KR102060832B1 - 담자균류균사의 액상배양공정을 이용한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 담자균류균사의 액상배양공정을 이용한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 효율적인 생물전환공정(미생물발효전환)을 통하여 천문동과 대두배아의 효능성분과, 담자균류균사가 생산하는 β-글루칸(glucan)의 생산성을 극대화 할 수 있는 생물전환산물의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 담자균류균사의 액상배양공정을 이용한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 효율적인 생물전환공정(미생물발효전환)을 통하여 천문동과 대두배아의 효능성분과, 담자균류균사가 생산하는 β-글루칸(glucan)의 생산성을 극대화할 수 있는 생물전환산물의 제조방법과 이의 용도에 관한 것이다.
치마버섯(Schizophyllum commune)은 싱어(Singer, R.)의 분류서(The Agaricales in modern taxonomy,1975)에 의하면 분류학상으로 담자균류의 주름버섯목 송이과 치마버섯속에 속하는 균으로, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 (β-1,6- branched-β-1,3-glucan)을 세포외로 생산하는 균주이다. 치마버섯은 야생에서 채취할 수 있으며, 다음과 같은 형태학적 특성이나 분류학적 지표에 의해 확인할 수 있다. 치마버섯의 자실체는 대가 없으며 갓의 측면이 기질에 부착하고 크기가 보통 1.0 내지 3.0cm이며, 모양은 부채형 또는 조개형이며 종으로 주름이 있고 말단은 불규칙하게 갈라지고 미세한 털이 덮혀 있다. 주름살은 백색이지만 성숙하게 되면 담회색 또는 담자갈색을 띠며, 조직은 건조한 경우 수축하고 수분을 흡수하면 회복된다. 포자문은 백색이고 포자는 4~6 X 1.5~2㎛ 크기의 원추형으로 평활하며 흰색을 띠고 있다. 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)은 고목 등에 자생하는 각질의 버섯으로 더 상세한 섭생 및 모양은 한국버섯도감 및 싱어(Singer)의 분류서에 상세히 기재되어 있다.
치마버섯은 거친 식감으로 인해 중국에서만 일부 식용하는 것으로 알려져 있었으나, 본 버섯에 존재하는 β-1,6-분지-β-1,3-글루칸 구조의 '시조필란(Schizophyllan)'이라는 다당체의 생리활성 즉 보습 효과, 항-종양 활성, 마크로파지 자극, 항생(anti-biotic) 활성 등의 면역학적 효과(Shimizu et al. 1992; Komatsu et al. 1973) 등이 알려지면서 이를 이용하여 약품, 화장품 등의 유효기능성분으로서 다양하게 활용되고 있다. 치마버섯으로부터 유래된 시조필란(schizophyllan)은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸이다. 표고버섯(Lentinus edodes), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 상황버섯(Phellinus linteus) 등의 다른 버섯류로부터 생산된 β-글루칸의 분자량이 수십만 ~ 200만인데 비해 치마 버섯 유래 시조필란(schizophyllan)의 분자량은 200만 ~ 500만으로 상당히 크며, 다른 버섯류의 β-글루칸이 불균일한 당 조성과 구조를 갖는데 비하여 분지된 균일하고 특유한 구조를 갖고 있으며, 세포외로 분비되는 안정한 중성 다당류의 특성을 갖고 있다 [참조: Kenichi T., Saimei T. Synthesis of the repeating units of Schizophyllan. 1986].
치마버섯에서 유래한 다당류인 베타 글루칸의 기능이 알려지면서 순수 분리정제에 대해 다양한 접근방법이 시도되고 있다. 치마버섯 유래의 베타 글루칸을 얻기 위한 방법으로 버섯 자실체는 배양 기간이 매우 길며 배양방법에 따라 조성이 균일하지 않을 가능성이 있으며, 고형 배지에 의한 균사체 배양 또한 배양기간이 길고, 균일하게 이루어지지 않으며, 베타 글루칸을 추출할 때 배지성분에 의한 추출의 영향을 배제할 수가 없다. 이에 따라 치마버섯의 생리활성 성분인 베타 글루칸을 단기간에 대량으로 얻기 위한 방법으로 자실체로부터 얻은 균사체를 액체 배양하는 것이다. 버섯균사체를 이용해서 순수한 고농도 베타 글루칸을 효율적으로 얻기 위한 방법으로는 액체 배양에 의한 생성량 증대가 많이 연구되어 왔으며, 특히 세포 외로 생성되는 베타 글루칸에 대한 연구가 상황버섯, 영지 등을 대상으로 활발히 진행되어 왔다.
