나 멜라닌이 과도하게 생성되면 피부침착, 주근깨, 기미 등의 원인이 되기도 한다. 타이로시나제(tyrosinase)는 멜라닌 생성에 관여하는 효소로 melanocyte내의 L-tyrosine을 순차적으로 산화시켜 멜라닌을 생성한다.
타이로시나제(tyrosinase) 억제제는 화장품 산업에서 피부 미백제로 개발 될 수 있으며, 피부암, 기미, 주근깨 등에서 과다 색소 침착을 억제하거나 치료할 수 있는 핵심요소로 간주된다. 천연물에서 발견되는 대표적인 타이로시나제(tyrosinase) 억제제로는 arbutin, kojic acid, niacinamide 등이 있다.
덜꿩나무(Viburnum erosum Thunb.)는 산토끼꽃목 산분꽃나무과에 속하며, 동아시아국가, 한국, 중국, 및 일본에 서식하는 낙엽 활엽 관목이다. 덜꿩나무의 줄기에서 신경보호 및 항 염증성 리그난이 보고된 바 있지만, 덜꿩나무의 다양한 화학적 구성물은 아직 광범위하게 연구되지 않고 있다.
상술한 기술적 배경을 바탕으로 안출된 것으로 본 발명의 일 실시예는 떨꿩나무 잎으로부터 추출된 6개의 신규 화합물을 제공한다.
다른 일시예로, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제 활성에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예로 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예로 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예로 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예로 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예로 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예는 하기 화학식 1 내지 9로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 제공한다.
[화학식]
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용어 "약학적으로 허용 가능"은 통상의 의약적 복용량으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 보다 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 염을 의미한다. 상기 염은 염산염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "이성질체"는 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐 만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위 치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함할 수 있다.
용어 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바 람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미할 수 있다.
용어 “수화물(hydrate)”은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없 는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념을 의미할 수 있다.
용어 “용매화물”은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미할 수 있다.
상기 화합물은 떨꿩나무 잎로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 화합물은 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 추출 또는 분리된 것일 수 있다.
덜꿩나무(Viburnum erosum Thunb.)는 산토끼꽃목 산분꽃나무과에 속하는 식물로, 동아시아국가, 한국, 중국, 및 일본에 서식하는 낙엽 활엽 관목이다. 잎은 마주나고 장란형이며 잎자루에 털이 있고 뾰족한 턱잎이 있다.
상기 화합물은 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 것일 수 있다.
용어 "활성 저해능력"이란 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것을 억제하거나 유전자 또는 단백질을 활성화시키는 것을 억제하는 능력을 의미 할 수 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 타이로시나제 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.
다른 양상은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 조성물을 제공 한다.
상기 타이로시나제 활성 저해능력 조성물은 타이로시나제 활성 저해능력이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료 등 다양한 산업분야에서 적용되는 물품에 타이로시나제 활성 저해능력화능을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있다.
또한 의약품 보존제, 화장품 보존제, 식품 보존제, 의약품 첨가제, 화장품 첨가제, 식품첨가제 및 사료첨가제 등의 소재로도 사용될 수 있다. 따라서, 상기 타이로시나제 저해 활성화능 조성물은 화장료, 식품, 또는 약학 조성물일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 화합물, 타이로시나제에 의한 질환, 예방에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어 “개선”은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 화합물에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 피부 미용 개선은 피부 주름 개선 또는 미백제일 수 있다.
또 다른 양상은 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제 저해 활성화능 조성물을 제공한다. 상기 타이로시나제 저해 활성화능 조성물은 타이로시나제 저해 활성화능이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료 등 다양한 산업분야에서 적용되는 물품에 타이로시나제 저해 활성화능 활성을 부여 할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있다. 또한 의약품 보존제, 화장품 보존제, 식품 보존제, 의약품 첨가제, 화장품 첨가제, 식품첨가제 및 사료첨가제 등의 소재로도 사용될 수 있다. 따라서, 상기 타이로시나제 저해 활성화능 조성물은 화장료, 식품, 또는 약학 조성물일 수 있다.
또 다른 양상은 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 타이로시나제에 의한 질환, 예방, 치료에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물은 상기 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물 1 내지 화합물 6 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화합물 1 내지 화합물 6에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 떨꿩나무 잎은 전체 또는 그 일부분일 수 있다. 추출에 사용된 떨꿩나무 잎은 전체 또는 그 일부 분을 분쇄 또는 세절하거나 적당하게 건조한 것일 수 있다.
상기 추출물은 가온 추출, 가압 추출, 초음파 추출, 열수 추출, 환류 냉각 추출, 아임계 추출, 또는 초임계 추 출 등 당업 기술분야에서 통상적인 방법으로 추출된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 상기 떨꿩나무 잎 추출물의 분획물을 유효성분으로서 포함할 수 있다.
