KR20150097072A - 자연동굴 조건에서 발효시킨 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

자연동굴 조건에서 발효시킨 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 차가버섯 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 차가버섯 발효 추출물 제조방법은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯을 배양하여 수득함에 따라 상황버섯과 차가버섯 추출물들의 생리활성촉진능을 향상시킬 수 있으며, 차가버섯의 다양한 생리활성물질들을 생물전환(Biotransformation) 시킴으로서 생리활성능이 증가된 다양한 생리활성물질을 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 차가버섯 발효 추출물은 미백, 주름개선, 항산화, 항염효과가 우수하여 관련 화장품 분야의 연구 및 산업에 유용하게 응용될 수 있을 것으로 보인다.

Description

자연동굴 조건에서 발효시킨 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING FERMENTED EXTRACT OF INONOTUS OBLIQUUS UNDER NATURAL CAVE}
본 발명은 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 차가버섯 발효 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 특히 자연석회동굴에서 발효시킨 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 차가버섯 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
차가버섯(Chaga)은 자작나무에 기생하는 약용버섯으로 학명은 Inonotus Obliquus이다. 시베리아와 북아메리카, 북유럽 등 북위 45도 이상 지방의 자작나무에 기생하는 버섯으로 암 등 성인병 치료에 효능이 뛰어나며, 바이러스에 의해 착생하여 수액을 먹고 자라는데, 대개 15∼20년 동안 성장한다. 러시아에서는 16세기경부터 불치병을 치료하는 비약으로 전해내려 왔으며, 1951년 소련 과학아카데미 코마로프과학연구소에서 본격적으로 연구되기 시작하여, 현재 러시아에서는 공식적인 암치료 약재로 인정받고 있다.
이에 차가버섯에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 일례로 대한민국 공개특허 제2013-0133477호에서는 차가버섯 및 상황버섯 추출물을 포함하는 전립선 비대증 개선, 여드름 개선, 발모 촉진 용도 조성물을 개시하고 있다. 그러나 상기 선행문헌에는 항염, 항산화, 미백, 주름개선 등과 관련된 화장료 조성물에 대해서 기재하고 있지 않으며, 현재까지 차가버섯을 이용한 항염, 항산화, 미백, 주름개선 효과는 알려진 바 없다.
한편, 담자균류에 속하는 백색부후균인 상황버섯은 액체발효과정 시 인위적인 교반 및 포기(aeration) 없이 접종된 상황버섯 균사체들이 발효대상물과 원활한 접촉을 하지 못하여 발효과정에서 타 세균들의 생장으로 발효액들의 성상이 달라진다. 또한 추가적인 영양분을 공급하지 않을 경우 상황버섯에 의한 발효과정은 그 기간이 길어지면 접종된 접종원의 생장이 늦어져 타 세균들에 의한 오염가능성이 크게 증가하는 문제점이 있다.
대한민국 공개특허 제2013-0133477호
상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본원발명은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯을 접종하고 배양하여 수득하는 차가버섯 발효 추출물의 제조방법 및 상기 차가버섯 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차가버섯 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 항염, 황산화, 미백, 또는 주름개선용 화장료 조성물일 수 있다.
다른 일 구현예는 상기 차가버섯 발효 추출물이 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 상황버섯 균사체 고체배양물이 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 배양시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 상황버섯 균사체 고체배양물이 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 30 내지 360일 동안 배양시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 차가버섯 발효 추출물이 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 5 내지 30℃에서 배양시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 차가버섯 발효 추출물이 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 pH 4.5 내지 7.5에서 배양시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 차가버섯 발효 추출물이 화장료 조성물에 0.001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 차가버섯 발효 추출물이 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말과 영지버섯, 동충하초, 아가리쿠스, 꽃솟이버섯, 및 이의 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 접종하고 배양시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 화장료 조성물이 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 차가버섯 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.
일 구현예는 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 배양시켜 상황버섯 균사체 고체배양물을 제조하는 단계; 및 상기 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득시키는 단계를 포함하는 제조방법일 수 있다.
