KR101366472B1 - 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제, 이를 포함하는 식품, 화장료 또는 사료 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두부 순물을 포함하는 배지에서 꽃송이 버섯(Sparassis crispa) 균사체를 배양하여 얻은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에 대한 것이다. 본 발명에 따르면 꽃송이 버섯 균사체 배양시 두부순물을 이용함으로써 항균 활성이 더욱 강화되고, 고온의 열처리에도 항균활성에 변화가 없는 안정적인 천연항균제를 제공할 수 있다.
이에 따라 상기한 본 발명에 따른 천연항균제는 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 등에 함유되어 유용하게 이용될 수 있다.

Description

꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제, 이를 포함하는 식품, 화장료 또는 사료 조성물{Natural Anti-biotics Containing Mycelial Culture Broth of Sparassis crispa, Composition of Food, Cosmetic or Feed Comprising the Same}
본 발명은 식품, 화장품, 사료 등의 산업 분야에서 이용될 수 있는 두부 순물을 포함하는 배지에서 꽃송이 버섯(Sparassis crispa) 균사체를 배양하여 얻은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에 관한 것이다.
최근 국민소득의 증가와 더불어 식생활 수준의 향상으로 식품의 안전성 및 식품첨가물에 대한 소비자의 관심이 크게 증가하였지만, 외식 및 급식의 이용이 증가하면서 이들 식중독균에 의한 발병이 증가하고 있는 실정이다. 식중독은 식중독균주의 직접적인 감염에 다른 위해성 외에도 식중독균과 부패미생물들이 과일, 야채, 곡물과 그 가공 식품 내에 배출하는 위험한 독성대사물질에 의해 질병을 유발하기도 한다. Escherichia coli, Staphylococcus pyogenes, Salmonella, Yersinia, Clostridium sp. 등이 배출하는 엔테로톡신(enterotoxin)은 구토와 설사를 유발하는 위장장애를 일으키는 원인균으로 밝혀지고 있다. 미량의 식중독균은 건강한 사람에게는 건강상의 문제를 야기하지 않지만, 면역 체계가 약한 어린이, 노인, 환자 또는 임산부의 경우에 심각한 위험을 초래할 가능성이 있다. 화학적 합성 보존료는 식품 부패 미생물이나 병원성 미생물의 생장을 억제시키고, 식품의 저장성 향상을 위해 비교적 많은 식품에서 사용되고 있지만 지속적으로 사용할 경우 체내에 축적되어 돌연변이나 심각한 질병 유발 등의 문제가 되고 있어 그 사용이 제한되고 있다. 이에 최근에는 천연물에 존재하는 항균활성 물질이 가공식품의 저장, 유통기간을 증진시키는 목적으로 천연의 항균제제로 사용되고 있다.
버섯 유래 유용 성분으로 생산되는 고분자 다당체 및 베타 글루칸은 널리 알려진 기능성물질로서 버섯 곰팡이의 액체배양을 통한 대량생산으로 식품 및 기능성 소재로 활용이 가능하다. 특히, 버섯 곰팡이의 액체배양은 생물전환기술을 최적화함으로서 단시간에 효과적으로 유용물질을 생산할 수 있어서 경제성이 높다. 따라서 식용, 약용을 포함한 다양한 버섯 곰팡이 배양에 관한 연구, 특히 차별화된 다양한 기능성물질의 생산능이 우수한 종균의 선별 및 이를 이용한 생물전환기술의 최적화기술은 산업적으로 매우 유용하다.
꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 한국, 일본, 중국, 북미, 유럽, 호주 등에 분포하는 식용버섯이다. 자실체는 주로 여름부터 가을까지 살아있는 나무의 뿌리근처 줄기나 그루터기에 뭉쳐서 양배추처럼 발생하며 베타 글루칸(β-glucan)을 다량 함유(건조 자실체 100g당 43.6g 함유, 일본식품분석센터 성분분석 결과)하고 있는 것이 알려지면서 인공재배 및 기능성물질 추출에 관한 연구가 급격히 진행되고 있다. 또한 꽃송이버섯은 sparassol(methyl-2-hydroxy-4 methoxy-6-methyl- benzoate)과 같은 항균성 대사물질(antifungal metabolite)을 생산하는 것으로 알려져 있고, sparassol은 인간의 질병 치료제와 엽병의 방제용으로 연구되고 있다.