용어, "분획물(fraction)"은 상기 떨꿩나무 잎의 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질 즉, 분획되어진 물질을 나타낸다. 상기 분획물은 용매 분획화 (fractionation)에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 용매 분획 화는 떨꿩나무 잎 추출물을 용매와 혼합하고 상기 용매에 존재하는 물질을 분리하는 것일 수 있다. 상기 분획물은
상기 약학적 조성물은 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가 능한 부형제 또는 담체에 관한 설명은 상기한 바와 같다.
또 다른 양상은 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 떨꿩나무 잎 추출물, 분획물, 타이로시나제에 의한 질환, 예방, 개선에 대해서는 상기한 바와 같다.
또 다른 양상은 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 떨꿩나무 잎 추출물, 분획물, 피부 미용 개선에 대해서는 상기한 바와 같다.
또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 타이로시나제에 의한 질환 을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 약학적 조성물, 타이로시나제에 의한 질환, 예방, 개선, 치료에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어 "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치 를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 화합물, 추출물, 또는 이의 분획물 성분의 적어도 일부를 생존 하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 일 양상에 따른 떨꿩나무 잎 유래 신규 화합물은 낮은 세포 독성을 나타내고, 타이로시나제 저해 활성화능 활성을 가지므로, 타이로시나제 저해 활성화능 기능성을 갖는 식품, 의약품, 화장품 등에 안전하게 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 타이로시나제 저해 활성화능 조성물은 떨꿩나무 잎 유래 신규 화합물이나 떨꿩나무 잎 추출물 또는 이의 분획 물을 포함함으로써 타이로시나제에 의한 질환을 개선하거나 피부 미용 목적으로 사용될 수 있다.
도 1 은 본 발명의 일 실시에 따른 덜꿩나무 추출 및 분획을 나타낸 도면이다.
도 2는 도 1에 나타낸 아틸아세테이트로 부터 분획을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 화합물 1 내지 9의 화학구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 떨꿩나무 잎으로부터 분획된 분획물의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 떨꿩나무 잎으로부터 분획된 분획물의 타이로시나제 활성도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 도 3에 나타낸 화합물의 타이로시나제 활성도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 도 3에 나타낸 화합물 9의 함량을 나타낸 표이다.
도 8은 도 7에 나타낸 화합물 9의 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
떨꿩나무 잎으로부터 화합물 1 ~ 9의 추출 및 분리
(1) 추출 및 분획
도 1 내지 도 3을 참고하면, 건조된 덜꿩나무의 잎 (V.erosum) 2kg을 80% MeOH로 3시간 3회 반복 추출하였다. 추출액을 필터 후 감압 농축기로 농축을 진행하여 추출물 356.0g을 얻었다. 추출물을 증류수에 현탁하여 n-Hexane (0.5 g), EtOAc (66.4 g), n-BuOH (123.7 g), 수용성 (165.0 g) 순으로 분획물을 획득하였다.
덜꿩나무 잎의 EtOAc 분획물(66.4g) 중 23.0g 을 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고, 8개의 분획(VEE1 ~ VEE8)으로 나누었다. 이중 VEE2로부터 화합물 1-8을 얻었으며, VEE3으로부터 화합물 9를 얻었다.
화합물 1의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10)으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-7을 MPLC 와 YMC-Actus Triart C18 column 을 사용하여 MeOH : H2O (65:35)의 용매조건으로 분리하였다. 7개의 소분획(VEE2-6-4-7-1 ~ VEE2-6-4-7-7)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-7-5에서 단일한 화합물 1 (11.7mg)을 얻었다.
화합물 2의 경우, VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10) 으로 나누었다. 이중 VEE2-6-4-9를 silica gel column을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-6-4-9-1 ~ VEE2-6-4-9-9)으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-9-5를 Preparative HPLC와 RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (7:3)의 용매 조건으로 정제하였다. Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-9-5-1에서 단일한 화합물 2 (0.9mg)을 얻었다.
화합물 3의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→ 8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10) 으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-7을 MPLC 와 YMC-Actus Triart C18 column 을 사용하여 MeOH : H2O (65:35)의 용매조건으로 분리하였다. 7개의 소분획(VEE2-6-4-7-1 ~ VEE2-6-4-7-7)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-7-2에서 단일한 화합물 3 (19.4mg)을 얻었다.
화합물 4의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→ 8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10) 으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-7을 MPLC 와 YMC-Actus Triart C18 column 을 사용하여 MeOH : H2O (65:35)의 용매조건으로 분리하였다. 7개의 소분획(VEE2-6-4-7-1 ~ VEE2-6-4-7-7)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-7-3에서 단일한 화합물 4 (11.1mg)을 얻었다.