한편, 천문동(Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.)은 한국, 중국, 일본에서 분포하는 백합과(Liliaceae) 식물로서, 예로부터 건근(덩이뿌리)을 식용 및 약용으로 널리 사용되었으며, 항염증, 이뇨작용, 진해제, 항균, 신경안정, 타액 분비 촉진, 해열 등 다양한 약리작용이 알려져 있다.
이에 따라 진정제 및 안정제와 같은 부가적인 효과와 함께 간염, 피부염, 천식, 당뇨, 뇌질환과 관련된 염증 질환의 치료에 이용되어 왔다. 19종의 아미노산과 다당류(polysaccharides) 뿐만 아니라 20종의 다기능성 화합물(β-sitosterol, daucosterol, n-ethatriacontanoic acid, palmitic acid, 9-heptacosylene, smilagenin, diosgenin, sarsasapogenin-3-O-β-D-glucoside feeding grapes imidacloprid, 5-methoxy methylfurfural, yame sapogenin, diosgenin-3-O-β-D imidacloprid feeding glucose glycosides, aspacochioside D, iso-agatharesinoside 및 seven steroidal saponins)을 함유한다. 또한 apoptosis를 저해하고, rat의 피부로 유도된 염증을 억제하는 효과가 확인되었고, 뼈의 대사와 관련하여 조골세포의 분화를 촉진하고 파골세포 생성을 억제효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
[천문동의 영양성분]
대두(Soybean)는 단백질과 지방이 풍부하고, 필수 아미노산인 라이신을 많이 함유하고 있다. 단백질 20~45%, 지방질 18~22%, 탄수화물 22~29%, 회분 4.5~5%이며, 필수 아미노산인 라이신, 시스틴, 트립토판, 글루타민산 등을 함유하며, 그 중에서도 대두배아(Soybean Embryo)에 가장 많은 이소플라본이 함유(2%)되어 있다. 또한 대두에는 사포닌(saponin)이 많이 함유되어 있어 체내에서의 과산화지질 생성을 방지하고 지질대사에 관여하여 노화, 비만방지에 효과적이며, 대두에 포함된 사포닌은 총 5종(Soyasaponin Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, A1, A2)으로 구성되어 있다.
본 발명에서는 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 효율적인 생물전환공정(미생물발효전환)을 통하여 천문동과 대두배아의 효능성분과 담자균류균사가 생산하는 β-글루칸(glucan)의 생산성을 극대화 할 수 있는 생물전환산물의 제조방법과 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 효율적인 생물전환공정(미생물발효전환)을 통하여 천문동과 대두배아의 효능성분과 담자균류균사가 생산하는 β-글루칸(glucan)의 생산성을 극대화 할 수 있는 생물전환산물의 제조방법과 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은, 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지를 제조하는 단계(단계 a); 및 상기 배양배지에 담자균류균사를 접종하여 배양하는 단계(단계 b)를 포함하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물 제조방법을 제공한다.
상기 담자균류균사는 액상배지에서 배양된 것일 수 있다.
상기 담자균류균사는 정치용 액상 배지에서 5 ~ 7일간 배양 후, 1~3일간 진탕배양하여 수득된 것일 수 있다.
상기 배양배지는 글루코스, 천문동, 대두배아, 질산나트륨, 인산칼륨 및 황산마그네슘을 포함할 수 있다.
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함할 수 있다.
상기 배양은 담자균류균사 5 ~ 15 %(v/v)를 접종하여 수행할 수 있다.
상기 배양은 25~ 35 ℃ 3 ~ 5일간 진탕배양하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 담자균류균사는 치마버섯, 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯 및 눈꽃송이버섯으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 단계 b 이후, 천문동과 대두배아의 생물전환산물, 및 베타글루칸을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 생산할 수 있다.