순물은 두부 제조시 압착공정에서 나오는 부산물로 전체 물 첨가량의 약 50% 이상 발생되어 대부분 폐수로 방류되면서 처리에 따른 비용이 발생한다. 두부 공장에서 배출되는 순물에는 콩의 불용성 섬유질과 응고된 고분자 단백질 외에 수용성 물질이 포함되어 있고, 두부 응고에 사용되고 남은 소량의 응고제가 포함되어 있다. 순물의 고형분 함량은 2-3% 가량이고, 고형분 중 단백질 등의 질소화합물은 약 16%, 당류는 약 53% 정도이며, 이소플라본(isoflavone), 사포닌(saponin) 및 올리고사카라이드(oligosaccharides) 등의 기능성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 순물에 녹아있는 가용성 물질 중, 대표적인 기능성을 보이는 물질로는 이소플라본과 대두 올리고당을 들 수 있다. 이소플라본은 식물체에 들어있는 색소(anthocyanin)의 한 종류인 페놀(phenol)계 화합물의 배당체로서 암, 골다공증, 만성질환의 예방 및 항산화 효과 등이 있는 것으로 밝혀져 주목받고 있다. 특히, daidzein과 genistein 등의 aglycone 형태는 estrogen hormone과 유사한 구조를 갖고 있으며, 유방암, 전립선암, 대장암 등의 예방과 순환기 질환에 큰 효과가 있다고 보고되고 있다.
국내 대부분의 두부 공장에서 유출되는 순물은 처리과정 중 발생하는 높은 비용 부담 때문에 작은 공장일수록 별 처리 없이 폐수로 방출되고 있는 실정인데, 두부 순물의 BOD와 COD는 각각 20,821ppm 및 19,258ppm이나 된다. 이는 법적 규제치인 60~80 및 70~90ppm을 훨씬 넘는 수치이다. 또한 순물에는 콩에 함유된 수용성 물질이 일부 용해되어 있고 또한 첨가된 응고제의 상당량이 들어있기 때문에 하천의 오염원으로 작용하고 있으며, 방출되는 순물의 양도 상당할 것으로 추정되어 진다. 따라서 순물의 효과적인 이용연구의 필요성은 유효성분의 기능성 소재화 등 고도 활용은 물론, 폐자원의 재활용과 환경보존 측면에서도 매우 중요하다고 할 수 있다.
본 발명에서는 꽃송이 버섯 균사체 배양액의 다양한 생리활성 기능 및 항균활성을 더욱 증진시키고, 다양한 열처리 등에도 안정적인 천연항균제를 제공하고자 연구하고 이를 완성하였다.
본 발명은 꽃송이 버섯 균사체 배양시 두부순물을 이용함으로써 항균 활성이 더욱 강화되고, 고온의 열처리에도 항균활성에 변화가 없는 매우 안정적인 천연항균제를 제공하고자 한다. 본 발명은 또한 상기 천연항균제를 포함하는 식품 조성물을 제공하고자 한다.
이에 본 발명은 바람직한 제1구현예로서, 두부 순물을 포함하는 배지에서 꽃송이 버섯(Sparassis crispa) 균사체를 배양하여 얻은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제를 제공한다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서, 상기 배지는 두부 순물 중량 대비 1 ~ 10중량%의 당을 더 포함할 수 있다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서,두부순물은 탄수화물 0.5~2중량%, 단백질 0.5~2중량%, 칼륨 90mg/100g~110mg/100g을 포함한다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서, 상기 두부순물의 pH는 4~5, 산도는 0.1~0.2%, 당도는 3~4 °Brix이며, 수분함량은 97~98%, 고형분 함량은 3~4%(w/v)일 수 있다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서, 상기 두부순물은 탄수화물 0.5~2중량%, 단백질 0.5~2중량%, 칼륨 90mg/100g~110mg/100g을 포함하고, pH는 4~5, 산도는 0.1~0.2%, 당도는 3~4 °Brix이며, 수분함량은 97~98%, 고형분 함량은 3~4%(w/v)일 수 있다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서, 꽃송이 버섯 균사체 배양액은 꽃송이 버섯 균사체를 배양 온도 20∼35℃, 진탕조건 200∼500 rpm의 배양 조건에서 8 ∼ 15일간 배양하여 얻을 수 있다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에서, 꽃송이 버섯 균사체 배양액은 꽃송이 버섯 균사체 10~25 g/L, 세포외 다당체0.2~1 g/L 및 베타 글루칸(β-glucan) 1~20 g/L를 포함할 수 있다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제는 바실러스 세레우스( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes ), 대장균(E. coli ) 및 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium )에 대하여 항균활성을 나타낸다.
