KR101214872B1

KR101214872B1 - 버섯균사체 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101214872B1
Application number: KR1020100056648A
Authority: KR
Inventors: 김윤정; 손지현; 이현상
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2010-06-15
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2012-12-24
Also published as: KR20110136558A

Abstract

본 발명은 버섯균사체, 구체적으로는 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체를 배지에 접종하여 배양한 버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의하여 제조되는 버섯 균사체 배양액 함유 화장료조성물은 콜레스테롤 생합성 촉진 및 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현 촉진을 통하여 우수한 주름 개선, 보습 및 피부재생 효능을 나타낸다.

Description

버섯균사체 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Mycelial Culture Broth of Mushrooms}

본 발명은 버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍국, 동충하초, 꽃송이버섯의 균사체를 배지에 접종하여 배양한 버섯 균사체 배양액을 유효성분으로 함유하여 피부주름을 개선하며, 보습 및 피부재생촉진 등의 활성을 가지는 화장료조성물에 관한 것이다.

인간은 성과 나이를 떠나서 청결, 미용, 피부 관리를 위해 화장품을 사용하고 있으며 더 나아가서는 아름다움을 표현하기위해 화장품을 이용하여 피부에 변화를 주고 있다. 따라서 화장품의 기능은 점차적으로 향상되고 있으며 산업이 발전함에 따라 화장품이 고급스러워지며 다양해져가고 있다. 화장품 산업이 커져가면서 인간에게 해롭지 않은 안전한 물질을 사용하고자 하였으며 특히, 천연물과 약용식물을 포함한 천연소재가 개발되고 있다.

인간은 오래 전부터 버섯을 음식뿐 아니라 항생제, 비타민, 항암제 등의 다양한 분야에 사용하고 있으며 버섯의 우수한 효능은 화장품에도 적용되고 있다. 버섯 유래 다당류의 β-글루칸은 피부 화상 및 상처 치유에 필수적인 피부 세포 성장인자의 생성을 촉진해주며 피부세포 성장 인자는 콜라겐의 생합성을 촉진하여 피부재생 능력을 증가시킨다는 것이 입증되었다. 또한, 피부의 수분 보유능이 좋고, 피부의 탄력성을 유지 시켜주는 역할까지 하는 것으로 알려져 있다. 대한민국 특허출원 1999-4497호에는 치마버섯(Schizophyllum commune) 다당체인 베타-1,6-분지 베타-1,3-글루칸을 함유하는 보습화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 2003-73323호에는 차가버섯(Inonotus obliquus) 추출물을 함유하는 주름개선 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 2001-10171호에는 상황버섯(Phellinus linteus) 추출물을 함유하는 미백화장료가 개시되어 있다. 그 외에 대한민국 특허출원 2003-24042호에는 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceus) 자실체 추출물을 함유하는 피부노화 방지 및 미백, 피부손상완화용 외용제 조성물이, 10-2008-0090160에는 망목주름담홍버섯 액체배양 추출물을 함유하는 주름개선 화장료 조성물이 개시되어 있다.

그러나 자실체의 경우 배양 조건 및 서식지에 따라 그 성분이 변화하기 때문에 실제 산업화하기 위해서는 가능한 배양조건 및 생산량, 그리고 효능을 일정하게 조절할 수 있는 액체상태의 균사체 배양을 통해 주름을 억제할 수 있는 물질을 개발할 필요성이 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 통상적으로 알려진 버섯 이외에 국내에서 자생하고 있는 다양한 버섯류를 활용하여 산업화 가능한 물질을 탐색하던 중에 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯 균사체를 특정배지에서 혼합배양하는 경우에 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체를 배지에 접종하여 배양한 버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 버섯 균사체 배양액의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체 배양액을 화장료조성물 전 중량에 대하여 0.01~30중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 균사체 배양액은 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 혼합 균사체를 말토우스 1 내지 3 중량%, 펩톤 0.5 내지 2 중량%, 염화칼슘 0.01 내지 1 중량%, 염화마그네슘 1 내지 3 중량%, 염화철 0.1 내지 0.5 중량%, 시트릭엑시드 0.1 내지 0.5 중량%, 황산망간 0.005 내지 0.2 중량%, 황산아연 0.05 내지 0.2 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 인산일수소나트륨 5 내지 10 중량%, 황산나트륨 0.5 내지 2 중량%를 함유하는 액체배지에서 배양하여 얻어진 것임을 특징으로 한다.

