KR102364556B1 - 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯 및 이의 용도 - Google Patents
항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)와, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물은 액체 및 고체배양을 통해 증식 가능하며, 아스코브르 산과 비교하여 동등한 수준의 우수한 항산화 활성을 나타내므로 화장료 조성물, 식품 조성물 등의 다양한 분야에서 항산화 목적으로 유용하게 이용이 가능하다.
본 발명의 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물은 액체 및 고체배양을 통해 증식 가능하며, 아스코브르 산과 비교하여 동등한 수준의 우수한 항산화 활성을 나타내므로 화장료 조성물, 식품 조성물 등의 다양한 분야에서 항산화 목적으로 유용하게 이용이 가능하다.
Description
본 발명은 구멍장이속 버섯 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯 NIBRFGC000500557 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
균류(Fungi)는 진핵생물로서 곰팡이, 버섯, 효모, 지의류를 포함한다. 분류학적으로 8개의 문(phylum)으로 구성되며 분자생물학적 기술을 바탕으로 추정해 보면, 전 세계적으로 약 250만 종이 지구상에 서식하고 있을 것으로 추측된다.
그러나, 현재까지 실체가 확인된 종은 전체의 6% 미만인 약 14만 종에 불과하다(Hawksworth, 2017). 우리나라에는 대략 2.5만 종의 균류가 서식할 것으로 추정되나, 분자생물학에 기초한 분류학적 연구에 기반하여 추측건대 대략 5만 종 이상이 서식할 수 있을 것으로 생각된다. 현재까지 우리나라에 서식이 보고된 종은 5,616종으로 기존의 서식 추정 종수인 2.5만 종 대비 22.5%만이 실체가 확인되었다. 이러한 현실은 새로운 종 서식에 대한 지속적인 연구의 필요성에 대한 반증이다.
육안으로 관찰이 가능한 자실체를 형성하는 담자균문(Basidiomycota)과 일부 자낭균문(Ascomycota)을 포함하고 있는 고등균류는 산림 생태계에서 양분 순환을 돕는 분해자이자 식물과 공생하며 숲의 다양성 유지에 중요한 역할을 한다. 특히, 목재부후균은 목재와 같은 난분해성 물질들을 분해하는데, 이러한 물질 분해 특성들은 산업활동으로 인해 발생하는 페놀, 염료, 다이옥신 등 오염물질의 분해에도 이용되고 있다(Barr & Aust, 1994). 또한, 최근 동물 복지와 환경 오염에 대한 사람들의 관심이 높아지면서 환경 오염을 줄일 수 있는 대체육의 원재료로써 목재부후균인 덕다리버섯 등이 많은 관심을 받고 있다(Southey, 2019).
또한, 일부 목재부후균(Ganoderma lucidum 등)은 배양시에 인장강도와 인열강도가 높은 균사체를 형성하므로, 이러한 균사체를 이용한 인조가죽 제조에 관한 연구가 진행되고 있다(Jones et al., 2020). 또한, 송이, 송로버섯 등의 부가가치가 높은 식용 버섯들을 포함한 외생균근성 버섯들은 묘목의 생육의 조력자로써 새로운 환경에 정착하는데 도움을 주기 때문에 황폐화된 지역의 조림에도 활용되고 있다(Hawkins et al., 2015).
그리고, 다양한 종의 버섯들이 항바이러스제, 항암제, 항생제, 항정신성 기능을 가지는 천연 화합물을 생성하는 것으로 알려져 있다(El-Mekkawy et al., 1998; Yuen & Gohel, 2005; El Dine et al., 2008; Hetland et al., 2008; Ross et al., 2016; Kombrink et al., 2019).
따라서 버섯은 주요 식량 자원이자 고부가가치 산업에도 다양하게 활용될 수 있으며, 생물자원이 한 국가의 주권으로 통용되는 현재의 ABS 체제 하에서는 균류에 대한 국가적인 연구와 관리의 필요성은 매우 높다고 할 수 있다.
본 발명자들은 국내 자생 균류를 대상으로 신종 및 미기록종 후보의 발굴과 관련된 연구를 지속적으로 진행하였으며, 이 과정에서 상대적으로 기존에 연구가 적게 이뤄진 토양 내 균류 다양성 연구를 위하여 전국을 161개의 격자로 나누고, 이 중 40격자에 대한 토양시료의 이화학적 특성을 분석하였으며, 토양의 균류 종 다양성을 전국단위 규모로 지속적으로 확인하는 작업을 진행하고 있다. 이와 동시에 발굴된 균류의 생리활성을 분석하여 유용성을 검증하고, 생물자원으로서의 활용도를 높이기 위한 인공증식(액체배양, 톱밥배양) 조건 확립 및 유용성 분석을 수행하고 있다.