상기 구현예에 의한 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제는 바 실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ) 및 대장균(E. coli ) 에 대한 최소 생육 저해 농도(MIC)가 2.51 ~ 12.55 mg/mL 범위 내이다.
본 발명은 바람직한 제2구현예로서, 상기의 천연항균제를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직한 제3구현예로서, 상기의 천연항균제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직한 제4구현예로서, 상기의 천연항균제를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 천연항균제는 꽃송이 버섯 균사체 배양시 두부순물을 이용함으로써 항균 활성이 더욱 강화되고, 고온의 열처리에도 항균활성에 변화가 없어 매우 안정적이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 꽃송이 버섯 균사 배양액의 항균 활성을 미세 희석법을 이용하여 나타낸 그래프이고,
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 꽃송이 버섯 균사 배양액의 항균 활성을 디스크 확산법을 이용하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제에 관한 것으로, 구체적으로는 꽃송이 버섯 균사체 배양시 두부순물을 이용함으로써 항균 활성이 더욱 강화되고, 고온의 열처리에도 항균활성에 변화가 없는 천연항균제에 대한 것이다.
본 발명의 꽃송이버섯 균사체 배양액은 두부순물을 포함하는 배지에서 꽃송이 버섯 균사체를 배양하여 얻을 수 있다.
상기 두부순물은 탄수화물 0.5~2중량%, 단백질 0.5~2중량%, 칼륨 90mg/100g~110mg/100g 등을 포함한다. 또한, 상기 두부순물의 pH는 4~5, 산도는 0.1~0.2%, 당도는 3~4 °Brix이며, 수분함량은 97~98%, 고형분 함량은 3~4%(w/v)이다.
상기에서, 꽃송이 버섯 균사체를 배양하기 위한 배지는 두부 순물 외에 발효성 당을 배지의 총중량 대비 1 ~ 10중량% 더 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 발효성 당의 구체적인 예로는 글루코오스(glucose), 프룩토오스(fructose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 자일로오스(xylose), 수크로오스(sucrose), 갈락토오스(galactose), 수용성 전분(soluble starch), 당밀 등이 있다.
이외에도, 상기 배지는 꽃송이 버섯 균사체 배양에 통상적으로 이용되는 성분들을 더 포함할 수도 있다.
꽃송이 버섯 균사체는 배양 온도 20∼35℃, 진탕조건 200∼500 rpm의 배양 조건에서 8 ∼ 15일간 배양하는 것이 바람직하다. 이때, 배지에 0.5~2vvm의 공기를 공급하면 더욱 바람직하다.
이와 같은 조건에서 배양한 꽃송이 버섯 균사체 배양액은 꽃송이 버섯 균사체 10~25 g/L, 세포외 다당체 0.2~1 g/L 및 베타글루칸(β-glucan) 1~20 g/L 및 3,000Da 이하의 저분자 항균물질 등을 포함한다.
이러한, 꽃송이 버섯 균사체 배양액은 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes), 대장균(E. coli ) 및 살모넬라 티피뮤리움 ( Salmonella typhimurium ) 등에 대하여 항균활성을 나타낸다.
특히, 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus) 및 대장균(E. coli ) 에 대하여는 최소 생육 저해 농도(MIC)가 2.51 ~ 12.55 mg/mL 정도로 미량으로도 강한 항균활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 꽃송이 버섯 균사체 배양액은 80℃~100℃에서 10~30분간 고온 열처리를 한 후에도 항균활성에 변화가 없어 열적 안정성이 우수하므로, 조리 과정에서 열처리가 필요한 식품 또는 사료 등의 항균 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 꽃송이버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제는 항균 활성이 더욱 강화되어 소량으로도 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 열적 안정성이 우수하다. 이에 따라, 본 발명에 따른 천연항균제는 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 등에 함유되어 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
재료준비
두부순물은 두원식품(Gimcheon, Korea)에서 공급받아 사용하였으며, 실험에 사용되는 Sucrose, Starch, K2HPO4 , MgSO4 , Glucose, Yeast extract는 덕산(Duksan, Ansan, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다. 콩 분말은 천호식품(Daegu, Korea)에서 구입하여 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다.