다른 일 구현예는 상기 상황버섯 균사체 고체배양물이 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 30 내지 360일 동안 배양시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 수득시키는 단계가 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 5 내지 30℃에서 배양시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 수득시키는 단계가 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 pH 4.5 내지 7.5에서 배양시키는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화장료 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 항염, 황산화, 미백, 및 주름개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장 방법을 제공한다.
본 발명의 차가버섯 발효 추출물 제조방법은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯을 배양하여 수득함에 따라 상황버섯과 차가버섯 추출물들의 생리활성촉진능을 향상시킬 수 있으며, 차가버섯의 다양한 생리활성물질들을 생물전환(Biotransformation) 시킴으로서 생리활성능이 증가된 다양한 생리활성물질을 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 차가버섯 발효 추출물은 미백, 주름개선, 항산화, 항염효과가 우수하여 관련 화장품 분야의 연구 및 산업에 유용하게 응용될 수 있을 것으로 보인다.
도 1은 실시예 1.2에 따른 뽕나무 원형목편을 이용하여 제조한 상황버섯 균사체 고체배양물의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1.3에 따라 배양시간(Incubation time(week))에 따른 상황버섯 균사체 뽕나무 고체배양물에서 추출하여 측정한 유리포도당의 농도(Cumulative glucose released (mg/L))를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯을 접종하고 배양하여 수득한 추출물이 항산화, 미백, 항염, 또는 주름개선 효과가 매우 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 차가버섯 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득되는 것일 수 있으며, 발명 목적에 따라 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 이외의 물질들을 첨가하거나 접종하고 배양하여 수득할 수 있다. 예컨대, 상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말과 약용 버섯류 또는 이의 분말을 접종시켜 배양시킨 것일 수 있다. 상기 약용 버섯류는 영지버섯(Ganoderma lucidum), 동충하초(Cordyceps sinensis), 아가리쿠스(Agaricus), 꽃송이버섯 등 일 수 있다.
본 발명에 있어서 차가버섯, 상황버섯을 포함하는 버섯류는 야생 또는 재배되는 것일 수 있으며, 건조되거나 건조되지 않은 상태로 사용 가능하다.
상기 배양하여 수득되는 것에 있어서, 피부의 유효한 효능을 나타내기 위해 상기 배양은 적절한 온도에서 이루어질 수 있다. 예컨대, 상기 배양은 5 내지 30℃, 바람직하게는 5 내지 15℃ 에서 이루어질 수 있다.
상기 배양하여 수득되는 것에 있어서, 피부의 유효한 효능을 나타내기 위해 상기 배양은 적절한 pH 조건에서 이루어질 수 있다. 예컨대, 상기 배양은 pH 4.5 내지 7.5, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5 에서 이루어질 수 있다.
상기 배양하여 수득되는 것에 있어서, 피부의 유효한 효능을 나타내기 위해 배양기간은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 배양은 30 내지 360일간 이루어질 수 있다.
또한, 필요한 경우 상기 수득 후, 당업계에 공지된 여과 및/또는 농축 및/또는 동결건조 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
상기 상황버섯 균사체 고체배양물은 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무 등과 같은 침엽수 또는 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 보리수나무 등과 같은 활엽수에 상황버섯(phellinus linteus) 또는 이의 균질화물을 접종시켜 배양시킨 것일 수 있다. 상기 침엽수 또는 활엽수는 목편으로 사용되어 질 수 있으며, 상기 목편은 적당한 크기에 따라 재단되어 사용될 수 있다. 예컨대 상기 상황버섯 균사체 고체배양물은 뽕나무 원형 목편에 상황버섯을 접종시켜 배양시킨 것일 수 있다. 또한 상기 목편은 바람직한 배양을 위해 멸균된 것일 수 있다. 상기 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종시켜 배양하는 것에 있어서, 영양원인 유리포도당의 농도를 증가시키기 위해 배양기간은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 배양은 30 내지 360일간, 바람직하게는 60 내지 90일간 이루어질 수 있다.