또한 본 발명은, 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지를 제조하는 단계 및 상기 배양배지에 담자균류균사를 접종하여 배양하는 단계를 포함하여 제조되는 생물전환산물을 제공한다. 상기 생물전환산물은 식품. 건강기능식품, 기능성 화장품, 의약외품 또는 의약품의 원료로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은, 담자균류균사의 액상배양공정을 이용한 생물전환용 산물 제조에 사용되는 생물전환용 배지를 제공한다. 상기 배지는 글루코스, 천문동, 대두배아, 질산나트륨, 인산칼륨 및 황산마그네슘을 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 담자균류균사의 액상배양공정을 통하여 천문동과 대두배아의 생물전환산물(또는 효능성분)과, β-글루칸을 고효율로 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 생물전환산물은 자연 상태에서 기인한 유기물을 활용한 안전성이 높은 소재로서 응용분야가 다양하다. 구체적으로 식품 및 건강기능성 식품(면역 증강 음료, 항염 개선 식품 등), 의료제품(아토피 관련 연고, 항염 및 보습용 피부 패치 등), 화장품 (일반 제품 및 아토피 관련 제품, 탈모 및 미백 등 추가 기능성 제품으로의 응용) 등에 적용될 수 있다.
도 1은 FFD의 회기분석 결과에서 배지성분들이 베타글루칸 생산성 (EPS 값으로 측정)에 미치는 영향과 교호인자의 효과를 나타낸 교호관계 그래프이다(A:대두배아, B:천문동, C:NaNO3, D: KH2PO4).
도 2는 RSM(Response Surface Method) 트라이얼 수(Trial number)에 따른 DCW, EPS, Final pH, Yp/x 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 RSM 실험을 위한 중심합성계획법에 따른 배지요인들이 생산성에 미치는 효과를 3차원 그래프로 도식화 한 것 배지에 따른 영향과 교호작용을 베타글루칸 생산 관점에서 분석한 그래프이다.
도 4는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라 천문동 증가에 따른 배지간의 상호작용과 베타글루칸 생산성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라, 천문동 증가에 따른 총 플라보노이드의 함량 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 5L 배양기에서 수행되는 천문동/대두배아 생물(발효)전환 공정을 나타내는 것이다.
도 7은 천문동 열수추출물(A) 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물(B), 천문동/대두배아가 첨가되지 않은 발효배양물(C), 대조군(D)의 항균 효과를 분석한 디스크 어세이(Disc assay) 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 생물전환공정(미생물발효전환)전후의 아미노산 함량 비교결과를 나타내는 것이다(위에서부터 순서대로 아미노산 대조군, 천문동 열수추출물, 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물).
도 2는 RSM(Response Surface Method) 트라이얼 수(Trial number)에 따른 DCW, EPS, Final pH, Yp/x 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 RSM 실험을 위한 중심합성계획법에 따른 배지요인들이 생산성에 미치는 효과를 3차원 그래프로 도식화 한 것 배지에 따른 영향과 교호작용을 베타글루칸 생산 관점에서 분석한 그래프이다.
도 4는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라 천문동 증가에 따른 배지간의 상호작용과 베타글루칸 생산성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라, 천문동 증가에 따른 총 플라보노이드의 함량 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 5L 배양기에서 수행되는 천문동/대두배아 생물(발효)전환 공정을 나타내는 것이다.
도 7은 천문동 열수추출물(A) 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물(B), 천문동/대두배아가 첨가되지 않은 발효배양물(C), 대조군(D)의 항균 효과를 분석한 디스크 어세이(Disc assay) 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 생물전환공정(미생물발효전환)전후의 아미노산 함량 비교결과를 나타내는 것이다(위에서부터 순서대로 아미노산 대조군, 천문동 열수추출물, 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 발명은 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 효율적인 발효전환공정을 개발하고 천문동과 대두배아의 효능성분과 치마버섯(Schizophyllum commune)이 생산하는 β-글루칸(β-glucan)의 생산성을 극대화 한 복합기능성 소재인 생물(발효)전환산물의 제조에 관한 것이다.