이러한 과정에서, 본 발명자들은 구멍장이버섯속(Polyporus)에 속하는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주가 액체배양 또는 고체배양을 통해 손쉽게 증식이 가능하고, 항산화 물질로 널리 사용되고 있는 아스코르브 산과 비교하여 동등한 수준의 DPPH 라디칼 소거 활성 또는 ABTS 라디칼 소거 활성을 보유하여, 우수한 항산화 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
삭제
(0003) Kor. J. Mycol. 2020 June, 48(2): 75-85(2020.03.30): 울릉도 수집 균주의 배양조건에 따른 균사 생장 특성 비교
따라서, 본 발명의 주된 목적은 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주를 이용한 항산화 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)를 제공한다.
본 발명의 용어 "작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557(수탁번호: KACC 83044BP)"은 울릉도 나리 분지에서 채집하여 본 발명자들에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 작은노란대구멍장이버섯 균주로서, 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주로 명명하였고, 농촌진흥청 농업유전자원센터(KACC)에 2021년 04월 08일자로 기탁하고, 수탁번호 KACC 83044BP를 부여받았다.
본 발명에서 "작은노란대구멍장이버섯 NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)", "작은노란대구멍장이버섯 NIBRFGC000500557 균주", "NIBRFGC000500557 균주" 또는 "NIBRFGC000500557"은 수탁번호 KACC 83044BP로 기탁된 균주로 서로 동일한 의미로 사용되며, 본 명세서에서는 서로 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명자들은 국내에서 자생하는 여러 균류에서 분리된 배양여액에 대한 항산화 활성 등을 수년간 계속 조사 분석하고 있고, 분석 결과 "폴리포러스 파르보바리우스 NIBRFGC000500557" 균주(수탁번호: KACC 83044BP)가 액체 및 고체배양을 통해 손쉽게 증식 가능하며, 항산화제로 널리 사용되는 아스코르브 산과 비교하여 동등한 수준의 우수한 항산화 활성이 있음을 확인한 바 있다(도 1 내지 도 4 참조).
본 발명의 상기 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)는 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose)로 구성된 배지에서 항산화 물질을 생산하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)의 배지에서 생성된 항산화 물질은 DPPH 라디칼 소거 활성 또는 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP), 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주의 배양 결과 얻어지는 물질로, 배지, 배양되는 균주, 및 배양되는 미생물로부터 분비되는 물질을 모두 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 균체를 배양하기 위해 필요한 영양 공급원, 예를 들어 탄소원, 질소원 등 이외에 무기염 성분, 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 포함되어 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 배양물은 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose) 배지로 구성된 배양 배지에서 배양된 배양물일 수 있다.
또한, 상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP), 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP) 또는 그 배양액은 탁월한 항산화 활성을 나타내므로 항산화용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주와 항산화 활성에 대한 효과는 상기 항산화용 조성물에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주 또는 그 배양액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 구체예로서는 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드크림, 립스틱 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP), 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주는 우수한 항산화 활성을 나타내어 피부 상태 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주와 항산화 활성에 대한 효과는 상기 항산화용 조성물에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP) 배양액 추출물의 분획물, 또는 이의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식물 추출물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 피부에 수분 함유량을 증진시키고, 산화성 프리 라디칼의 생성을 억제 또는 생성된 라디칼을 제거하는 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)의 배양물에 대한 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)를 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose)로 구성된 배양 배지 중에서 선택된 어느 하나의 배지에 접종하는 단계; 및 상기 접종된 균주를 20℃ 내지 30℃에서 7일 내지 60일 동안 배양하여 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 항산화용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 20℃ 내지 30℃의 온도 조건에서 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose) 배지에서 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주를 접종하여 배양하여 생육이 정상적으로 이루어지는 것을 확인한 바 있으며, 상기 균주의 배양액이 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인한 바 있다.
상기 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)의 배양 시 배지는 적당한 탄소원 또는 질소원을 추가로 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 탄소원은 주로 CO2 및 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지는 아미노산, 비타민, 인원, 무기화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)와, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 항산화 활성을 나타내는 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물은 액체 및 고체배양을 통해 증식 가능하며, 아스코브르 산과 비교하여 동등한 수준의 우수한 항산화 활성을 나타낸다.
(3) 또한, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 등의 다양한 분야에서 항산화 목적으로 유용하게 이용이 가능하다.