상기 차가버섯 발효 추출물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 발효 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우 피부 개선 효과, 예컨대 항염, 항산화, 주름개선 또는 미백 효과가 나타나지 않을 수 있으며, 90중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과 증대의 정도가 미미하고, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있고, 경제적이지 못한 문제점이 발생할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 포함될 수 있는 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 및 담체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 계면활성제-비함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 등의 제형인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 포함될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 포함될 수 있으며, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 포함될 수 있고, 보다 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 포함될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 포함될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 또는 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 또는 클렌징팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 또는 클렌징 겔이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 차가버섯 발효 추출물 제조방법을 제공한다.
상기 차가버섯 발효 추출물 제조방법은 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 배양시켜 상황버섯 균사체 고체배양물을 제조하는 단계; 및 상기 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 균사체 고체배양물을 제조하는 단계는 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 30 내지 360일, 바람직하게는 60 내지 90 동안 배양시키는 것일 수 있다. 또한 상황버섯 또는 이의 균질화물 이외에 물질들을 첨가하거나 접종할 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 수득시키는 단계는 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 5 내지 30℃, 바람직하게는 5 내지 15℃에서 배양시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 수득시키는 단계는 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 pH 4.5 내지 7.5, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5에서 배양시키는 것일 수 있다. 상기 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양시키는 기간은 바람직하게 30일 내지 360일간 이루어질 수 있다.
본 발명은 상기 화장료 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 항염, 황산화, 미백, 및 주름개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장 방법을 제공한다.
본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 각질 박리 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실시예 1. 상황버섯 균사체를 이용한 차가버섯 발효 추출물의 제조
1.1 상황버섯 균사체 접종원 준비
강원대학교 생물학과 환경미생물학 연구실에서 분양받은 담자균류, 백색부후균인 상황버섯 (Phellinus linteus) 균사체들을 5℃, PDA (Potato Dextrose Agar) 평판배지에서 계대배양 (Subculture)하였으며 균사체 확보를 위한 액체배양은 25℃, 150 rpm, YMG (Yeast extract: 4 g/l, Malt extract: 10 g/l, Glucose: 4 g/l) 배지에서 진탕배양을 하였다.
PDA 평판배지에서 20일 간 배양된 상황버섯 균사체 agar plug (지름: 1 cm) 10~20개를 100 ml 멸균 3차 증류수가 들어있는 250 ml 삼각플라스크에 넣고 균질기(X120, CAT, Germany)로 30~60초간 균질화시켰다. 균질화된 상황버섯 균사체를 6,140 g에서 30분간 원심분리 후 상등액을 제거한 후 원심분리된 균사체에 멸균 3차 증류수 300 ml를 첨가하여 recipro shaker (vertically reciprocating extractor)에서 20분간 재현탁 시켰으며, 이 과정을 원심분리한 상등액에서 글루코오스(glucose), 인, 질소가 검출되지 않을 때까지 반복하였다. 잔류 YMG 배지성분이 제거된 상황버섯 균사체의 습윤 중량 (wet weight, 이하 "w wt"로 표시한다)를 측정하여 멸균된 3차 증류수를 혼합하여 균질화된 40% (w wt/v) 상황버섯 균사체 접종원을 제조하였다.
1.2 상황버섯 균사체 고체배양물 제조
산에서 채집한 뽕나무는 스크롤 쏘(scroll saw)로 잘라 원형목편 (Diameter: 8~12 cm, Thickness: 1~1.5 cm) 형태로 재단하여 사용하였다. 재단된 뽕나무 원형목편을 121℃ 습식멸균 후 80℃ 드라이 오븐에서 48시간 건조시켜 수분을 제거한 후 상황버섯 균사체의 기질로 사용하였다.