상기 홍국, 동충하초 및 꽃송이 버섯의 균사체는 1:1~2:1~2의 중량 비율로 첨가되어 혼합 배양되는 것이며, 바람직하게는 1:1:1의 비율로 혼합 배양되는 것이다. 상기 전체 균사체는 20~40 %(v/v)로 액체 배지에 접종되어 혼합 배양 되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 콜라겐의 생합성을 촉진하여 주름을 개선하고, 피부 내에서 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현을 촉진하여 보습력을 증가시키며 피부를 재생하는 특징을 가진다.

버섯 균사체 배양액을 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 1:1~2:1~2 중량비의 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯 균사체를 말토우스 1 내지 3 중량%, 펩톤 0.5 내지 2 중량%, 염화칼슘 0.01 내지 1 중량%, 염화마그네슘 1 내지 3 중량%, 염화철 0.1 내지 0.5 중량%, 시트릭엑시드 0.1 내지 0.5 중량%, 황산망간 0.005 내지 0.2 중량%, 황산아연 0.05 내지 0.2 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 인산일수소나트륨 5 내지 10 중량%, 황산나트륨 0.5 내지 2 중량%를 함유하는 액체배지에 접종하는 단계;

pH 5.7~6.0, 온도 25~30℃ 조건에서 7~15일간 배양하는 단계; 및

상기 배양액을 균질화한 후 3000rpm으로 10 내지 15분간 원심분리하는 단계를 포함하는 버섯 균사체 배양액의 제조방법이 제공된다.

홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯의 균사체 배양액을 함유하는 본 발명 화장료 조성물은 콜라겐 생합성을 촉진함으로써 피부 주름을 개선하며, 수분을 보유하는 것으로 잘 알려진 히알루로난(HA)의 생합성을 진행하는 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현을 촉진함으로써 피부 보습력 증진 및 피부재생을 촉진하는 효과를 나타낸다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 탄소원 및 최적 질소원을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 배양 온도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 혼합 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 접종양을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 배양 pH를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 최적 배양 시간을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 균사체 배양액의 세포재생 효과를 나타내는 사진도이다.

본 발명은 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯 균사체 배양액의 콜라겐 생성촉진, 히알루로난 생성효소-3의 발현 증진 효과를 이용한 화장료에 관한 것이다.

균류(fungi)는 효모, 곰팡이, 버섯 등의 진핵 생물을 포함하는 큰 그룹으로 식물, 동물, 박테리아와 구분되어 분류되며 대부분 포자가 발아하여 균사체를 이루고 자실체로 성장하여 버섯의 모습을 갖추며 자실체는 다시 포자를 형성하는 생장과정을 되풀이 한다. 균류는 세포벽에 글루칸(β-1,3-glucan) 뿐 아니라 생체고분자 키틴(biopolymer chitin)을 포함하고 있는데, 식물의 경우 세포벽에 셀룰로즈를 포함하는 반면 균류는 키틴을 포함하고 있어 주요한 차이점 중 하나로 볼 수 있다. 이 중 생물학적으로 버섯이 가장 유사한 종에 속하며 버섯은 영양, 온도, 습도, 광선, 산소, 산도 등 여러 가지 생장조건에 따라서 증식하고 생리적 기능에 따라, 배지나 기주의 표면, 유기물, 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 조직을 형성한다. 버섯은 세포벽이나 세포막 안에 유효성분을 보유하고 있으며 어떠한 경우는 자실체를 형성하면서 유효성분을 세포 외부로 분비하기도 한다. 균류는 관상형 필라멘트(tubular filament) 모양으로 자라는데, 이를 균사(hyphae)라고 하며, 이러한 균사집합체(hyphae mass)를 균사체(mycelium)라고 한다. 기능상으로 볼 때, 균사체는 영양기관, 자실체는 생식기관으로 비유할 수 있고 버섯이라 부르고 있는 것은 자실체이며 균사체는 육안으로 관찰할 수 없다. 영양학적으로 볼 때 균사체는 버섯을 성장시키는 에너지를 깊이 간직하고 있는 만큼 강력한 활성물질로 자실체를 성장시키기 위한 영양소 및 활성물질을 축적하고 있다. 따라서 버섯의 에너지의 핵심은 포자와 균사체에 있다고 볼 수 있다.