화합물 5의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→ 8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10) 으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-2를 Preparative HPLC와 RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (35:65)의 용매 조건으로 정제하였다. 2개의 소분획(VEE2-6-4-2-1, VEE2-6-4-2-2)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-2-1에서 단일한 화합물 5 (6.3mg)을 얻었다
화합물6의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→ 8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10)으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-2를 Preparative HPLC와 RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (35:65)의 용매 조건으로 정제하였다. 2개의 소분획(VEE2-6-4-2-1, VEE2-6-4-2-2)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-2-2에서 단일한 화합물 6 (5.2mg)을 얻었다
화합물7의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-6을 Sephadex LH-20 column을 사용하여 MeOH : H2O (6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 11개의 소분획(VEE2-6-1 ~ VEE2-6-11)으로 나누었다. VEE2-6-4를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→ 8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 10개의 소분획(VEE2-6-4-1 ~ VEE2-6-4-10) 으로 나누었다. VEE2-6-4-4를 다시한번 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (4:6→5:5→6:4→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 3개의 소분획(VEE2-6-4-4-1 ~ VEE2-6-4-4-3) 으로 나누었다. 마지막으로 VEE2-6-4-4-2를 MPLC 와 YMC-Actus Triart C18 column 을 사용하여 MeOH : H2O (4:6)의 용매조건으로 분리하였다. 3개의 소분획(VEE2-6-4-4-2-1 ~ VEE2-6-4-4-2-3)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인 시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-6-4-4-2-3에서 단일한 화합물 7 (114mg)을 얻었다.
화합물8의 경우, VEE2 분획을 MPLC와 silica gel column 을 사용하여 DCM : MeOH (9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→3:7→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 9개의 소분획(VEE2-1 ~ VEE2-9)으로 나누었다. 이중 VEE2-2를 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 7개의 소분획(VEE2-2-1 ~ VEE2-2-7) 으로 나누었다. 마지막으로VEE2-2-5를 Preparative HPLC와 RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (1:1)의 용매 조건으로 정제하였다. 4개의 소분획(VEE2-2-5-1 ~ VEE2-2-5-4)을 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE2-2-5-2에서 단일한 화합물 8 (7.3mg)을 얻었다.
화합물8의 경우, 덜꿩나무 잎의 EtOAc 분획물(66.4g) 중 23.0g 을 MPLC와 RediSep® Rf RP-C18 column을 사용하여 MeOH : H2O (5:5→6:4→7:3→8:2→9:1→MeOH)의 용매 조건으로 분리하였고 8개의 분획(VEE1 ~ VEE8) 으로 나누었다.
화합물9의 경우, 8개의 분획(VEE1 ~ VEE8) 중 VEE3로부터 crystallization 되어 석출된 소분획 VEE3-C를 얻었다. Thin Layer Chromatography(TLC) 확인시험법을 이용하여 순도를 확인하였고, VEE3-C에서 단일한 화합물 9 (198mg)을 얻었다.
(2) 덜꿩나무 잎(V.erosum) 에서 분리한 화합물의 구조
화합물 1 내지 9에 대해 NMR 분석 및 MS 분석을 수행하였다. 피리딘-d5를 용매로 사용하여 Bruker Avance II 600 (Bruker, Germany) 분광계에서 H는 600 MHz, C는 150 MHz에서 얻었다. 하기 표 1에 화합물 1 내지 4의 NMR 결과를 나타내었으며, 하기 표 2에 화합물 5 내지 7의 NMR 결과를 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00002
[표 2]
Figure pat00003
화합물 1은 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 419.1690 [M-H]- calcd for 419.1706)측정값을 통해 분자식 C22H28O8 로 결정되었다.
화합물 1의 1D NMR 과 HSQC 데이터에서 전형적인 β-D-glucosyl group으로 예상되는 신호인 δH/δC 4.71 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1) / 103.6 (C-1),　 4.51 (1H, dd, J = 2.1, 11.8 Hz, H-6) / 65.1 (C-6), 4.24 (1H, dd, J = 7.2, 11.8 Hz, H-6) / 65.1 (C-6), 3.62 (1H, ddd, J = 2.1, 7.2, 9.5 Hz, H-5) / 75.4 (C-5), 3.43 (H, m, H-3) / 77.9 (C-3), 3.43 (H, m, H-2) / 74.9 (C-2), 3.36 (1H, dd, J = 6.5, 11.7 Hz, H-4) / 71.9 (C-4) 신호를 확인 했으며, 153.9 (C-6′), 152.3 (C-1′), 6.93 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′) / 119.5 (C-4′, 6′), 6.66 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3′, 5′) / 116.6 (C-3′, 5′) 의 신호를 통해 para위치에 두개의 hydroxyl group을 갖는 hydroquinone group이 존재함을 확인하였다. HMBC데이터에서 β-D-glucosyl group 의δH 4.71 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1)와 hydroquinone group의 δC 152.3 (C-1′)가 상관 피크를 나타낸 것을 토대로 화합물 1이 arbutin의 유도체임을 예상하였다.