멸균된 3 L 비이커에 상기 실시예 1.1에서 준비된 균질화된 40% (w wt/v) 상황버섯 균사체 접종원 1 L와 멸균 3차 증류수 1 L를 혼합하여 20% (w wt/v) 상황버섯 균사체 접종원으로 희석한 후 상기 멸균 건조된 뽕나무 원형목편을 10분간 침지하였다. 침지된 뽕나무 원형목편을 꺼내어 멸균된 20 L 광구 유리 수조 (D: 30 cm, H: 50 cm)에 충진하고 25℃에서 8주간 정치 배양하였으며, 상황버섯 균사체 고체배양물의 제조에 사용한 유리수조에 미리 멸균된 증류수 1L 첨가하여 배양기간 동안 유리주소 내 습도를 유지하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 뽕나무 원형목편을 이용하여 제조한 상황버섯 균사체 고체배양물의 사진을 나타낸 것이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상황버섯 균사체가 원형목편 표면에서 생장하여 접종원인 상황버섯 균사체 고체배양물을 얻을 수 있었다.
1.3 상황버섯 균사체 고체배양물의 유리포도당 농도 측정
상기 실시예 1.2에 따라 상황버섯 균사체가 생장한 뽕나무 원형목편을 회수하였으며, 핀셋으로 균사체를 제거한 후, 10g 뽕나무 원형목편에 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)을 넣고 4℃에서 24시간 정치시켜 생분해된 목편에 포함된 유리포도당을 추출하였다. 추출된 유리포도당은 코튼 필터(cotton filter)를 통과시켜 1차로 잔류 상황버섯 균사체를 제거하였고, 6,140 g 조건에서 40분 동안 원심분리한 후 상등액만 회수하였다. 회수된 상등액을 0.45 ㎛ HPLC용 필터로 여과하여 HPLC [column A: RS tech, NH2 column (250 mm × 46 mm), column No.: 091264AE, column temperature: 40℃, mobile phase: 75:25 (acetonitrile:water), flow rate: 1.2 ml/min, detector: RI]로 유리포도당을 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 배양시간(Incubation time(week))에 따른 상황버섯 균사체 뽕나무 고체배양물에서 추출하여 측정한 유리포도당의 농도(Cumulative glucose released (mg/L))를 나타낸 것이다. '●'는 상황버섯 균사체를 접종하여 8주간 배양한 뽕나무 원형목편에서 추출한 유리포도당 농도이고 '○'는 상황버섯 균사체를 미접종한 뽕나무 원형목편에서 추출한 유리포도당 농도를 의미한다.
도 2에 나타난 바와 같이, 상황버섯 균사체 뽕나무 고체배양물의 유리포도당의 농도는 8주차에 305 mg/L로 균사체 미접종 대조군의 17 mg/L보다 약 18배 높은 유리포도당 농도를 나타냈다. 따라서 뽕나무 원형목편에 접종된 상황버섯 균사체들은 뽕나무를 생분해하며 발효과정에서 지속적인 탄소원을 공급받을 수 있다.
또한 유리포도당 농도 측정 시 핀셋으로 제거된 균사체를 모아서 초순수증류수를 첨가한 후 균질기로 13,000rpm 조건에서 1분간 균질화시켜 15,000 rpm 조건으로 원심분리한 후 상등액제거 후 w wt를 측정하였으며, 그 결과 평균 약 83g으로 나타났다. 따라서 일반발효액의 접종원은 상황버섯 균사체를 액상배양하여 회수된 균사체를 균질기로 균질화 후 원심분리, 세척과정을 거쳐 83 g(w wt)의 균사체를 확보하여 사용하였다.
1.4 차가버섯 발효 추출물의 제조
건조된 차가버섯(입수처: 대광약업사)을 세절한 후 다시 분쇄하여 분말 상으로 수득하였다. 수득한 차가버섯 분말에 상기 실시예 1.2에 따라 준비된 상황버섯 고체배양물을 충진하고 pH 5.5~6.5, 온도 5~15℃의 조건의 동굴(강원도 정선 화암동굴)에서 180일 동안 배양하여 차가버섯 발효 배양물을 준비하였다. 상기 차가버섯 발효 배양물 내의 유효성분을 추출하고자 0.2㎛ 사이즈의 필터를 이용하여 고분자 침전물 및 균사체를 제거하여 차가버섯 발효 추출물을 수득하였다.
비교예 1. 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물의 제조
건조된 차가버섯을 세절한 후 다시 분쇄하여 분말 상으로 수득하였다. 수득한 차가버섯 분말을 1.2L의 기본 배지(YM Broth)에 30 중량%가 되도록 첨가하여 pH를 5.5~ 6.5로 조절하였으며 상온에서 2시간 정치하여 충분히 함습될 수 있도록 하였다.