동충하초(Cordyceps militaris)는 항산화 및 중성지질 저하 등의 효능을 갖고 피부의 탄력성과 보습 성분을 함유하고 있으며, 홍국(Monascus pilosus)은 항염 효과와 콜레스테롤을 저해하며, 꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 항암과 면역기능을 높여주는데 탁월한 효과를 가지며 높은 함량의 베타 글루칸을 지니고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯 균사체를 일정 비율로 특정조성을 가지는 배지에서 혼합 배양하여 얻어지는 배양액이, 상승작용에 의하여 우수한 피부주름개선, 보습 및 피부재생촉진 등의 효과를 나타낸다는 것을 이용함을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체는 도 3에 도시한 바와 같이 1:1~2:1~2의 비율로 혼합 배양하는 경우에 우수한 효과를 나타내었으며, 1:1:1의 중량비로 혼합 배양하는 경우에 가장 우수한 효과를 나타낸다.

본 발명 버섯 균사체 배양액은 피부 내에서 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 피부주름을 개선하는 작용기전을 가진다. 또한 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현을 증진시킴으로서 피부 보습력을 증가시키는 작용기전을 가진다.

본 발명의 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체 배양액은 다음과 같이 제조할 수 있다. 먼저 상기 버섯 균사체 배양액의 종균으로 접종되는 홍국, 동충하초, 꽃송이버섯의 균사체를 배양한다. 상기 버섯 균사체의 균 증식용 고체 배양은 PDA배지에서 25~32℃, 바람직하게는 27~30℃의 온도 및 pH 5.0~6.0, 바람직하게는 pH 5.7~6.0의 조건에서 5~10일간, 바람직하게는 7~10일간 배양하는 것이 좋다.

얻어진 상기 버섯 균사체들을 종균으로하여 하기와 같이 액체 배양하여 배양액을 얻는다. 상기 종균을 하기의 조성을 가지는 액체배지에 20~40 %(v/v)로 접종하여 배양한다. 상기 접종량에 대한 효과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인되는 바와 같이 20%(v/v)로 접종하는 경우에 가장 우수한 효과를 나타내었다.

상기 버섯 균사체의 액체 배양은 말토우스 1 내지 3 중량%, 펩톤 0.5 내지 2 중량%, 염화칼슘 0.01 내지 1 중량%, 염화마그네슘 1 내지 3 중량%, 염화철 0.1 내지 0.5 중량%, 시트릭엑시드 0.1 내지 0.5 중량%, 황산망간 0.005 내지 0.2 중량%, 황산아연 0.05 내지 0.2 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 인산일수소나트륨 5 내지 10 중량%, 황산나트륨 0.5 내지 2 중량%를 함유하는 배지에서 pH 5.7~6.0, 온도 25~30℃ 조건하에 7~15일간 배양하는 것이 좋다.

상기 배양액을 균질화한 후, 3000rpm으로 10 내지 15분간 원심분리하여 얻은 배양액을 화장료로 이용한다. 상기 버섯 균사체 배양액은 농축되거나 정제되어 사용될 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1~4:균사체 배양액의 제조

홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris), 꽃송이버섯(Sparassis crispa)을 균주로 하여, PDA(Potato Dextrose Agar, DIFCO, USA)평판배지에 계대 배양하여 사용하였으며, 시약은 DIFCO 社의 특급시약을 사용하였다.

화장료용 원료를 위한 최적 배지를 선정하기 위하여, 상기 홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris), 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 및 이들의 동일 중량비의 혼합균사체를 하기의 표 1, 표 2와 같이 CMM 배지를 기준으로 탄소원 및 질소원을 달리하면서 30℃의 온도조건 및 pH 6.0의 조건하에서 8일 동안 배양하였다. 배양 후 3000 rpm 으로 10 내지 15분간 원심분리하여 실험에 사용하였다.

조성	단위
탄소원 (Maltose/glucose/starch/lactose/fluctose)	10 g/L
KNO₃	2 g/L
Trace element^a)	40 ml/L
Salt solution^b)	25 ml/L
Thiamine solution (0.1mg/ml)	1 ml/L
^a)CaCl₂ 2.73 g/L MgCl₂-6H₂O 10.25 g/L FeCl₃-6H₂O 1.33 g/L Citric acid 1.33 g/L MnSO₄ 1.1 g/L ZnSO₄ 1.0 g/L ^b)Ammonium tartrate 20 g/L KH₂PO₄ 40g/L Na₂HPO₄ 90g/L Na₂SO₄ 11.2g/L

조성	단위
Maltose	10 g/L
질소원 (Peptone/yeast/KNO₃/malt extract)	2 g/L
Trace element^a)	40 ml/L
Salt solution^b)	25 ml/L
Thiamine solution (0.1mg/ml)	1 ml/L
^{a), b)}표1과 같음.