본 발명은, 미생물(Schizophyllum commune)의 생리적 기능을 이용해 물질의 화확적인 변화를 이루는 생물전환시스템을 통해 한방 천연물(천문동 및 대두배아)에 함유된 효능 물질의 독성 완화 및 효능을 개선하는 동시에 생물배양공정을 통해 대사산물을 조절함으로써 미생물이 생산하는 유효성분인 베타글루칸을 고생산할 수 있다는 점에서 종래 기술과 차별화된다.
본 발명에서 사용되는 치마버섯(Schizophyllum commune)은 담자균으로 독성이 전혀 없으며 세포외 바이오폴리머(extracellular biopolymer)인 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸(schizophyllan)을 생산한다. 치마버섯 유래 베타글루칸인 시조필란(schizophyllan)은 비이온성 수용성 다당체로서 평균분자량 2~5 X 106 Da이며 항암능력, 항생력, 성장인자 촉진, 보습력, 콜라겐 생성 촉진, 면역강화 기능이 있다. 시조필란(Schizophyllan) 화학구조는 다음과 같다.
치마버섯은 의약품산업(면역조절제, 항암제, 약품전달물질, 피부염/상처 치료제 등), 화장품산업(보습제, 연화제, 경화제 등) 또는 사료산업(면역강화용 동물사료첨가제 등) 등에 적용될 수 있다.
본 발명에서는 천문동과 대두배아의 효능성분과 β-글루칸(glucan)을 고효율로 생산할 수 있는 생물(미생물발효)전환 배지를 통계학적 방법 및 다양한 조합 실험을 통해 개발하였다.
본 발명의 일 실시예에 따라 최종 개발된 생물전환공정의 경우, 천문동과 대두배아가 첨가되어 있지 않은 대조군(control) 조건에 비해 2~3배 높은 약 20g/L의 베타글루칸 생산성을 보였으며, 단위 세포당 생산성을 나타내는 Yp/x 역시 5배 이상 증가하였다.
동일 농도의 천문동 열수추출물에 비해 총 아미노산 함량은 약1.5배, 16종의 아미노산 중 티로신(Tyrosine) 알라닌(Alanine) 트레오닌(Threonine)은 약 1.3~1.7배, 류신(Leucine) 페닐알라닌(Phenylalanine) 글리신(Glycine)은 대략 2.6~3배 증가하였으며, 특히 메티오닌(Methionine)의 경우 10배로 다른 아미노산에 비해 높은 증가율 보였으며, 총 플라보노이드 함량 또한 눈에 띄게 증가한 것을 확인하였다.
필수아미노산을 축으로 한 이러한 아미노산 함량의 증가는 면역력을 비롯한 모발이나 피부 등의 건강상태 개선뿐만 아니라, 비만이나 알츠하이머 같은 특정 질병 치료에 도움이 되는 기능성 소재로써의 가능성을 확인해주는 결과라 할 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 생물(발효)전환 산물은 식품 및 화장품 뿐 아니라 의약외품 및 의약품의 기능성소재로의 적용이 가능하다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 글루코스 69.6 g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨20 g/ℓ, 인산칼륨 15g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ를 포함하는 생물(발효)전환용 배양배지를 제공할 수 있다.
<실시예> 생물(발효)전화공정을 위한 치마버섯 균사체 액상배양법
(1) 천문동 및 대두배아의 원재료 준비단계
세척 및 절단 작업을 마친 원재료 각각은 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조 작업을 수행한 후 조분쇄 및 미분쇄 공정을 거쳐 각각의 천연물 원재료의 분말화 작업을 하여 준비한다.
(2) 발효전환을 위한 치마버섯 균사체 종균배양 단계
한천 배지(감자전분 4g 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1ℓ)에서 성장한 균사체(큐젠바이오텍에서 개발한 베타글루칸 고생산균주인 Schizophyllum commune QG143-1의 균사체를 이용)를 무균적으로 수거한 후, 이를 정치용 액상 배지(감자전분 4g, 포도당 20g) 28 ℃에서 6일간 배양하였다. 이렇게 배양한 균체를 다시 무균적으로 수거하여 동일 성분의 성장배지에 10%(v/v)가 되게 접종한 후 150rpm으로 교반하여 28 ℃에서 2일간 진탕배양하여 발효전환공정의 종균으로 사용하였다.