한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받은 효모 (Saccharomyces cerevisia)를 35℃에서 24시간 액체 배양하여 차가버섯 발효 배양물을 준비하였다.
상기 차가버섯 분말이 함유된 배지에 상기 효모를 희석하여 106 CFU/ml로 접종하고 pH 5.5~6.5, 5~15℃의 조건의 동굴에서 180일 동안 배양하여 효모를 이용한 차가버섯 발효 배양물을 준비하였다. 상기 발효 배양물 내의 유효성분을 추출하고자 0.2㎛ 사이즈의 필터를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물을 수득하였다.
실험예 1. 세포 독성 평가 - MTT 분석
한국 세포주 은행에서 제공받은 HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 1x105cells/ml의 농도로 접종하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지에 양성대조군의 경우에는 무처리하여 24시간 배양하였으며, 실시예 1의 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1의 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물의 경우에는 혈청이 포함되지 않은 배지에 각각 25, 50, 100, 200 ug/ml로 희석하여 웰(well) 당 100ul씩 처리하여 준 후, 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5mg/ml의 농도로 녹아져 있는 MTT시약을 20㎕씩 넣어주고 4시간 배양하였다. MTT 시약과 추출물이 포함된 배지를 모두 제거하고 각 웰에 100㎕ acid isopropanol(0.04 N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 10~15분간 진탕기에서 교반하여 주고, ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도를 이용하여 세포세존능(%)을 구하였으며(수학식 1), 이를 하기 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
세포생존능(%) = (실험군 흡광도)/(양성대조군 흡광도) x 100
실험군 흡광도: 실시예 1 또는 비교예 1에서 제조된 추출물을 처리하였을 때 측정한 흡광도
양성대조군 흡광도: 무처리군의 흡광도
구분 농도(ug/ml) 세포생존능(%)
양성대조군(무처리군) - 100
효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물 처리군
(비교예 1)		 25 101.2
50 98.5
100 97.7
200 93.4
차가버섯 발효 추출물 처리군
(실시예 1)		 25 101.4
50 93.9
100 92.4
200 91.6
표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물 모두 고농도인 200 ug/ml로 각질형성세포인 HaCaT에 처리하였을 때, 상기 세포의 생존능은 80% 이상을 나타내어 세포독성이 없음을 확인하였다.
실험예 2. 항염 효능 확인 - NO ( nitric oxide ) assay
일산화질소(nitric oxide, NO)는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로써, NOS(NO synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성되며, 상기 일산화질소는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 생체가 아토피 피부염과 같이 염증상태에 빠지게 되면 iNOS(inducible NOS)가 발현되어 많은 양의 일산화질소를 생산한다. 이렇게 생성된 일산화질소와 같은 염증촉진 매개물은 아토피 피부염을 더욱 악화시키는 것으로 알려져 있어, 항염 효능을 확인하기 위해 No assay를 실시하였다.
구체적으로 RNS(Reactive nitric species)인 일산화질소의 과도한 생성은 염증반응을 유도하며, 이에 대한 효능 측정을 위하여 세포를 LPS (lipopolysaccharide)로 자극하여 일산화질소의 생성을 유도한 후, 시료에 의한 일산화질소 생성저해효과를 그리스시약(Griessreagent)으로 측정하는 원리를 이용해 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물, 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물의 항염 효과를 측정하였다. 한국 세포주 은행에서 제공받은 Raw 264.7세포(Mouse macrophage)를 24-웰 플레이트에 1×105cells/ml의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 100ng/ml LPS가 포함된 반면 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 실시예 1 및 비교예 1의 조성물의 최종농도가 25, 50, 100, 200 ug/ml가 되도록 희석하여 500㎕씩 세포에 처리하여 준 후, 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 회수하여 4℃, 12,000rpm 조건에서 10분간 원심분리를 시킨 후, 상층액만 회수하였으며, 상층액 50ul를 취하여 96-웰 플레이트에 넣고 동량의 그리스시약(Griessreagent)과 10분 동안 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도를 이용하여 일산화질소 생성 저해능(%)을 구하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[수학식 2]
일산화질소 생성 저해능(%) = (시료의 흡광도/ LPS 처리 흡광도) X 100
구분 처리농도(㎍/㎖) NO 생성 저해능(%)
무처리군 (양성대조군) - 100
효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물
(비교예 1)		 25 5.2
50 12.5
100 49.5
200 68.7
차가버섯 발효 추출물
(실시예 1)		 25 14.2
50 48.9
100 75.1
200 79.7
표 2에 나타난 바와 같이, 무처리 하였을 때 일산화질소 생성량을 100%로 보았을 때 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물은 비교예 1에 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물보다 더 우수한 항염 효능이 있음을 확인하였다.