나아가, 화합물 1의 1D NMR 과 HSQC 데이터에서 두 개의 olefinic groups:δH/δC 6.82 (1H, td, J = 1.4, 7.3, 7.3 Hz, H-3″) / 143.7 (C-3″), 6.40 (1H, dd, J = 10.9, 17.7 Hz, H-7″) / 139.7 (C-7″), 두 개의 exomethylene: 5.28 (1H, d, J = 14.3 Hz, H-8″), 5.09 (1H, d, J = 14.3 Hz, H-8″) / 113.9 (C-8″), 5.03 (2H, d, J = 16.2 Hz, H-7″) / 116.9 (C-7″), 두 개의 methylene: 2.43 (2H, dd, J = 7.3, 14.5 Hz, H-4″) / 28.4 (C-4″), 2.37 (2H, dd, J = 6.8, 7.9 Hz, H-5″) / 31.1 (C-5″), 하나의 methyl group: 1.84 (3H, s, H-9″) / 12.6 (C-9″) 신호가 확인되었다. 13C NMR 데이터에서 하나의 carboxyl group: δC 169.4 (C-1″), 두 개의 olefinic quaternary carbons: 146.76 (C-6″) and 128.9 (C-2″) 신호가 확인되었다. 이 신호들은 COSY 데이터에서 H-3″과 H-4″, H-4″과 H-5″, H-7″과 H-8″의 상관 피크를 나타내었으며, HMBC 데이터에서 H-3″과 C-1″, C-9″사이, H-4″과 C-2″, C-3″, C-6″사이, H-5″과 C-3″, C-6″, C-7″, C-10″사이, H-7″과 C-5″, C-6″, C-10″사이, H-8″과 C-6″, C-7″사이, H-9″과 C-1″, C-2″ 사이, H-10″과 C-5″, C-7″사이의 상관피크를 나타내었다. 이를 토대로 화합물 1 이 2-methyl-6-methylene-2,7-octadienoyl group을 포함하는 것을 예상하였다.
마지막으로, HMBC 데이터에서 arbutin 분자의 H-6과 monoterpene 분자의 C-1″사이의 상관피크를 확인함으로써 화합물 1은 6-O-(2-methyl-6-methylene-2,7-octadienoyl)-arbutin 으로 결정되었다.
화합물 2는 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 437.1834 [M-H]- calcd for 437.1812)측정값을 통해 분자식 C22H30O9 로 결정되었다.
1D 및 2D NMR 데이터는 glucopyranosyl group의 C-6에 결합된 monoterpene 부분을 제외하고는 화합물 1과 유사한 패턴을 보여주었다. 1D NMR 과 HSQC 데이터에서 두 개의 olefinic groups: δH/δC 6.79 (1H, td, J = 1.4, 7.3 Hz, H-3″) / 143.7 (C-3″), 5.39 (1H, t, J = 6.1 Hz, H-7″) / 125.7 (C-7″), 하나의 oxymethylene: 4.08 (2H, d, J = 6.7 Hz, H-8″) / 59.4 (C-8″), 두 개의 methylene: 2.36 (2H, dd, J = 7.4, 14.9 Hz, H-4″) / 28.0 (C-4″), 2.16 (2H, t, J = 7.6, 7.6 Hz, H-5″) / 39.1 (C-5″), 두 개의 methyl groups 1.85 (3H, s, H-9″) / 12.5 (C-9″), 1.70 (3H, s, H-10″) / 16.2 (C-10″) 신호가 확인되었다. 13C NMR 데이터에서 하나의 carboxyl group: δC 169.4 (C-1″), 두 개의 olefinic quaternary carbons: 138.5 (C-6″), 128.9 (C-2″) 신호가 확인되었다. 이 신호들은 COSY 데이터에서 H-3″과 H-4″, H-4″과 H-5″, H-7″과 H-8″의 상관 피크를 나타내었으며, HMBC 데이터에서 H-5″과 C-3″, C-6″, C-7″, C-10″사이, H-7″과 C-5″, C-10″사이, H-8″과 C-6″, C-7″사이, H-10″과 C-6″, C-7″사이의 상관피크를 나타내었다. 이를 토대로 화합물 2가 2,6-dimethyl-8-hydroxy-2,6-octadienoyl group을 포함하는 것을 예상하였다.
마지막으로, HMBC 데이터에서 arbutin 분자의 H-6과 monoterpene 분자의 C-1″사이의 상관피크를 확인함으로써 화합물 2는 6-O-(2,6-dimethyl-8-hydroxy-2,6-octadienoyl)-arbutin 으로 결정되었다.
화합물 3은 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 451.1975[M-H]- calcd for 451.1968)측정값을 통해 분자식 C23H32O9 로 결정되었다.
1D 및 2D NMR 데이터는 C-8″의 hydroxyl group이 methoxy group으로 치환된 것을 제외하고는 화합물 2와 유사한 패턴을 보여주었다. 화합물 2에 비하여 C-6″ (δC 140.8, +2.3 ppm), C-7″ (δC 122.6, -3.1 ppm), C-8″ (δC 69.7, +10.3 ppm)의 chemical shift값의 유의한 변화가 있었다. HMBC 데이터에서 δH 3.28 (3H, s, H-11″) 과 δC 69.7 (C-8″)의 상관피크를 확인함으로써 C-8″에 methoxy group이 위치함을 확인했다.