생물(발효)전환공정을 위한 본 배양은 종균 10 %(v/v)를 접종하여 28˚C에서 150rpm 4일간 진탕 배양하였다.
(3) 천문동 및 대두배아의 생물(발효)전환공정 개발 단계
생물(발효)전환을 위한 치마버섯 배양배지를 최적화하고자 천문동 및 대두배아를 첨가하여 통계학적인 방법을 바탕으로 최적화조건을 결정하였다. 이를 위해 OFAT(One Factor At a Time) 방법과 Plackett-Burman design에 의한 배지성분 최적화 그리고 완전요지배치법(Full Factorial design,FFD)과 반응표면분석법(Response surface method,RSM)에 의한 배지농도 최적화를 수행하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 OFAT(One Factor At a Time) 방법과 Plackett-Burman 디자인(design) 등을 통하여 천문동과 대두배아의 생물(발효)전환 공정에 필요한 나머지 배양배지 성분인 탄소원(글루코스)과 질소원(질산나트륨) 그리고 무기염류(인산칼륨, 황산마그네슘)를 경제성과 생산성을 고려하여 선택하였다. 이후, 통계적 배지 최적화 방법인 완전 요인 배치법(full factorial design, FFD)과 반응표면분석법(response surface method, RSM)을 통하여 치마버섯을 이용한 천문동/대두배아 발효전환산물의 유효성을 높이는 동시에 약용버섯의 유효성분인 베타글루칸을 고생산할 수 있는 최적의 배지농도를 다음과 같이 결정하였다: 글루코스 69.6g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨 20g/ℓ, 인산칼륨 15g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ.
1. 생물(발효)전환공정을 위한 치마버섯 배양배지 성분조사
천문동/대두배아 발효전환산물의 생산배지 최적화를 위하여 탄소원 4종(Glucose, Maltose, Sucrose, Lactose), 질소원 5종(대두배아, Yeast extract, Soytone, 천문동, NaNO3), 무기염류 2종(KH2PO4, MgSO4)을 포함한 총 12가지의 배지성분의 PBD(Plackett-Burman Design) 실험을 통해 EPS(베타글루칸 생산성), Yp/x, 총 플라보노이드(total flavonoid) 값에 긍정적인 영향을 주는 배지성분을 확인하였으며, 또한 OFAT(One Factor At a Time)방법에 의한 조합 실험을 수행하여 대량생산을 위한 산업용 저가배지에 적절한 배지조합을 확인하였다. 이들 결과를 바탕으로 경제성이 있는 저가 원료인 글루코스(glucose)를 탄소원으로 하여 통계학적 실험방법에 하나인 FFD(Full Factorial Design)법을 이용하여 각 배지성분의 효과와 배지 간의 상호작용을 확인하였다.
2. FFD(Full Factorial Design)를 통한 치마버섯-천문동 생산배지 성분조사
FFD(Full Factorial Design)는 통계적 배지 최적화 방법 중 각 요인(factor)간의 상호작용을 확인할 수 있는 대표적인 실험법으로 배지조성의 변화가 베타글루칸의 생산성과 총 플라보노이드(Total flavonoid)값에 미치는 영향을 체계적으로 분석하였다.
FFD는 요인(factor)과 수준(level)의 세부조합반응(response)과 요인(factor)의 선형모형을 가정한 1차 회귀모형의 해석을 통해 최적조건을 찾아가는 방법으로 n은 수준의 수, k는 요인의 수를 나타내며 실험횟수는 (nk)로 결정된다. 본 발명의 일 실시예에서는 (-1)low level과 (+1)high level 2가지 수준으로 가지고 대두배아, 천문동, NaNO3, KH2PO4 4가지의 인자(factor)로 (2k)trials (실험 횟수), 즉 16(24)+2(center point)실험을 수행하였다.
ANOVA 분석을 수행한 결과는 P 값(value)이 <0.0001로 매우 신뢰할 수 있는 수준의 결과로 이는 실험 결과가 99.999이상 정확하다는 것을 의미한다(표1).