도 1은 구멍장이속 8종 균주(strain)의 온도별, 배지별 균사 생장(7일차) 양태를 측정하여 나타낸 그래프이다(DYA:Dextrose & yeast extract Agar, MEA:Malt extract Agar, MYA:Malt extract & yeast extract Agar, PDA: Potato dextrose Agar, SDA:Sabouraud dextrose Agar).
도 2는 구멍장이속 5종 균주를 액체배양하고, 균주별 배양액을 비교한 사진이다(A: Polyporus arcularius, B: Polyporus brumalis, C: Polyporus parvovarius, D: Polyporus tuberaster, E: Polyporus ulleungus).
도 3은 Polyporus 속 5종 버섯의 배지 추출물을 시료별로 104㎎/L 농도로 처리하고, DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 Polyporus 속 5종 버섯의 배지 추출물을 시료별로 104㎎/L 농도로 처리하고, ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 구멍장이속 5종 균주를 액체배양하고, 균주별 배양액을 비교한 사진이다(A: Polyporus arcularius, B: Polyporus brumalis, C: Polyporus parvovarius, D: Polyporus tuberaster, E: Polyporus ulleungus).
도 3은 Polyporus 속 5종 버섯의 배지 추출물을 시료별로 104㎎/L 농도로 처리하고, DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 Polyporus 속 5종 버섯의 배지 추출물을 시료별로 104㎎/L 농도로 처리하고, ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 인공증식을 통한 균류 시료 확보
1-1. 구멍장이버섯속 균주 선정
구멍장이버섯속(Polyporus)의 5 종 8 균주를 선정하였다(표 1).
선정된 8종 균주는 구멍장이버섯목(Polyporales), 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하며, 현재 국립생물자원관에서 관리하는 국가생물종목록에는 폴리포러스 파르보바리우스(P. parvovarius)를 포함하여, 17종의 구멍장이버섯속(Polyporus) 균주가 등재되어 있다.
선정된 8 균주 중 폴리포러스 브루말리스(P. brumalis) 균주는 종래 연구에서 테르페노이드(terpenoid) 등 다양한 2차 대사산물을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 폴리포러스 울릉거스(P. ulleungus) 균주는 2017년도 국립생물자원관 발굴과제를 통해 동정한 신종 균주로 추가적인 특성 연구가 필요한 것으로 판단하여 실험 대상 균주로 선정 하였다(Lee et al., 2016; Tibpromma et al., 2017; Lee et al., 2017).
[표 1]
1-2. 선정된 구멍장이버섯속 균주의 인공 증식
연구 대상 종인 구멍장이버섯속 균주의 생육특성과 최적 배양조건을 확인하고, 액체배양을 통하여 인공증식을 진행하였다.
인공증식 대상 5종 8 균주(strain)의 온도별, 배지별 생육특성을 조사하였다. 먼저, 20℃, 25℃, 30℃, 및 35℃의 온조 조건에서 배양하여 균주별 최적 배양온도를 확인하였고, 배지별 생육특성 확인을 위해 DYA(Dextrose & yeast extract Agar), MEA(Malt extract Agar), MYA(Malt extract & yeast extract Agar), PDA(Potato dextrose Agar), 및 SDA(Sabouraud dextrose Agar)의 5종 배지를 사용하여 배양하였다.
[표 2]
각 실험은 3반복으로 진행하였다. 각 배지 위에 5㎜의 cork borer(KA00-49, 고려에이스, Korea)를 이용하여 동일한 크기의 접종원을 한 개씩 올려놓았다. 배양기의 온도는 디지털 온도계로 지속적으로 측정하였고, 배지의 오염 여부는 매일 확인하였다.
3 일차부터 11 일차까지 균사의 지름과 특징을 기록하였으며, 7일차 측정 결과를 바탕으로 균주의 성장에 최적인 온도와 배지를 결정하였다.
Two-way ANOVA 분석 및 그래프 작성은 Prism(GraphPad Software, Ver 7.04, USA)를 이용하였다(김 등, 2018).
7 일차에 측정한 균사의 길이 자료를 바탕으로 구멍장이버섯속(Polyporus) 8 균주(strain)의 최적 온도와 최적 배지 조건을 확인하였다.
실험 결과, [도 1]을 참조하면, 좀벌집구멍장이버섯(Polyporus arcularius)에 속하는 두 균주는 거의 동일한 생장 경향을 보여주었는데, 생육 최적 온도는 25℃부터 35℃ 사이일 것으로 예측되었으며, 해당 온도 범위에서는 접종 후 11 일차에 균사가 플레이트(plate)의 가장자리까지 도달하였다. 배지별로는 SDA 배지를 제외하고 모두 비슷한 수준의 생장을 보였다.