이를 토대로 화합물 3이 2,6-dimethyl-8-methoxy-2,6-octadienoyl group을 포함하는 것을 예상하였다. 따라서, 화합물 3은 6-O-(2,6-dimethyl-8-methoxy-2,6-octadienoyl)-arbutin 으로 결정되었다.
화합물 4는 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 451.1975[M-H]- calcd for 451.1968)측정값을 통해 분자식 C23H32O9 로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 데이터는 C-6″의 hydroxyl group이 methoxy group으로 치환된 것을 제외하고는 화합물 7과 유사한 패턴을 보여주었다. 화합물 7에 비하여 C-5″ (δC 39.2, -2.5 ppm), C-6″ (δC 78.5, +4.8 ppm), C-7″ (δC 144.3, -1.6 ppm), C-8″ (δC 115.8, +3.3 ppm) and C-10″ (δC 21.9, -6.0 ppm)의 chemical shift값의 유의한 변화가 있었다. HMBC 데이터에서 δH 3.17 (3H, s, H-11″) 와 δC 78.5 (C-6″)의 상관피크를 확인함으로써 C-6″에 methoxy group이 위치함을 확인했다. 화합물 4의 methoxy group 절대구조는 화합물 4와 7의 acid hydrolysis에 의해 확인되었다. 이들의 acid hydrolysis 생성물은 TLC 분석에서 동일한 Rf값을 가지며, H NMR 스펙트럼이 일치한다. 이를 토대로 화합물 4가 (6S)-2,6-methyl-6-methoxy-2,7-octadienoyl group을 포함하는 것을 예상하였다. 따라서, 화합물 4는 6-O-[(6S)-2,6-dimethyl-6-methoxy-2,7-octadienoyl]-arbutin 으로 결정되었다.
화합물 5는 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 471.1868[M-H]- calcd for 471.1866)측정값을 통해 분자식 C22H32O11 로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 데이터는 monoterpene의 말단부분을 제외하고는 화합물 7과 유사한 패턴을 보여주었다. 화합물 7에 비하여 C-5″ (δC 38.6, -3.1 ppm), C-7″ (δC 78.2, -67.7 ppm), C-8″ (δC 64.0, -48.5 ppm) and C-10″ (δC 22.1, -5.8 ppm)의 chemical shift값의 유의한 변화가 있었다. 화합물 7과 상이하게, 1D NMR 과 HSQC 데이터에서 하나의 oxymethine: δH/δC 3.50 (1H, dd, J = 3.2, 7.9 Hz, H-7″) / 78.2 (C-7″), 하나의 oxymethylene: 3.55 (1H, m, H-8″), 3.80 (1H, m, H-8″) / 64.0 (C-8″) 신호가 확인되었다. HMBC데이터에서 H-7″과 C-6″, C-8″, C-10″사이, H-8″과 C-7″사이의 상관피크를 나타내었다. 이는 화합물 7 의 C-7″,C-8″double bond가 single bond 로 변경되고, 각각의 C-7″,C-8″자리에 hydroxyl group이 결합된 것을 의미한다.
이를 토대로 화합물 5가 2,6-dimethyl-6,7,8-trihydroxy-2-octenoyl group 을 포함하는 것을 예상하였다. 따라서, 화합물 5는 6-O-(2,6-dimethyl-6,7,8-trihydroxy-2-octenoyl)-arbutin 으로 결정 되었다. 화합물 5의 C-7″,C-8″ hydroxyl group 절대구조는 밝히지 못하였다.
화합물 6은 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 471.1868[M-H]- calcd for 471.1866)측정값을 통해 분자식 C22H32O11 로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 데이터는 화합물 5와 매우 유사한 패턴을 보여주었다. 화합물 5에 비하여 C-4″ (δC 24.0, -0.3 ppm), C-5″ (δC 37.9, -0.7 ppm), C-7″ (δC 78.5, -0.3 ppm), H-8″(δH 3.75, -0.05 ppm) 의 미세한 chemical shift값의 변화를 제외하고는 1D 및 2D NMR 스펙트럼이 일치하였다. 이는 화합물 5와 6이 서로 stereoisomer 관계임을 의미한다.
따라서, 화합물 6은 6-O-(2,6-dimethyl-6,7,8-trihydroxy-2-octenoyl)-arbutin 으로 결정되었다. 화합물 6의 C-7″,C-8″ hydroxyl group 절대구조는 밝히지 못하였다.