꽃송이버섯 (Sparassis crispa Wulf. ex Fr)은 농촌진흥청에서 분양받아 Potato Dextrose Agar(PDA; Difco. Co. USA) 평판배지에 접종하고 온도 25℃, pH 5.1±0.2, 암 조건에서 20일 이상 배양하여 종균으로 사용하였다.
꽃송이버섯 균사체 배양액 제조
꽃송이버섯 종균을 취하여 호모게나이저로 균질화(10,000 rpm, 3 min)한 후, 두부순물 3.5 L에 두부 순물 중량에 대하여 2중량%의 glucose를 첨가한 액체배지에 접종하고, 5 L 소형 발효조를 이용하여 배양 온도 25℃, 진탕조건 300 rpm에서 10일간 배양하여 꽃송이버섯 균사체 배양액을 제조하였다.
비교예
두부순물 함유 배지 대신 Sucrose 10.75 g/L, Starch 5.35 g/L, 콩 분말 1.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L 및 MgSO4 0.5 g/L를 혼합한 산업용 배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예와 동일한 방법으로 꽃송이버섯 균사체 배양액을 제조하였다.
실험예
분석방법
1. 꽃송이 버섯 배양액의 이화학적 특성 분석방법
1) pH 및 산도 측정
배양액의 pH는 pH meter(model 420+, Thermo Orion, USA)를 이용하여 측정하였으며, 배양액 10 mL을 취하여 측정하였다. 적정 산도는 pH meter로 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N-NaOH로 적정에 사용된 소비량을 Tartaric acid 또는 Lactic acid 함량(%, v/v)으로 환산하였다.
2) 당도 및 고형분 함량
당도는 전자당도계(POCKET REFRACTOMETER, 0~93 °Brix%)를 이용해 배양액의 당도를 측정하였다. 고형분 함량은 적외선 수분측정기(KETT ELECTRIC LABORATORY, FD-720) 에 의한 건조법으로 측정하여 나타내었다.
3) 균사체 및 다당류 함량 분석
균사체 배양 목적은 높은 수율의 다당체 생산에 있으며 꽃송이버섯 균사체 배양액을 200 mL씩 취해 원심분리(7000 rpm, 20 min)하여 상등액과 균사체로 분리하였다. 분리된 상등액은 70% 알코올 200 mL을 첨가하여 냉장 보관하여 overnight후 침전된 다당류를 확인하고, 다시 원심 분리하여 가라앉은 다당류와 냉장 보관한 균사체를 동결건조한 후 함량을 측정하였다.
4) 베타글루칸 함량 측정
꽃송이버섯 균사체 배양액을 동결건조시킨 분말을 100 mg 정량하여 Megazyme kit (K-BGLU, Megazyme International Ireland Ltd, wicklow, Ireland)를 이용하여 베타글루칸 함량을 측정하였다. 총 글루칸 함량은 시료 100 mg에 37% hydrochloric acid를 1.5 mL 첨가한 후, 30℃에서 45분간 반응시켰다. 반응액에 증류수 10 mL을 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 2 M KOH 10 mL과 200 mM sodium acetate buffer(pH 5.0)을 이용하여 100 mL까지 부피를 조정하였다. 1500 xg에서 10분간 원심분리 한 후 회수한 상등액 중 0.1 mL을 취하여 βglucosidase 0.1 mL을 가하여 40℃에서 60분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 GOPOD 시약 3mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 알파글루칸 함량은 시료 100 mg에 2 M KOH 2 mL을 첨가하여 20분간 냉각상태에서 반응시킨 다음, 1.2 mM sodium acetate buffer(pH 3.8) 8 mL과 Amyloglucosidase(1,630 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 40℃에서 30분간 반응 시켰다. 1,500 xg에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액 중 0.1 mL을 취하고, 여기에 GOPOD 시약 3 mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응하였다. 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총글루칸과 알파글루칸 함량의 차이를 베타글루칸 함량으로 계산하였다.
2. 항균 활성 검색 방법
1) 시료 준비
꽃송이 버섯 균사체 배양액을 원심분리(7000 rpm, 20 min)한 후, 41 Whatman(20-25㎛) 여과지를 이용하여 진공여과하고, 상등액은 진공농축기 (rotary vacuum evaporator, R-3000, Buchi Switzerland)로 55℃, 150 rpm에서 농축한 후 희석하여 사용하였다.