겨울구멍장이버섯(Polyporus brumalis)에 속하는 2종 균주 역시 거의 동일한 생육 경향을 보여주었는데, 7 일차 그래프 상으로는 모든 온도 범위에서 비슷한 수준의 생장을 보이는 것으로 해석할 수 있으나, 30℃와 35℃에서 5 일차에 이미 균사가 플레이트(plate)의 가장자리까지 자라는 것을 관찰할 수 있었으며, 이를 통해 겨울구멍장이버섯의 최적 생육온도는 30℃ 내지 35℃ 사이로 확인되었고, DYA 및 MEA 배지에서 생육 속도가 가장 빠른 것으로 확인되었다.
작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius)과 구멍장이버섯(Polyporus tuberaster)은 실험 가능한 균주를 각각 1주만에 확보한 상태여서 같은 종 내에서 다른 균주(strain)들 사이의 차이는 비교할 수 없었다. 그러나, 좀벌집구멍장이버섯(Polyporus arcularius)이나 겨울구멍장이버섯(Polyporus brumalis)과 비교한 결과 생육 속도가 현저히 느린 것을 확인하였으며, 최적 생육온도는 25℃였고, 20℃ 내지 30℃ 사이에서 생장 가능하며, 35℃에서는 거의 자라지 못하는 것으로 확인되었다. 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius)의 경우 PDA 배지를 제외한 모든 배지에서 비슷한 수준의 생장 속도를 보였고, 구멍장이버섯(Polyporus tuberaster)은 MEA 배지에서 가장 빠른 성장을 보였다.
한편, 울릉구멍장이버섯(Polyporus ulleungus)은 5종 버섯 균주 중 가장 생육 속도가 느렸으며, 35℃에서는 전혀 자라지 못하는 것으로 확인되었다. 울릉구멍장이버섯(Polyporus ulleungus)의 최적 생육온도는 25℃였고, 20℃ 내지 30℃ 사이에서 생장 가능하며, 생육배지는 MYA, MEA, 및 DYA 배지 순으로 빠른 성장을 보이는 것으로 확인되었다.
1-3. 액체배양을 통한 인공증식 및 시료 전처리
상기 생육특성 실험 결과에 기초하여, 종별 생육 속도가 가장 양호한 균주들을 아래 [표 3]과 같이 선택하여 최적 배양조건으로 액체배양을 진행하였다.
[표 3]
균주 접종은 PDA(Potato dextrose agar) 배지에서 활성을 확인한 균주를 코크 보더(cork borer)로 절편화하여 생육특성을 확인한 5종류의 배지 중 SDA 배지를 제외한 4종류의 액체배지에 각각 접종하였고, 최적 온도인 25℃에서 60일간 170rpm으로 진탕 배양(shaking incubation)하였다.
배양이 완료된 액체배양 시료는 멸균 거즈와 Glass filter(Porosity 100~160㎛, DURAN)를 사용하여 균사체와 배양여액으로 분리하고 동결건조처리 후, 추가 분석 전까지 초저온냉동고(-70℃)에 보관하였다.
배양 결과, [도 2]를 참조하면, 배양액 색상은 배지의 종류보다는 종에 따른 차이를 보였으며, 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius)의 배양액이 가장 진한 색상을 보였다. 한편, 배양여액 시료를 동결건조 후 건조량을 비교한 결과, 각 균주의 생육 속도와 반비례하는 것으로 나타났다.
생육 속도가 가장 빠른 좀벌집구멍장이버섯(Polyporus arcularius) 및 겨울구멍장이버섯(Polyporus brumalis)의 건조량이 생육 속도가 가장 느린 울릉구멍장이버섯(Polyporus ulleungus)의 건조량과 비교하여 적은 것을 확인하였으며, 이는 배양속도에 따라 배지 성분을 얼마나 이용하느냐에 따라 달라진 것으로 보인다. 즉, 생육 속도가 빠른 균주들이 소비한 배지 성분이 더 많아, 상대적으로 배양여액의 건조중량이 적은 것으로 나타난 것이다. 배지별로는 PDB 배지에서 배양한 배양여액의 건조량이 대체로 높게 나타났다(표 4 참조).
[표 4]
실시예 2. 항산화 활성 분석
2-1. DPPH 라디칼 소거능
상기 실시예 1-3에서 동결건조한 배양여액을 70% 에탄올로 추출하여 분석 시료로 사용하였으며, DPPH(2.2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co.,USA) 라디칼 소거 활성으로 각 시료의 항산화 활성을 측정하였다(Blois, 1958).