화합물 7은 하얀색 무정형 분말로서 얻어졌으며, HRESI-MS (m/z 437.1834 [M-H]- calcd for 437.1812)측정값을 통해 분자식 C22H30O9 로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 데이터는 glucopyranosyl group의 C-6에 결합된 monoterpene 부분을 제외하고는 화합물 1과 유사한 패턴을 보여주었다. 1D NMR 과 HSQC 데이터에서 두 개의 olefinic groups: δH/δC 6.80 (1H, td, J = 1.4, 7.6 Hz, H-3″) / 144.4 (C-3″), 5.93 (1H, ddd, J = 2.9, 10.8, 17.4 Hz, H-7″) / 145.9 (C-7″), 하나의 exomethylene: 5.07 (H, d, J = 14.1 Hz, H-8″), 5.23 (H, d, J = 14.1 Hz, H-8″) / 112.48 (C-8″), 두 개의 methylene: 2.25 (2H, m, H-4″) / 24.6 (C-4″), 1.60 (2H, m, H-5″) / 41.7 (C-5″), 두 개의 methyl groups 1.84 (3H, s, H-9″) / 12.4 (C-9″), 1.29 (3H, s, H-10″) / 27.9 (C-10″) 신호가 확인되었다. 13C NMR 데이터에서 하나의 carboxyl group: δC 169.4 (C-1″), 두 개의 olefinic quaternary carbons: 73.7 (C-6″), 128.5 (C-2″) 신호가 확인되었다. 위의 결과를 참고문헌의 NMR shift값과 비교하여 화합물 7은 Phlebotrichin, 6-O-[(6S)-2,6-dimethyl-6-hydroxy-2,7-octadienoyl]-arbutin 으로 결정되었다.
화합물 8은 갈색 무정형 분말로서 얻어졌으며, ESI-MS (m/z 357.18[M-H]-)측정값을 통해 분자식 C20H22O6 로 결정되었다. 13C NMR 데이터에서 20개의 탄소를 확인했으며 furofuran lignan에 나타나는 non-oxidized furofuran carbon δC 89.2 (C-7), 83.3 (C-7′), 72.0 (C-9), 70.6 (C-9′), 55.7 (C-8), 51.2(C-8′)을 확인하였다. signal 1H NMR 데이터에서 pinoresinol-type lignan의 benzene ring δH 6.89 (2H, t, J = 7.9 Hz, H-2, 2′), 6.84(2H, dd, J = 5.8, 1.7 Hz, H-5, 5′), 6.81(2H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz, H-6, 6′) 신호를 확인했다. 이어서 3.85 (6H, s, H-10, 10′)신호를 확인하여 lignan의 두 benzene ring에 methoxy group이 존재함을 확인하였다.
위의 결과를 참고문헌의 NMR shift값과 비교하여 화합물 8은 (-)-epipinoresinol 으로 결정되었다.
화합물 9는 노란색 분말로서 얻어졌으며, ESI-MS (m/z 537.18[M-H]- )측정값을 통해 분자식 C30H18O10 로 결정되었다. 13C NMR 데이터에서 30개의 탄소를 확인했으며 flavonoid에 나타나는 conjugated carbonyl carbon δC 181.8 (C-4), 182.2 (C-4″)를 확인하였다. signal 1H NMR 데이터에서 전형적인 flavonoid로 예상되는 신호인 δH 6.16 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.44 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8) 신호를 확인했다. 두 doublet peaks는 aromatic ring의 A ring H-6, H-8이다. 이어서, 6.38 (1H, s, H-6″)신호를 확인하여 flavonoid A ring의 H-6위치가 추가로 존재함을 확인하였고, H-6″신호가 singlet인 점과 또 다른 flavonoid A ring의 H-8위치 신호의 부재를 통해 화합물 9가 biflavonoid 인 것을 예상하였다. 6.77 (1H, s, H-3), 6.81(1H, s, H-3″)의 신호는 flavonoid C ring의 H-3위치의 신호이며, 이웃한 위치에 proton이 존재하지 않기 때문에 singlet peak를 나타낸다.
위의 결과를 참고문헌의 NMR shift값과 비교하여 화합물 9는 amentoflavone 으로 결정되었다.
실험1: 덜꿩나무 잎 분획물의 세포독성확인
(1) B16F10, HEP-2, PC3 세포주 배양
B16F10, HEP-2, PC3 암세포주는 KCLB (Korean Cell Line Bank, Seoul, Republic of Korea)에서 분양받았으며 배지는 RPMI 1640 medium (added 1% Penicillin and 10% FBS)과 DMEM medium (added 1% Penicillin and 10% FBS)를 사용하였다 (WELGENE, Republic of Korea). 각 세포주는 5% CO2가 지속적으로 공급되는 배양기에서 온도 조건 37℃ 하에 배양하였다.
(2) 세포독성 확인
B16F10, HEP-2, PC3 세포주를 96 well plate에 5.0 x 103 cells/well로 희석하여 분주한 후 24시간 배양하였다. DMSO에 녹인 덜꿩나무잎 소분획을 최종농도 100νg/mL로 처리하여 72시간 배양한 후 MTT assay를 통해 흡광도 540nm에서 확인하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하였으며 시료당 3반복 실험하였다.
(3) 통계처리
덜꿩나무잎 소분획에 대한 세포독성을 비교하기위해 음성대조군으로 DMSO를 사용하였으며 생존율을 100%로 설정하였다. 시료 처리 후 생존율을 %값으로 계산하여 비교하였다..