[표 1]
FFD 회귀분산 분석결과에서 배지성분들이 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정) 에 미치는 영향과 교호인자의 효과를 나타낸 교호관계 그래프(interaction graph, 도 1)를 보면 천문동과 대두배아의 첨가농도와 상관없이 NaNO3의 첨가 농도를 높일수록 생산성이 증가되며, 천문동과 대두배아의 농도가 일정 할 때 NaNO3와 KH2PO4의 첨가량이 높을수록 생산성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
표 2를 통해 NaNO3와 KH2PO4가 모두 낮은 수준으로 첨가된 1~4번 조합과 NaNO3와 KH2PO4가 모두 높은 수준으로 첨가된 13~16번 조합을 살펴보면 1~4번 조합은 pH 4.39~4.52, 베타글루칸 생산성은 10.4~11.75g/L을 13~16번 조합에서는 pH 3.99~4.23, 17.89~20.35g/L의 베타글루칸 생산성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. NaNO3와 KH2PO4 두 성분 모두 pH 완충기능이 있는 배지 성분으로 천연물유래 원료인 천문동과 대두배아 첨가 시 나타나는 pH 변화의 조절이 베타글루칸 생산성에 매우 밀접하게 영향을 주는 것으로 판단된다. 이는 앞서 제시한 교호관계 그래프 (interaction graph) 결과에서 나타난 경향성과 일맥상통하는 결과라 할 수 있다.
[표 2]
이러한 결과를 통해 배지 성분으로 첨가된 천문동에 의해 감소된 pH를 NaNO3와 KH2PO4가 보정해주는 중요한 인자(factor)임을 확인하였고, 이에 따라 NaNO3와 KH2PO4의 농도조절 및 발효전환 산물의 유효성분을 증가시킬 수 있는 생물(발효)전환용 배지농도 최적화를 위해 RSM(Response Surface Method)을 수행하였다.
이에 따라 RSM은 NaNO3와 KH2PO4가 높은 수준(high level)인 20g/L로 첨가된 13~16번 조합 중 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정)이 20.35g/L, Yp/x 값이 2.84로 가장 높게 나타난 16번 조합을 센터 포인트(center point)로 설정하여 수행하였다.
3. RSM(Response Surface Method)을 통한 치마버섯-천문동 생산배지 최적화
RSM(반응표면분석법)은 여러 가지 실험 인자들, 즉 독립변수(배지성분)의 상호 작용에 따른 종속변수(EPS 생산성)의 변화에 대하여 최대반응치를 나타내는 최적조건(최적배지농도)을 찾아내기 위해 이용되는 통계적인 분석방법이다. RSM을 통해 신속하게 최적조건을 결정할 수 있으며 여러 조건에서 상호작용 파악이 가능하다. 또한 소규모의 실험으로 실험하지 않은 부분에서의 최적 지점도 예측 가능한 장점을 가지고 있다.
반응표면분석법은 반응에 대한 요인 수준의 최적조건을 찾을 때 비선형모형을 가정한 2차 회귀모형의 최적 조건 해석 즉 독립변수(배지성분)의 상호 작용에 따른 종속변수(EPS 생산성)의 변화에 대하여 최대 반응치를 나타내는 최적조건(최적배지농도)을 찾아내기 위해 이용되는 통계적인 분석방법이다. 이러한 RSM은 소규모의 실험으로 실험하지 않은 부분에서의 최적 지점도 예측을 통해 신속하게 최적조건을 결정할 수 있으며 여러 조건에서 상호작용 파악이 가능하다는 장점을 가지고 있으며, 실험디자인에 따라 박스-벤켄계획법(Box-Behnken Design)과 요인배치법(Factorial Design)의 요인실험점에 중심점과 축점의 실험점을 추가한 중심합성계획법(central composite design)으로 세분화 된다.
본 연구진은 반응표면분석법을 용이하게 하기 위한 실험계획법으로 2K요인 실험에 중심점 (center points)과 축점 (axial points)을 추가시킨 중심합성계획법 (central composite design)(CCD)을 사용하였다. 중심합성계획법에서는 중심점 (n0)의 수는 제한이 없으며(본연구에서는 4개의 중점사용), 축점 (α)의 수는 2k로서 본 실험에서는 4가지의 배지 성분 농도를 조사하고자 하였기 때문에 총 8개의 축점 실험을 수행하였다. 총 실험횟수는 2K+2k+n0 =24+2*4+n0 가 되므로 28개의 선정된 조건에서 실험을 실시하였다.