균사체 밀도를 육안으로 관찰하고, 후술하는 시험예의 방법에 따라 콜라겐 생합성 시험, 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현을 시험하였다. 탄소원과 질소원을 달리하여 배양한 후, 콜라겐 생합성 및 히알루로난 생성효소-3의 발현을 시험한 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a 및 도 1b에서 확인되는 바와 같이, 홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris), 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 균사체를 탄소원으로는 말토우스(maltose), 질소원으로는 펩톤(peptone)을 사용하는 배지에서 배양하는 경우에, 대체로 가장 우수한 콜라겐 생합성 및 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현결과를 나타내었으며, 상기 버섯 균사체의 혼합균주의 경우에도 말토우스(maltose), 펩톤(peptone)을 함유하는 배지에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 1:버섯 균사체 혼합 배양액의 제조

동일한 중량비의 상기 동충하초(Cordyceps militaris), 홍국(Monascus pilosus), 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 혼합균주를 종균으로 하여 상기 제조예를 통하여 확립된 최적 배지, 즉 하기 표 3과 같은 조성을 가지는 배지(modified CMM)에 상기 혼합 버섯 균사체를 최적배지에 20%(v/v)비율로 접종 배양하여 배양액을 제조하였다.

최적 생장온도조건을 확인하기 위하여 15, 20, 25, 30 및 35℃에서 배양하였으며, 다른 배양조건은 상기 제조예의 배양조건과 동일하게 하였다.

조성	단위
Maltose	10 g/L
Peptone	2 g/L
Trace element^a)	40 ml/L
Salt solution^b)	25 ml/L
Thiamine solution (0.1mg/ml)	1 ml/L
^{a), b)}표 1과 같음.

상기 홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 균주를 배양하여 얻은 각 배양액을 비교예로 하였으며, 온도별 콜라겐 생합성, 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현 시험결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 30℃에서 배양한 버섯 균사체 배양액에 의한 콜라겐 생합성과 HAS-3 발현량이 가장 우수하였으며, 각각의 버섯 균사체 배양액에 비하여 상기 혼합균주 배양액이 더욱 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 2:버섯 균사체 혼합 배양액의 제조

동일 중량비의 상기 동충하초(Cordyceps militaris), 홍국(Monascus pilosus) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 혼합 균주를 상기 실시예 1의 최적 생장배지에서 pH를 달리 하면서(pH5, pH5.5, pH6, pH6.5, pH7) 배양하였다. 다른 배양조건은 상기 실시예 1의 조건과 동일하게 하였다.

상기 홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 균주를 배양하여 얻은 각 배양액을 비교예로 하였으며, pH별 콜라겐 생합성, HAS-3의 발현 시험결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이 pH 5.5에서 배양한 버섯 균사체 배양액에 의한 콜라겐 생합성과 HAS-3 발현량이 가장 우수하였으며, 상기 실시예 2의 혼합균주 배양액이 가장 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 3:버섯 균사체 혼합 배양액의 제조

동일 중량비의 상기 동충하초(Cordyceps militaris), 홍국(Monascus pilosus) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 혼합 균주를 상기 실시예 1의 최적 생장배지에 배양시간을 달리 하면서(5일, 10일, 15일, 20일) 배양하였다. 다른 배양조건은 상기 실시예 1의 조건과 동일하게 하였다.

상기 홍국(Monascus pilosus), 동충하초(Cordyceps militaris) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 균주를 배양하여 얻은 각 배양액을 비교예로 하였으며, 배양시간별 콜라겐 생합성, 히알루로난 생성효소-3의 발현 시험결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이 10일간 배양한 버섯 균사체 배양액에 의한 콜라겐 생합성과 HAS-3 발현량이 가장 우수하였으며, 상기 실시예 3의 혼합균주 배양액이 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 1:콜라겐 생합성 촉진효과시험

각질형성세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 1×10⁶의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예 1~3에서 확립된 최적의 생장조건(30℃, pH 5.5, 10일의 배양기간)에서 배양한 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 및 이들의 동일 중량 혼합균주를 각각 배양한 배양액을 최종 농도가 0.5%가 되도록 DMEM배지에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 Procollagen typeⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않은 세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100(%)

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 세포의 procollagen 발현 량

상기 시험결과 하기의 표 4와 같은 결과를 얻었다.