2) 사용 균주 및 배지
본 항균활성 실험에 사용된 균주는 Gram 양성균 4종, Gram 음성균 4종이다. 일반 병원성 세균인 Gram 양성균으로는 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans ), 리스테리아 모노사이토제네스 ( Listeria monocytogenes ), Gram 음성균으로는 대장균(Escherichia coli ), 살모넬라 티피뮤리움 ( Salmonella typhimurium ), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ), 비브리오 파라헤모리티커스( Vibrio parahaemolyticus)를 사용하였다. 각각의 균들을 121℃, 15분간 멸균한 Nutrient Broth(NB; Difco. Co. USA), Tryptic Soy Broth(TSB; Difco. Co. USA), Brain Heart Infusion(BHI; Difco. Co. USA)에 1 백금이를 접종하여 37℃ 항온배양기에서 3회 계대배양 후 0.5 McFarland 표준 탁도 (1.5×108 CFU/mL)로 실험에 사용하였다.
3) 디스크 확산법
각 식중독균의 배양액(O.D.600=0.132) 150 ㎕를 spreader로 Nutrient agar, Tryptic Soy agar, Brain Heart Infusion agar plate의 표면에 균질하게 도말한 후, 멸균된 paper disc(8 mm diameter)에 시료를 50 ㎕를 분주하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 paper disc 주위에 생긴 저해환의 크기를 비교하여 항균활성을 측정하였다.
i) 농축
꽃송이 버섯 배양액과 젖산균을 1 mL 취해 80분간 농축(Centrifugal Vacuum concentrator, VS-802, 주식회사 비전과학)하여 0.5 mL로 만들어 농축 전, 후에 따라 항균활성을 비교 실험하였다.
ii) 열처리
꽃송이 버섯 배양액과 젖산균을 1 mL 취해 85℃에서 15분간 열처리하여 열처리 전, 후에 따라 항균활성을 비교 실험하였다.
iii) 한외여과(Ultrafiltration)
꽃송이 버섯 균사체 배양액을 한외여과 셀(ultrafiltration cell)(Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 이용하여 한외여과하였다. 한외여과 막(Ultrafiltration membrane)은 YM-3(MWCO; 3,000; Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 사용하였고 상기 YM-3으로 꽃송이 버섯 배양액을 분획(fraction)하여 항균활성을 비교 실험하였다.
4) 미세 희석법을 이용한 최소 저해 농도 (MIC)
꽃송이버섯 균사체 배양액을 rotary vacuum evaporator로 농축하여 희석한 것을 본 실험에 사용하였다. 시료액 200 ㎕, 각 식중독균의 배양액(O.D.600=0.132) 200 ㎕을 순차적으로 첨가한 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양한 것을 96-well plate를 이용해 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 탁도를 맞춘 균과 꽃송이버섯 배양액을 농도별로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 균의 생장(turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC로 설정하였다.
실험예 1 : 산업용 배지를 이용한 꽃송이 버섯 균사 배양액의 이화학적 특성
꽃송이 버섯 균사체 배양 3, 5, 7, 9, 11일에 시료를 채취하여 분석한 결과는 표 1에 나타내었다. 산업용 배지에서 11일 배양 후 분석한 결과에서는 pH 3.26으로 산성이었으며, 순물을 이용하여 얻은 배양물의 pH 6.9인 경우보다 매우 낮은 값을 보였다. 배양기간에 따라 pH는 감소하고, 산도가 조금 증가하는 경향이 있었으며, 당도는 배양 일수에 따른 차이가 없다. 균사체 함량은 배양 3일 0.7 g/L, 배양 11일 1.45 g/L이며, 다당체 함량은 배양 3일 0.05 g/L, 배양 11일 0.23 g/L로 약간의 증가를 보였다. 산업용 배지에서 11일 배양한 균사체 함량은 1.45 g/L로 매우 낮았으며, 이는 꽃송이 배양이 산업용 배지에서 생육이 미비한 결과로 판단된다. 산업용 배지를 이용한 꽃송이 균사체배양은 배양액 당도의 감소와 균사체 및 다당체 함량의 증가를 통해서 생물전환이 이루어졌으며, 특히 배양액의 산성화되는 결과를 보였다. 일반적으로 꽃송이 버섯 균사체의 액체배양이 다른 버섯 균사체 배양에 비해서 생육이 느리며, 영양요구 조건이 민감한 것으로 알려져 있다.