중심합성계획법에 의거해 얻은 결과는 Design-Expert 6.0 program을 이용해 통계적으로 분석하여 회귀방정식을 얻음으로써 각각의 배지성분들에 대한 상호 영향을 검토하고 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정)을 위한 최적 배양 조건을 구하였다. 이 때 전체 모델(model)에 대한 유의성은 ANOVA 분석 시 주어지는 P값에 의해 결정되며, 일반적으로 P<0.05일 때 그 유의성이 인정된다. 최적배양 조건, 생물(발효)전환 배지의 최적 농도는 2차 다항식의 f 값이 최대로 되는 지점을 3차원 반응표면도와 컨투어 플롯(contour plot)을 이용하여 분석하였다.
그 결과 P값이 0.0001인 유의한 결과를 얻을 수 있었으며 각 배지 성분의 영향과 교호작용까지 설명해주는 2차 다항식을 얻을 수 있었다(표3).
[표 3]
[표 4]
실험결과, NaNO3가 높은 수준(high level)으로 첨가된 13~16번 조합에서 높은 생산성을 확인할 수 있었으며, 그 중 15번 조합의 EPS 함량이 25g/L로 가장 높았으며, 14번 조합에서의 Yp/x값이 3.97로 높았다. 전체적으로 총 플라보노이드(Total flavonoid)는 천문동이 첨가되지 않은 대조군(control) 배지에 비해 천문동을 첨가한 배지에서 높은 것으로 나타났다.
2차 다항식을 통해 확인한 그래프를 통해 배지에 따른 영향과 교호작용을 베타글루칸 생산 (EPS 값으로 측정)관점에서 살펴보면, 대두배아와 천문동은 반비례적으로 상호작용하며 생산성에 영향 주었으며, KH2PO4와 NaNO3의 농도가 높은 수준을 유지할 때 대두배아의 첨가량이 낮을수록 생산성이 증가되었다. 또한 앞서 수행한 결과와 마찬가지로 천문동과 NaNO3는 서로 매우 밀접하게 상호작용하며 직접적으로 생산성에 큰 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.
천문동과 NaNO3 컨투어 플롯(contour plot)을 보면 NaNO3가 중심 포인트 보다 낮은 농도에서는 천문동 농도에 매우 민감하게 영향을 받아 곡선 간격이 매우 좁았지만 20g/L이상의 농도에서는 천문동과의 상호작용이 낮아지고 생산성에도 영향을 적게 주는 것으로 확인 되었다. 이를 통해 질소원이면서 pH 완충작용을 하는 NaNO3의 최적 농도가 0과 -1 사이의 자리할 것으로 예측되며 반응표면도의 최대 곡면이 천문동 -2에서 +2까지 넓은 탄원을 나타내는 것으로 보아 천문동의 농도 증가에 따른 생산성을 확인해 볼 필요가 있을 것으로 판단된다.
따라서 최대 농도가 20g/L인 NaNO3의 3가지 조건과 천문동을 고농도로 첨가한 OFAT(One Factor At a Time) 조합 실험을 통해 천문동 증가에 따른 배지간의 상호작용과 생산성을 확인 해 보았다.
천문동 17, 47, 77, 107, 137g/L와 NaNO3 10, 15, 20g/L를 조합으로 계획했으며, 나머지 배지 성분은 Glucose 69.6g/L, KH2PO4 15g/L, MgSO4 2g/L로 고정하여 수행하였다. 그 결과 NaNO3가 20g/L 첨가된 trial에서 높은 베타글루칸 생산성을 보였으며, 천문동의 첨가량이 증가할수록 총플라보노이드 함량도 증가하는 경향을 보였다. 특히, 생물(발효)전환 공정을 수행하기 전 추출물의 총플라노이드 함량에 비해 생물(발효)전환 산물의 총플라보노이드 함량이 매우 증가하였다.
[표 5]
베타글루칸의 생산성이 가장 높았던 6번, 9번 중 총 플라보노이드 함량이 0.75로 비교적 높았던 9번 조합을 결정하여 발효기에서의 생산성과 생물(발효)전환 공정 전후의 아미노산 함량 변화 및 항균효과 등을 비교하여 최적화된 조건에서의 생물(발효)전환산물의 유효성 여부를 확인하였다.