(4) 덜꿩나무 잎 분획물의 세포독성 결과
덜꿩나무 잎의 EtOA 분획물 VEE1~VEE8의 세포독성을 확인하고자 시료농도 100νg/mL 로 확인하였고, 세포주로는 B16F10(피부암세포), HEp-2(후두암세포), PC-3(전립선암세포)를 사용하였다. 음성대조군인 DMSO를 통해 세포생존율을 100%로 계산하였으며, 각 분획물 시료를 세 번 반복 처리 후 평균값을 산출하여 비교하였다.
도 4를 참고하면, 피부암세포인 B16F10에서 세포생존율은 각 분획마다 눈에띄는 차이를 보였다. VEE1~3, VEE8에서 세포생존율은 103%~128%로, 세포독성이 존재하지 않음을 확인하였다. 대조적으로 VEE4~7에서는 세포생존율이 19%~22%로 강한 세포독성이 존재하였다.
후두암세포인 HEp-2에서 세포생존율은 B16F10의 세포생존율과 비슷한 경향을 보였다. VEE1~2에서 세포생존율이 각각 112%, 100로, 세포독성이 존재하지않았다. VEE3, VEE8에서는 세포생존율이 각각 86%, 83%로, 매우 약한 세포독성이 존재하였다. VEE4~7에서는 세포생존율이 15%~36%로 강한 세포독성이 존재하였다.
전립선암세포인 PC-3에서 세포생존율은 VEE2를 제외한 모든분획에서 강한 세포독성을 보였다. VEE2에서 세포생존률은 85%로 매우 약한 세포독성이 존재하였지만, 나머지 모든 분획에서는 14%~39%의 세포생존률을 보여 강한 세포독성이 존재함을 확인하였다.
분획물 VEE1~VEE8 에서 상대적으로 극성이 높은 fraction인 VEE1~VEE3에서 비교적 높은 세포생존률을 보였으며, 이 중 모든 세포주에서 높은 생존률을 보이는 VEE2분획물을 분리에 사용하였다. VEE4~VEE7은 실험에사용된 모든 세포주에서 강한 세포독성이 있었다. 해당 분획은 항암활성을 가지는 활성성분 분리에 유용하게 연구될 수 있을것으로 사료된다.
실험2: 덜꿩나무 잎 화합물의 Tyrosinase 활성 저해시험
(1) 시험 방법
시료를 에탄올에 녹여 Tyrosinase 활성 저해를 확인할 수 있는 농도로 설정하였다. 96 well plate에 0.1M 인산염완충액 (pH 6.5) 220νM, 시료액 20νL, Mushroom tyrosinase액 (2000U/mL) 20νL을 순서대로 처리한 후 37℃ 배양기에서 10분간 배양하였다. 이 액에 1.5mM 타이로신액 40νL를 처리하고 37℃에서 15분동안 반응시킨 다음 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 통계 처리
덜꿩나무 잎 소분획과 덜꿩나무 잎에서 분리한 화합물 1-9에대한 tyrosinase 활성저해능을 비교하기위해 음성대조군으로 EtOH, 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다. tyrosinase 활성능력은 아래와 같은 방법으로 계산되었다.
Tyrosinase activity(%): [(A1-A0)/(B1-B0)] ×100
A0은 반응 전 샘플의 흡광도, A1은 반응 후 샘플의 흡광도이다. B0 및 B1은 음성대조군의 반응 전후의 흡광도이다.
(3) 덜꿩나무 잎 화합물의 타이로시나제 활성 저해능력
덜꿩나무 잎의 EtOA 분획물 VEE1~VEE8의 타이로시나제 저해능을 확인하고자 시료농도 0.2mg/mL 로 확인하였다. 효소는 mushroom tyrosinase, 기질은 L-tyrosine을 사용하였고 음성대조군으로 EtOH을, 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다. 음성대조군을 통해 타이로시나제 활성을 100%로 계산하였고, 각 분획물 시료를 세번 반복 처리 후 평균값을 산출하여 비교하였다.
도 5를 참고하면, 양성대조군인 arbutin은 농도 0.2mg/mL에서 타이로시나제 활성을 21%로 감소시켜 강한 타이로시나제 저해능력을 보였다. VEE1 과 VEE2 는 타이로시나제 활성이 각각 29%, 28%로, 양성대조군인 arbutin과 비슷한 저해능력을 보여주었다. VEE3의 타이로시나제 활성은 52%로, 앞선 분획물의 저해능력에 비해 약한 효능이지만 저해능력이 있음을 확인하였다.
VEE4 ~ VEE8 분획물의 경우에는 타이로시나제 활성이 94%~124%의 수치로 저해능력이 없거나 역효과가 있음을 확인했다. 분획물 VEE1~VEE8 에서 상대적으로 극성이 높은 fraction인 VEE1~VEE3에서 비교적 높은 타이로시나제 활성 저해능력을 확인하였다.
이 중 가장 높은 저해능력을 보인 VEE2분획물에서 화합물 1-8을 얻었다.