 배양기간(Fermentation time)(day)
3 5 7 9 11
pH 4.55±0.02 3.67±0.02 3.45±0.04 3.37±0.02 3.26±0.01
산도(%) 0.04±0.01 0.09±0.01 0.10±0.02 0.10±0.02 0.10±0.01
당도(°Brix) 2.15±0.05 0.7±0.12 0.63±0.05 0.82±0.01 1.0±0.1
균사체 함량(g/L) 0.7±0.07 1.25±0.14 1.2±0.21 1.48±0.11 1.45±0.35
세포외 다당체
함량(g/L)		 0.05±0.01 0.10±0.06 0.18±0.04 0.08±0.04 0.23±0.11
실험예 2 : 순물 배지를 이용한 꽃송이 버섯 균사 배양액의 이화학적 특성
배양에 사용된 순물은 탄수화물 1%, 단백질 1%, 지방 0%이며, 무기질 중에서 특히 K의 함량이 107.9 mg/ 100 g으로 꽃송이버섯 배양에 유리한 배지조성인 것으로 판단된다. 또한 pH 4.7, 산도 0.12%, 당도 3.28 ° Brix로 나타났으며, 수분 함량은 97.71%, 고형분 함량은 3.28%(w/v)로 측정되었다.
따라서 순물에 glucose 2%만을 첨가한 액체배지를 이용하여 배양 온도 25℃, 300 rpm, 10일간 배양한 꽃송이 버섯 균사체 배양액의 이화학적 분석 결과는 표 2와 같다. pH는 6.91로서 중성에 가깝게 나타났으며, 산도 0.05%, 당도 1.84 ° Brix로 나타났다. 순물의 당도가 3.28 ° Brix이며, 배양 전 glucose를 2% 첨가한 것을 고려할 때, 배양 기간 동안 당을 이용하여 균사체가 성장하는 것으로 여겨진다. 배양액의 균사체 함량은 17.76 g/L, 다당류 함량은 0.35 g/L로 측정되었다. 꽃송이버섯 균사체 배양액을 동결건조 하여 Megazyme kit를 이용한 베타글루칸 함량을 측정하였다. 총글루칸에서 알파글루칸 함량의 차이를 계산한 결과, 10.64 (%, w/w)로 나타났다.
측정 인자 꽃송이 버섯 균사체 배양액
pH 6.91±0.1
산도(%) 0.05±0.01
당도(°Brix) 1.84±0.45
균사체 함량(g/L) 17.76±0.63
세포외다당체 함량(g/L) 0.35±0.05
수용성 단백질 함량(mg%) 607.78±28.91
티로신 함량(mg%) 58.45±1.85
환원당 함량(mg%) 300.95±13.62
베타글루칸 함량(%, w/w) 10.64±1.25
실험예 3: 꽃송이 버섯 균사체 배양액의 항균 활성
실험예 3-1: 농축 정도에 따른 항균 활성
실시예의 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 centrifugal vacuum concentrator를 이용하여 20배 농축한 것에 대한 항균효과를 8종의 병원성 세균에 대해 페이퍼 디스크 방법(paper disc method)으로 측정한 결과는 하기 표 3과 같다. 꽃송이 버섯 균사체 배양액에 대해 스트렙토코쿠스 무탄스(Str . mutans ), 녹농균( Ps . aeruginosa ), 비브리오 파라헤모리티커스(V. parahaemolyticus) 균주는 증식이 억제 되지 않는 것으로 나타났다. 생육억제대가 형성된 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes ) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)균주는 꽃송이 버섯 배양액을 농축했을 때, 28 mm이상의 생육저지대를 보여 농축하지 않은 배양액 보다 증식억제 활성이 매우 높았다. 대장균(E.coli)균주에서는 배양액 자체에서는 항균 활성이 약하여 증식이 억제되지 않았지만 농축액에서는 15mm정도의 증식 억제 효과가 나타나 고농도에서 효과적인 것으로 보였다.
Strains (유해 세균) Inhibition zone diameter(mm)
배양액 농축액 배양액
B. cereus 30 16
St . aureus 30 13
Str . mutans ND ND
L. monocytogenes 28 13
E. coli 15 ND
S. typhimurium 30 11
Ps . aeruginosa ND ND
V. parahaemolyticus ND ND
실험예 3-2: 열처리 정도에 따른 항균 활성
버섯 액체 배양액의 항균물질의 열안정성을 평가하기 위해서 고온에서 열처리한 후에 병원성세균에 대한 항균효과를 평가하였다. 항균 활성 물질을 평가하기 위해 순물을 이용한 꽃송이 버섯 배양액을 85℃에서 15분간 열처리하여 항균 효과를 나타낸 결과는 표 4와 같다. 열처리 후 생육억제대가 형성된 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 18 mm, 포도상구균( Staphylococcus aureus)는 19 mm, 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes )는 17 mm, 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium) 균주는 11 mm의 결과가 나타난 것으로, 열처리 전과 비교했을 때, 차이가 없는 것으로 열처리한 꽃송이 버섯 균사체 배양액의 항균 물질이 항균 활성에 영향을 끼치지 않는 것으로 평가되어, 꽃송이 버섯 균사체 배양액이 항균물질은 열에 안정한 것으로 사료된다.