시료 농도 (㎍/㎖)	procollagen 발현율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	미처리	홍국	동충하초	꽃송이버섯	홍국+동충하초+ 꽃송이버섯
500	15	40	64	71	86

상기 표 4의 결과에서 확인되는 바와 같이, 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 단독으로 적용한 경우보다, 혼합 균주의 배양액을 적용한 경우에 피부 주름에 관련 있는 콜라겐 생합성 촉진효과가 더 높게 나타났다.

시험예 2: Hyaluronan synthase-3의 발현 촉진 효과시험

각질형성세포를 10% FBS를 첨가한 DMDM 배지에 1×10⁶의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예 1~3에서 확립된 최적의 생장조건(30℃, pH 5.5, 10일의 배양기간)에서 배양한 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 및 이들의 동일 중량 혼합균주를 각각 배양한 배양액을 최종 농도가 0.5%가 되도록 DMEM배지에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 상기 시험예 1과 같은 방법으로 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 hyaluronan synthase-3 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 시험 예 1과 같다. 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: GAG GAC TGG TAC CAT CAG AA , R: GCC AGA TTT GTT GAT GGT AGC), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 94도 5분 1cycle/94도 30초/50도 30초/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 hyaluronan synthase-3의 발현율은 아래식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

HAS-3 발현율(%) = B/A × 100(%)

A: 상기 대조군에서의 hyaluronan synthase-3 발현 량

B: 시료 처리 세포의 hyaluronan synthase-3 발현 량

시료 농도 (㎍/㎖)	hyaluronan synthase-3 발현율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	미처리	홍국	동충하초	꽃송이버섯	홍국+동충하초+ 꽃송이버섯
500	13	69	47	66	88

상기 표 5의 결과에서 확인되는 바와 같이, 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 단독으로 적용한 경우보다 혼합 균주의 배양액을 적용한 경우에 피부 보습에 관련 있는 hyaluronan synthase-3 발현 촉진 효과가 더 높게 나타났다.

시험예 3:피부재생 효과시험

각질형성세포를 10% FBS를 첨가한 DMDM 배지에 1×10⁶의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 배양하여 세포에 스크래치를 낸 후 상기 실시예 1~3에서 확립된 최적의 생장조건(30℃, pH 5.5, 10일의 배양기간)에서 배양한 홍국, 동충하초, 꽃송이버섯 균사체의 동일 중량 혼합균주를 배양한 배양액을 최종 농도가 0.5%가 되도록 DMEM배지에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 4시간 간격으로 세포 재생율을 확인하였다. 대조구로는 시료를 처리하지 않은 세포를 사용하였으며, 그 결과를 도 7 및 하기의 표 6에 나타내었다.

시료	피부 재생율 (%)
홍국+동충하초+ 꽃송이버섯 혼합균주 배양액	82
대조구	30

상기 표 6의 결과에서 확인되는 바와 같이, 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 혼합 배양액을 적용하는 경우에 우수한 세포 재생 촉진효과를 나타내었다.

실시예 4:영양크림제조

본 발명의 상기 실시예 1~3에서 확립된 최적의 생장조건(30℃, pH 5.5, 10일의 배양기간)에서 배양한 홍국, 동충하초, 꽃송이버섯 균사체의 동일 중량 혼합균주를 배양한 배양액을 함유하는 화장료의 피부 보습력 증진효과와 피부안전성에 대한 임상시험을 위해 하기 표 7의 조성에 따라 영양 크림을 제조하였다.

본 발명의 버섯 균사체 배양액을 함유하지 않는 영양 크림을 제조하여 비교예 1로 하였다.