실험예 3. 항산화 효능 확인 - DPPH 라디칼 소거 분석
보통의 라디칼은 반응성이 강하여 불안정한 반면, DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질) 라디칼은 비교적 안정한 자유라디칼로, 라디칼 상태로 존재시 517nm에서 흡광을 통해 측정이 가능한 것을 이용하여, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물에 대한 자유라디칼 소거능을 DPPH를 응용하여 측정하였다 (Blois, M. S. nature 181, 1190, 1958).
실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물, 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물이 각각 25, 50, 100, 200 ug/ml로 희석된 시료, 및 0.005 %(w/v) BHT(butylatedhydroxytoluene)를 24 웰 플레이트의 각 웰에 각각 500㎕씩 넣은 후, 0.1mM DPPH를 녹인 메틸 알코올 용액에 100㎕씩 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후 ELISA reader (VICTOR3, Perkin Elmer)를 이용하여 565nm에서 흡광을 측정하였으며, 흡광도를 이용하여 자유 라디칼 소거효능(%)을 구하였고(수학식 3), 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 대조군으로는 상기 메틸 알코올 용액을 사용하였다.
[수학식 3]
자유라디칼 소거효능 (%) = (1-실험군 흡광도/대조군 흡광도)X100
실험군 흡광도: 실시예 1에서 제조된 발효 추출물, 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 발효 추출물, 또는 BHP를 처리하였을 때의 흡광도
대조군 흡광도: 0.1mM DPPH를 녹인 메틸 알코올 용액에서의 흡광도
구분 자유라디칼 소거효능(%)
BHT 98.12
효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물
(비교예 1)		 55.12
차가버섯 발효 추출물
(실시예 1)		 75.34
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물은 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물보다 자유라디칼 소거효능이 현저히 우수함을 확인하였다.
실험예 4. 미백효능 확인 - 타이로시나아제 효소 저해 분석
실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물의 타이로시나아제 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여, 버섯 유래의 타이로시나아제를 시그마(Sigma.)사로부터 구입하여 실험하였다.
96 웰 플레이트에 타이로신을 기질로 사용한 1.5mM 타이로신 용액을 100㎕씩 넣고, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물을 25, 50, 10, 200 ㎍/ml로 20㎕씩 처리한 후, 100U/ml 타이로시나아제를 80㎕씩 접종하였다. 접종 후 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰으며, 반응 시 완충용액으로 0.1M의 인산염 완충용액을 사용하였다. 상기와 동일하게 코직산(Kojic acid) 1, 5 ㎍/ml로 20㎕씩 처리한 후, 100U/ml 타이로시나아제를 80㎕씩 접종한 후, 혼합하여 동일한 조건에서 반응시켰으며, 반응이 종료된 플레이트는 490nm에서 흡광도 측정하였고, 측정된 흡광도를 이용하여 타이로시나아제 활성 제해 효능(%)을 구하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
[수학식 4]
타이로시나아제 활성 저해능(%)= 100-(시료의 흡광도-대조군의 흡광도) x 100
구분 농도(㎍/ml) 타이로시나아제 활성 저해능(%)
코직산(양성대조군) 1 45
5 91
효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물
(비교예 1)		 25 11
50 14
100 18
200 21
차가버섯 발효 추출물
(실시예 1)		 25 18
50 21
100 29
200 35
표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물은 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물보다 타이로시나아제 활성 저해 효능이 증대되었다. 타이로시나아제를 억제하는 경우 멜라닌 세포의 생성을 억제되는 점에서 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물은 효소 수준에서 미백 효능이 있음을 확인하였다.