Strains (유해 세균) Inhibition zone diameter (mm)
열처리 무 열처리
B. cereus 18 17
St . aureus 19 18
Str . mutans ND ND
L. monocytogenes 17 18
E. coli ND ND
S. typhimurium 11 12
Ps . aeruginosa ND ND
V. parahaemolyticus ND ND
실험예 3-3: 한외여과에 따른 항균 활성
꽃송이 버섯 균사체 배양액의 항균 활성 물질을 평가하기 위해 한외여과 셀(ultrafiltration cell)을 이용하여 여과한 배양액의 항균 효과는 표 5와 같다. 3000 Da 분자량 이하의 물질을 포함하는 꽃송이 버섯 배양액에 대한 생육억제대가 형성된 것으로서 바실러스 세레우스( Bacillus cereus)는 18 mm, 포도상구균(Staphylococcus aureus)는 16 mm, 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes)는 17 mm로 나타났다. 따라서 바실러스 세레우스( Bacillus cereus), 포도상구균( Staphylococcus aureus ), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes) 균주에 영향을 끼치는 꽃송이 버섯의 항균 물질은 분자량이 3000 Da이하인 것으로 판단된다. 그러나 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium)균주에서는 꽃송이 버섯 배양액에서 13 mm의 생육저지대가 나타났으나, 원심 분리한 시료에서는 나타나지 않은 것으로, 이 균주에 대항하는 꽃송이 버섯의 항균 물질은 3000 Da보다 분자량이 큰 물질이 영향을 주는 것으로 추측된다.
Strains (유해 세균) Inhibition zone diameter (mm)
Control 분자량(3000 Da 이하)
B. cereus 18 18
St . aureus 16 16
Str . mutans ND ND
L. monocytogenes 17 17
E. coli ND ND
S. typhimurium 13 ND
Ps . aeruginosa ND ND
V. parahaemolyticus ND ND
실험예 4: 미세희석법을 이용한 꽃송이 버섯의 항균 활성 및 최소저해농도( MIC ) 측정
항균활성을 측정을 위한 방법 중 하나인 확산(diffusion)법에는 페이퍼 디스크(paper disc) 방법과 아가 웰(agar well) 방법이 있는데 본 실험에는 페이퍼 디스크(paper disc) 방법이 꽃송이 버섯과 젖산균의 항균활성의 측정에 적합한 것으로 조사되어, 페이퍼 디스크(paper disc) 방법에 의한 항균활성을 측정하였다. 그러나 대상물질의 항균활성뿐만 아니라 paper disc 주위로 확산이 어렵다든가 확산의 속도가 다르면, 대상 물질의 페이퍼 디스크 확산(paper disk diffusion) 법으로 측정한 항균활성의 정도가 달라지기 때문에 추가적으로 미세희석법(micro-dilution method)을 이용하여 최소저해농도(MIC)를 확인하고자 하였다.
전 실험에서 8종의 병원성 세균에 대항하여 꽃송이버섯 균사체 배양액의 항균활성을 페이퍼 디스크 방법(paper disc method)으로 측정한 결과, Gram 양성균으로 바실러스 세레우스(B. cereus ), 포도상구균(St . aureus ), 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)에서 저해 환이 나타났으며, Gram 음성균에서는 대장균(E. coli ), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium )에서 항균활성이 나타났다. 따라서 생육저해대가 형성된 5종의 병원성 세균에 대한 꽃송이 버섯 배양액의 항균 활성 검색 실험을 미세희석법으로 수행한 결과를 도 1에 나타내었다. 각 식중독 균주에 대한 꽃송이 버섯 배양액의 최소저해농도는 표 6에 나타내었다. 바실러스 세레우스(B. cereus ), 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes ), 대장균(E. coli)에 대한 꽃송이 버섯 배양액은 최소 생육 저지 농도가 12.55 mg/mL인 것으로 낮은 농도에서 강한 항균활성이 나타났다. Gram 양성균주 중에서는 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대해 가장 큰 항균 활성을 나타내었다. 우리나라 대표적인 식중독균인 포도상구균(St . aureus )와 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)에 대해서는 바실러스 세레우스(B. cereus ) 보다 더 낮은 MIC 값을 보였다.