성분	중량%
성분	실시예 4	비교예 1
버섯균사체 배양액	5.00	-
글리세린	2.00	2.00
부틸렌글라이콜	5.00	7.50
아라키딜알코올/베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	2.00	2.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	6.00	6.00
마이크로크리스탈린왁스	1.00	1.00
세테아릴알코올	3.00	3.00
미네랄오일	4.00	4.00
카보머	0.15	0.15
트리에탄올아민	0.15	0.15
프로필파라벤	0.05	0.05
부틸파라벤	0.05	0.05
메칠파라벤	0.20	0.20
향	적량	적량
정제수	to 100	to 100

시험예 4:피부보습력 증진 효과

본 발명의 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 함유하는 상기 실시예 4의 화장료 조성물의 피부 보습력 증진 효과를 건강한 25세에서 50세의 여성 20명을 대상으로 측정하였다. 먼저, 두 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예 4, B 그룹에는 비교예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 3개월간 도포하도록 하였다. 3개월 후 피부 보습력 정도를 피험자의 설문 및 보습의 영상 분석을 통해 평가하였다. 피험자의 설문은 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판단하였으며 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

시료	개선없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
실시예 4	1	2	4	3
비교예 1	4	4	1	1

보습의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑 부분을 아라모티에스(ARAMO-TS)를 이용하여 피부표면의 정전용량을 이용해서 수분값을 측정하였으며 실험이 종료된 직후, 눈 밑의 동일 부위를 측정하였다. 영상분석에 의한 피부 보습력 측정 결과는 사용 전과 비교한 수분값에 대한 감소율로 하기의 표 9에 나타내었다.

시료	피부 보습력 증가율 (%)
실시예 4	78
비교예 1	20

상기 표 8, 9로부터, 본 발명 실시예 4의 피부 보습력 증진 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

시험예 5:제형 안정성 시험

본 발명의 홍국, 동충하초, 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다. 화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 4 및 비교예 1을 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리정도를 비교 측정하여 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 이 때 제품 변색 및 변취, 분리정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

0:변화없음 1:극히 조금 분리(변색, 변취)

2:조금 분리(변색, 변취) 3:조금 심하게 분리(변색, 변취)

4:심하게 분리(변색, 변취) 5:극히 심하게 분리(변색, 변취)

구 분	제형의 안정성
	실시예 4		비교예 1
	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	0	0
변취	0	0	0	0
분리	0	0	0	0

상기의 표 10으로 부터 확인되는 바와 같이, 실시예 4 및 비교예 1의 경우에 45℃와 4℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하게 나타났다.

Claims

홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체를 말토우스 1 내지 3 중량%, 펩톤 0.5 내지 2 중량%, 염화칼슘 0.01 내지 1 중량%, 염화마그네슘 1 내지 3 중량%, 염화철 0.1 내지 0.5 중량%, 시트릭엑시드 0.1 내지 0.5 중량%, 황산망간 0.005 내지 0.2 중량%, 황산아연 0.05 내지 0.2 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 인산일수소나트륨 5 내지 10 중량%, 황산나트륨 0.5 내지 2 중량%를 함유하는 액체배지에서 배양하여 얻어진 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯의 혼합 균사체 배양액을 화장료조성물 전 중량에 대하여 0.01~30 중량% 함유하는 화장료조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 홍국, 동충하초 및 꽃송이 버섯의 균사체는 1:1~2:1~2의 중량 비율로 첨가되어 혼합 배양되는 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
제 1항에 있어서, 상기 균사체 배양액은 콜라겐의 생합성을 촉진하고, 히알루로난 생성효소-3(hyaluronan synthase-3)의 발현을 촉진하는 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 적용되는 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
1:1~2:1~2 중량비의 홍국, 동충하초 및 꽃송이버섯 균사체를 말토우스 1 내지 3 중량%, 펩톤 0.5 내지 2 중량%, 염화칼슘 0.01 내지 1 중량%, 염화마그네슘 1 내지 3 중량%, 염화철 0.1 내지 0.5 중량%, 시트릭엑시드 0.1 내지 0.5 중량%, 황산망간 0.005 내지 0.2 중량%, 황산아연 0.05 내지 0.2 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 인산일수소나트륨 5 내지 10 중량%, 황산나트륨 0.5 내지 2 중량%를 함유하는 액체배지에 접종하는 단계;
pH 5.7~6.0, 온도 25~30℃ 조건에서 7~15일간 배양하는 단계; 및
상기 배양액을 균질화한 후 3000 rpm 으로 10 내지 15분간 원심분리 단계를 포함하는 버섯 균사체 배양액의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 버섯 균사체를 20~40%(v/v)로 액체 배지에 접종하여 배양하는 것임을 특징으로 하는 버섯 균사체 배양액의 제조방법.