실험예 5. 주름개선효능 확인 - PIP -1 assay
섬유아세포에서 배지로 배출되는 콜라겐 합성 양을 측정하기 위하여 procollagen type 1 C-peptide ELISA kit(TaKaRa, Japan)을 사용하였다. kit에 동봉 되어 있는 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100ul antibody-POD conjugate solution를 넣은 후 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물과 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물을 각각 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도로 하여 20ul씩 또는 각각 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ng/ml로 희석된 PIP-1 standard solution를 20ul씩 넣어주었다. 그 후 잘 섞은 후 실링(sealing)하여 37℃에서 3시간 배양 후 석션(suction)하여 400ul의 washing buffer로 4회 세척하였다. 상기 washing buffer를 모두 제거 한 후 키트에 포함된 TBMZ(3,3' 5,5'- tetramethylbenzidine) substrate solution를 100ul씩 넣어 15분간 상온에서 배양하였고, 그 후 stop solution(1N H2SO4)을 100ul씩 추가로 더 넣어주고 섞어주었으며, 종료 후 1시간 내에 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 콜라겐 생합성능(%)을 구하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[수학식 5]
콜라겐 생합성능(%) = 100 X (시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도)
구분 농도(㎍/mL) 콜라겐 생합성능(%)
무처리군(양성대조군) - 100.00
효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물
(비교예 1)		 25 105.00
50 107.00
100 107.50
200 110.00
차가버섯 발효 추출물
(실시예 1)		 25 103.00
50 107.00
100 113.00
200 121.00
표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 차가버섯 발효 추출물은 비교예 1에서 제조된 효모를 이용한 차가버섯 발효 추출물보다 콜라겐 생합성능이 증가하여 주름개선 효능이 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 차가버섯 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 황산화, 미백, 또는 주름개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서.
    상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득되는 것인, 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 상황버섯 균사체 고체배양물은 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종시켜 배양시킨 것인, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 상황버섯 균사체 고체배양물은 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종시켜 30 내지 360일 동안 배양시킨 것인, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 5 내지 30℃에서 배양시킨 것인, 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 pH 4.5 내지 7.5에서 배양시킨 것인, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 차가버섯 발효 추출물은 화장료 조성물에 0.001 내지 90 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 차가버섯 발효 추출물은 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말과
    영지버섯, 동충하초, 아가리쿠스, 꽃송이버섯, 및 이의 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 접종시켜 배양시킨 것인, 화장료 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 배양시켜 상황버섯 균사체 고체배양물을 제조하는 단계; 및
    상기 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 배양하여 수득시키는 단계를 포함하는, 차가버섯 발효 추출물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 상황버섯 균사체 고체배양물은 편백나무, 소나무, 잣나무, 향나무, 삼나무, 전나무, 가문비나무, 분비나무, 향나무, 비자나무, 떡갈나무, 뽕나무, 상수리나무, 오동나무, 느릅나무, 아카시아나무, 피나무, 고로쇠나무, 물푸레나무, 및 보리수나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 상황버섯 또는 이의 균질화물을 접종하고 30 내지 360일 동안 배양시키는 것을 특징으로 하는, 차가버섯 발효 추출물의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 수득시키는 단계는 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 5 내지 30℃에서 배양시키는 것을 특징으로 하는, 차가버섯 발효 추출물의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 수득시키는 단계는 상황버섯 균사체 고체배양물에 차가버섯 또는 이의 분말을 접종하고 pH 4.5 내지 7.5에서 배양시키는 것을 특징으로 하는, 차가버섯 발효 추출물의 제조방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 항염, 황산화, 미백, 및 주름개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장 방법.
KR1020140018185A 2014-02-18 2014-02-18 자연동굴 조건에서 발효시킨 차가버섯 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 KR101625163B1 (ko)

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