도 1의 미세희석법 결과에서 꽃송이 버섯 균사체 배양액 농도가 62.75, 125.5 mg/mL 인 경우 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes ), 포도상구균(St . aureus ) 균이 조금 자란 것으로 보이는 것은 흡광도값으로 탁도를 측정하여 실험 결과를 도출함에 있어 고유의 색을 지닌 꽃송이 버섯 균사체 배양액이 고농도인 경우 MIC를 결정하는 탁도에 영향을 미쳤기 때문이라 판단된다. 따라서 항균 효과는 하나의 분석법만으로 결정하기에 무리가 있어, 탁도에 영향을 미치지 않는 페이퍼 디스크 확산(paper disc diffusion) 방법으로 측정하여 꽃송이 버섯의 항균활성의 근거를 확인하였다. 즉, 생육저해대가 형성된 포도상구균(St . aureus ) 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)에 대한 꽃송이 버섯 배양액의 항균 활성 검색 실험을 페이퍼 디스크 확산(paper disc diffusion) 방법으로 수행한 결과를 도 2에 나타내었다.
Strains(유해 세균) 생육저해 최소농도 (MIC, mg/mL)
B. cereus 2.51〈 MIC = 12.55
St . aureus 12.55〈 MIC = 62.75
L. monocytogenes 2.51〈 MIC = 12.55
E. coli 2.51〈 MIC = 12.55
S. typhimurium 62.75〈 MIC = 125.5
항균활성 실험 결과, 본 발명의 꽃송이버섯 균사체 배양액은 Gram 양성균으로는 바실러스 세레우스(B. cereus ), 포도상구균(St . aureus ), 리스테리아 모노사 이토제네스(L. monocytogenes) 균주, Gram 음성균에서는 대장균(E. coli ), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)균주에 대하여 항균활성을 나타내어, 다양한 병원성 세균에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한, 이들 균의 생육을 억제하는 꽃송이버섯 균사체 항균물질은 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium )균주를 제외하고는 분자량이 낮은 저분자량의 물질로 판단된다.
즉, 본 발명에 따른 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제는 저분자 성분을 포함하는 천연항균제로서 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 등의 산업화 용도로 개발이 가능할 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균(E. coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 항균활성을 갖도록 두부 순물을 포함하는 배지에서 꽃송이 버섯(Sparassis crispa) 균사체를 배양하여 얻은 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 두부 순물 중량 대비 1 ~ 10중량%의 당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 두부순물은 탄수화물 0.5~2중량%, 단백질 0.5~2중량%, 칼륨 90mg/100g~110mg/100g을 포함하는 것인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 두부순물의 pH는 4~5, 산도는 0.1~0.2%, 당도는 3~4 °Brix이며, 수분함량은 97~98%, 고형분 함량은 3~4%(w/v)인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 두부순물은 탄수화물 0.5~2중량%, 단백질 0.5~2중량%, 칼륨 90mg/100g~110mg/100g을 포함하고, pH는 4~5, 산도는 0.1~0.2%, 당도는 3~4 °Brix이며, 수분함량은 97~98%, 고형분 함량은 3~4%(w/v)인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  6. 제1항에 있어서,
    꽃송이 버섯 균사체 배양액은 꽃송이 버섯 균사체를 배양 온도 20∼35℃, 진탕조건 200∼500 rpm의 배양 조건에서 8 ∼ 15일간 배양하여 얻은 것인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  7. 제1항에 있어서,
    꽃송이 버섯 균사체 배양액은 꽃송이 버섯 균사체 10~25 g/L, 세포외 다당체0.2~1 g/L 및 베타 글루칸(β-glucan) 1~20 g/L를 포함하는 것인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ), 포도상구균( Staphylococcus aureus ) 및 대장균(E. coli ) 에 대한 최소 생육 저해 농도(MIC)가 2.51 ~ 12.55 mg/mL인 꽃송이 버섯 균사체 배양액을 포함하는 천연항균제.
  10. 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 천연항균제를 포함하는 식품 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 천연항균제를 포함하는 화장료 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 천연항균제를 포함하는 사료 조성물.
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