본 연구진은 이러한 과정을 통해 천문동/대두배아 생물(발효)전환을 위한 배양기내 배양특성 연구 및 공정 전후 물질을 비교, 분석을 할 수 있었으며, 생물(발효)전환산물인 개발소재의 우수성을 확인하였다.
5L 배양기에서의 천문동/대두배아 생물(발효)전환 공정을 수행하기 위하여 (주)큐젠바이오텍에서 개발한 베타글루칸 고생산균주인 Schizophyllum commune QG143-1의 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth)배지에서 성장배양시킨 후 본 발명의 일 실시예에서 제공하는 생물(발효)전환용 배양배지(글루코스 69.6 g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨 20 g/L, 인산칼륨 15 g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ)가 포함된 생물배양기에 접종하였다. 생물배양기의 70%인 3.5L를 조업부피로 하여 교반속도(agitation speed) 150rpm, 가스 퍼징 속도(gas purging rate) 1vvm을 유지하며 28℃에서 4일간 배양하였다(도 6).
그 결과 대조군(control) 조건에 비해 2~3배 높은 재현성 있는 베타글루칸 생산성을 확인할 수 있었으며, 단위 세포당 생산수율을 나타내는 Yp/x 값은 2.04, 총 플라보노이드 함량은 0.94g/L로 배양 전에 비해 약 36배 증가하였다. 천문동/대두배아의 생물(발효)전환 산물의 이러한 결과는 다양한 유효성 평가 실험에서도 확인할 수 있었다.
또한 기존 추출물(열수 추출물)과 대조군에 비해 탁월한 항균 효과가 있음을 대장균과 포도상구균의 디스크 어세이(Disc assay)실험을 통해 확인할 수 있었다(도 7).
아미노산 분석결과 16종의 1차 아미노산을 기준으로 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물의 총 아미노산 함량이 기존 추출물에 비해 약1.5배 증가하였으며, 티로신(Tyrosine), 알라닌(Alanine), 트레오닌(Threonine)은 약 1.3~1.7배, 류신(Leucine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 글리신(Glycine) 대략 2.6~3배 증가하였다. 또한 메티오닌(Methionine)의 경우 그 증가률이 10배 정도로 다른 아미노산에 비해 탁월하였다(표 6, 표 7, 도 8).
[표 6]
아미노산 분석조건/아미노산 분석을 위한 유도체화 시약 및 방법
[표7]
아미노산 표준물질 및 실험 시료의 아미노산 함량 분석 결과
Claims (13)
- 천문동 분말 및 대두배아 분말을 포함하는 배양배지를 제조하는 단계(단계 a); 및
상기 배양배지에 치마버섯을 접종하여 배양하는 단계(단계 b)를 포함하고,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 분말 72 ~ 82 중량부, 대두배아 분말 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 치마버섯은 액상배지에서 배양된 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 치마버섯은 정치용 액상 배지에서 5 ~ 7일간 배양 후, 1~3일간 진탕배양하여 수득된 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 배양은 치마버섯 5 ~ 15 %(v/v)를 접종하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 배양은 25 ~ 35 ℃ 3 ~ 5일간 진탕배양하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 방법은 상기 단계 b 이후, 천문동과 대두배아의 생물전환산물, 및 베타글루칸을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 방법은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드 생산하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물의 제조방법.
- 천문동 분말 및 대두배아 분말을 포함하는 배양배지를 제조하는 단계 및 상기 배양배지에 치마버섯을 접종하여 배양하는 단계를 포함하여 제조되는 생물전환산물로서,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 분말 72 ~ 82 중량부, 대두배아 분말 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함하며,
상기 생물전환산물은 식품, 건강기능식품, 기능성 화장품, 의약외품 또는 의약품의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 생물전환산물.
- 치마버섯의 액상배양공정을 이용한 생물전환용 산물 제조에 사용되는 생물전환용 배지로서,
상기 배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 분말 72 ~ 82 중량부, 대두배아 분말 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 천문동 및 대두 배아의 생물전환용 배지. - 삭제
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