DPPH 화합물은 안정한 프리 라디칼(free radical)로 항산화 활성이 있는 물질과 반응하여 보라색에서 노란색으로 색이 변하는 특징이 있다. 0.2mM의 농도로 에탄올에 녹인 DPPH 화합물과 같은 용매로 녹인 104㎎/L 농도의 시료를 5:1(v/v)의 비율로 혼합하여 암조건에서 30분 정도 반응시킨 후, Microplate reader(SpectraMax190, Molecular devices)를 이용하여 517㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 104㎎/L 농도의 아스코브르산(ascorbic acid)을 사용하였다. 활성 측정은 3회 반복하여 측정하였으며, 활성도는 아래의 [수학식 1]을 기준으로 계산하였다.
[수학식 1]
[도 3]을 참조하면, DPPH assay를 통해 확인한 균주별 배양여액의 항산화 활성 분석 결과, DY 배지에서 배양한 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주의 배양액 시료가 가장 우수한 항산화 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 또한, 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주를 MEB 배지에서 배양한 시료가 그 다음으로 높은 항산화 활성을 나타내었다.
작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주는 4종 배지(DY, MEB, MY, PDB)에서 배양한 배양여액 시료가 모두 양성대조군과 비교하여 50% 이상의 항산화 활성을 나타내었으며, DY 배지 및 MEB 배지에서 배양한 시료는 양성대조군에 근접하는 항산화 활성을 나타내는 것으로 분석되었다.
작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주 이외에 좀벌집구멍장이버섯(Polyporus arcularius), 겨울구멍장이버섯(Polyporus brumalis), 구멍장이버섯(Polyporus tuberaster)의 시료는 대체로 비슷한 수준의 항산화 활성을 보였으며, 울릉구멍장이버섯(Polyporus ulleungus)의 항산화 활성은 현저히 떨어지는 것으로 나타났다.
2-2. ABTS 라디칼 소거능
시그마 알드리치(Sigma-Aldrich) 사의 ABTS 분석 키트를 사용하여 항산화 활성을 측정하였다. ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]는 퍼옥시다아제(peroxidase)나 라카아제(laccase) 효소의 활성을 측정하기 위해서 이용되는 물질로 환원력이 높다. 짙은 청녹색을 띠며 항산화 물질과 반응하면 점차 투명해지는 특징을 갖고 있다(Miller & Rice-Evans, 1997).
상기 실시예 1-3에서 동결건조한 배양여액을 70% 에탄올로 추출하여 분석 시료로 사용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 104㎎/L 농도로 녹인 시료와 미오글로빈을 반응시킨 후, Phosphate-Citrate 버퍼에 녹인 ABTS(Sigma-Aldrich Co., USA) 화합물를 150㎕ 혼합하여 암조건에서 10분 반응 후, Microplate reader(SpectraMax190, Molecular devices)를 이용하여 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 104㎎/L 농도의 아스코브르 산(ascorbic acid)을 사용하였다. 활성 측정은 3회 반복하여 측정하였으며, 활성도는 아래 [수학식 2]를 기준으로 계산하였다.
[수학식 2]
[도 4]를 참조하면, ABTS assay로 확인한 항산화 활성은 DPPH assay와 유사한 경향을 나타내었다.
작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주의 DY와 MEB 배지에서 배양한 배양여액 시료의 항산화 활성은 93%로 나타났으며, 이러한 수치는 양성대조군으로 처리한 아스코브르 산(Ascorbic acid)의 항산화 활성과 비교할 수 있을 만한 수준의 활성이다.
상기 DPPH assay 및 ABTS assay 결과를 통해 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주는 항산화 물질을 자체적으로 생산하는 것을 확인할 수 있었으며, 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) 균주의 배양액은 아스코브르 산(Ascorbic acid)의 항산화 활성과 유사한 수준의 우수한 항산화 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 삭제
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- 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 배양물은 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose)로 구성된 하나 이상의 배양 배지에서 배양된 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물. - 작은노란대구멍장이버섯(Polyporus parvovarius) NIBRFGC000500557 균주(수탁번호: KACC 83044BP)를 ME(Malt extract), DY(Dextrose & yeast extract), MY(Malt extract & yeast extract), PD(Potato dextrose), 및 SDA(Sabouraud dextrose)로 구성된 어느 하나의 배지에 접종하는 단계; 및
상기 접종된 균주를 20℃ 내지 30℃에서 7일 내지 60일 동안 배양하여 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 항산화용 조성물의 제조방법.
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| or. J. Mycol. 2020 June, 48(2), 75-85(2020.03.30) * |
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