(4) 덜꿩나무 잎에서 분리한 화합물 1-9의 타이로시나제 활성 저해능력
덜꿩나무 잎에서 분리한 화합물 1-9의 타이로시나제 저해능을 확인하고자 시료농도 200μM 로 확인하였다. 효소는 mushroom tyrosinase, 기질은 L-tyrosine을 사용하였고 음성대조군으로 EtOH을, 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다. 음성대조군을 통해 타이로시나제 활성을 100%로 계산하였고, 각 분획물 시료를 세 번 반복 처리 후 평균값을 산출하여 비교하였다.
도 6을 참고하면, 양성대조군인 arbutin은 농도 200μM 에서 타이로시나제 활성을 30%로 감소시켜 강한 타이로시나제 저해능력을 보였다. 화합물 1-6 및 화합물 9는 타이로시나제 활성이 91%~112%의 수치로 저해능력이 없음을 확인하였다.
화합물 7은 타이로시나제 활성이 75%로, 매우 약한 저해능력이 있음을 확인하였다. 화합물 8의 경우에는 타이로시나제 활성이 27%의 수치로 양성대조군인 arbutin과함께 강한 저해능력을 보여주었다. 화합물 8의 tyrosinase 활성 저해능력의 IC50값은 37.9μM 이다. 화합물1-7의 경우 분자구조내에 arbutin 구조를 포함하고있지만, C-6자리에 결합된 monoterpen에 의해 저해능력이 상실되는 것을 보여주었다.
실험3: 덜꿩나무 잎 추출물의 분획별 화합물 9 함량 비교
(1) 분석용 시료 제조
덜꿩나무 잎 추출물(VET)과 n-Hexane(VEH), EtOAc(VEE), n-BuOH(VEB) 및 수용성(VEW) fraction을 각각 동결 건조한 뒤, 각각 10mg/mL 농도로 용해 시킨 후 0.45μm syringe filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 제조하였다. 용매는 100% MeOH을 사용하였다.
(2) 검량선 시료 제조
화합물 9을 0.02~1mg/mL의 범위에서 5개의 농도를 선택하여 검량선을 작성하였다. 용매는 100% MeOH을 사용하였다.
(3) HPLC-UV 분석 방법
VET, VEH, VEE, VEB, VEW 및 화합물9 에 대한 HPLC mobile phase로 0.1F.A in water(A)와 MeOH(B)을 사용하였으며, B용매 5%를 시작으로 0분에서 10분까지 5%(B), 10분에서 20분까지 20%(B), 20분에서 30분까지 70%(B), 30분에에서 40분까지70%(B)의 gradient condition으로 분석하였다. (flow rate: 1mL/min, column temperature: 30℃, wavelength: 260nm)
(4) 덜꿩나무 잎 추출물의 분획별 화합물 9 함량비교
덜꿩나무 잎 추출물의 EtOAc 분획물에서 다량으로 추출된 화합물 9를 덜꿩나무 잎 total extract (VET)와 n-Hexane(VEH), EtOAc(VEE), n-BuOH(VEB) 및 수용성(VEW) fraction 에서의 함량을 비교하였다.
도 7 및 도 8을 참고하면, 화합물 9는 MeOH : Water 70:30 의 농도구간에서 38.572min 에 용출되었으며, 검출파장은 260nm였다. 화합물 9은 VET에서 7.39mg/g, VEE 에서 31.48mg/g. VEB에서 4.61mg/g의 함량을 보였으며, VEH와 VEW에서는 검출되지 않았다.
화합물 9는 항산화, 항노화, 항염효과가 있는 화합물로 연구되어왔으며, 화장품산업에서 주름 개선 효과를위한 대표적인 천연성분으로 알려져있다. 7.39mg/g의 높은 함량을 가진 덜꿩나무 잎 추출물이 뛰어난 피부개선 소재로 사용될 수 있을것으로 사료된다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식1]
    Figure pat00004
  2. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식2]
    Figure pat00005
  3. 하기 화학식 3로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식3]
    Figure pat00006
  4. 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식4]
    Figure pat00007
  5. 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식5]
    Figure pat00008
  6. 하기 화학식 6로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식6]
    Figure pat00009
  7. 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식7]
    Figure pat00010
  8. 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식8]
    Figure pat00011
  9. 하기 화학식 9로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 이성질체, 또는 이의 수화 물, 또는 이의 용매화물:
    [화학식9]
    Figure pat00012
  10. 상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 화합물은 떨꿩나무 (Viburnum erosum Thunb.) 잎으로부터 추출된 것인 화합물.
  11. 상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 화합물은 타이로시나제 활성 저해능력을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 타이로시나제에 의한 질환은 피부암, 피부침착, 기미, 주근깨 등에서 과다 색소 침착 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  13. 상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 타이로시나제에 의한 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물로서,
    상기 타이로시나제에 의한 질환은 피부암, 피부침착, 기미, 주근깨 등에서 과다 색소 침착 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 건강기능식품 조성물.
  14. 상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물로서,
    상기 피부 미용 개선은 피부 주름 개선 또는 미백제인 것인 화장료 조성물.
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Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2016, 80,2311-2317 *
Photochemistry, 1983, 22, 223-225 *

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