CN113768831A - 一种灵芝二次发酵液的制备方法、发酵液及其应用 - Google Patents

一种灵芝二次发酵液的制备方法、发酵液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种灵芝二次发酵液的制备方法、发酵液及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备；步骤2)将灵芝深层液体发酵物过滤，得到灵芝菌丝体；步骤3)将灵芝菌丝体加入至缓冲体系中，在适宜的条件下进行酶解；步骤4)将酶解后的得到灵芝菌丝体酶解混合物加入乳酸菌发酵；步骤5)再加入酵母菌再次进行发酵；步骤6)将步骤5)得到的发酵体系离心过滤，取上层清液，得到灵芝二次发酵液。灵芝深层液体发酵物，经充分的酶解和降解之后，添加蔗糖为补充碳源，再经由乳酸菌和酵母菌发酵，获得的灵芝二次发酵液富含小分子功能物质，具有良好的抗氧化和美白功效。

Description

一种灵芝二次发酵液的制备方法、发酵液及其应用
技术领域
本发明涉及发酵领域，特别涉及一种制备灵芝发酵液的方法、发酵液及其应用。
背景技术
灵芝是多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum或紫芝Ganoderma sinense，灵芝发酵液具有活性成分含量高、抗氧化能力强且美白效果好的优点，可广泛应用于化妆品领域(专利CN201711249255.1)。然而，经由液体深层发酵后，过滤或离心后所获得的菌丝体缺乏良好的下游用途，在工业化大规模生产中造成了极大的资源浪费和环境污染。
灵芝菌丝体中富含灵芝多糖、蛋白质、游离氨基酸及微量元素等多种营养物，利用益生菌对灵芝菌丝体作二次发酵，可使这些内容物析出到发酵液中，并经过益生菌在发酵过程中的新陈代谢作用，分解成更加小分子量的活性物质；或者根据不同的益生菌生理生化特性，可产生新型活性物质。
对灵芝菌丝体的菌体细胞进行破壁，并将胞内内含物中的大分子物质降解成更适于益生菌新城代谢的小分子物质，是灵芝菌丝体进行二次发酵前的必经步骤。然而由于真菌的细胞壁较厚，胞内内含物组分复杂，因此，选取适宜的菌体破壁和大分子降解途径是二次发酵液活性升高、发酵体系稳定的重要前提。目前，用于菌体破壁的方式主要是利用商品化生物酶对菌丝体进行单酶酶解或复配酶酶解。但是，灵芝菌丝体的内含物组分复杂，单纯地利用一种或几种生物酶对菌丝体进行酶解，很难达到理想的效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种灵芝二次发酵液的制备方法，所制得的发酵液，富含小分子功能物质，具有良好的抗氧化和美白功效。
进一步地，有必要提供上述灵芝二次发酵液的应用。
本发明提供的技术方案如下：
一种灵芝二次发酵液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、培养、扩培和发酵后，获得灵芝深层液体发酵物；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物过滤，即获得灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体加入至缓冲体系中，在适宜的条件下进行酶解，得到灵芝菌丝体酶解混合物，其中所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物，；
步骤4)将酶解后的得到灵芝菌丝体酶解混合物加入乳酸菌发酵；
步骤5)再加入酵母菌再次进行发酵；
步骤6)将步骤5)得到的发酵体系离心过滤，取上层清液，得到灵芝二次发酵液。
其中，所述乳酸菌是植物乳杆菌Picp－2，菌种保藏号：M 20191045，保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述酵母菌是单胞酿酒酵母菌ZLG－6，菌种保藏号：M 20191046，保藏于中国典型培养物保藏中心。
其中，所述灵芝深层液体发酵物的制备可以通过常规的方法制得，也可以通过以下方法制得：
灵芝经由菌种活化、液体培养基摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝深层液体发酵物；
更进一步地，可以通过以下方法制得：
灵芝经由菌种活化、灵芝在液体培养基中摇培3－5天、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，其中所述液体培养基为葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L的水溶液。
其中，所述步骤2)具体为：将灵芝深层液体发酵物在9000rpm的离心速度下离心10min，过滤得到沉淀物，即为灵芝菌丝体。
其中，所述步骤3)的缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物，添加比例为每100ml枯草芽孢杆菌发酵物中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
所述枯草芽孢杆菌发酵物是枯草芽孢杆菌种子液接种量为2vol％的LB液体培养基，培养6－8小时而得。
其中，所述步骤3)的酶解条件为50℃、200rpm、酶解3－4h。
其中，所述步骤4)乳酸菌的接种量为10vol％，发酵条件为37℃培养箱中静置培养7天。
其中，所述步骤5)酵母菌的接种量为1vol％，30℃培养箱中静置培养7天
其中，所述步骤6)具体为：将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，即可获得灵芝二次发酵液。
其中，所述步骤4)在加入乳酸菌进行发酵前，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖。
本发明所述的接种量是指种子液的体积与培养基或缓冲体系的体积比，具体含义为当种子液的OD600nm值为0.6－0.8(菌株生长对数期)时，在培养基或缓冲体系中接种的种子液，种子液的体积与培养基或缓冲体系的体积比单位为vol％。
进一步地，如上所述的灵芝二次发酵液的应用，将灵芝二次发酵液添加在护肤品中，灵芝二次发酵液的添加量为0.1－10wt％。
本发明添加了灵芝二次发酵液的护肤品其抗氧化效果和美白效果得到显著提升。
与现有技术相比较，本发明提供的一种灵芝二次发酵液的制备方法，以灵芝液体深层发酵物过滤后的灵芝菌丝体为培养基质，经充分的酶解和降解之后，添加蔗糖为补充碳源，再经由乳酸菌和酵母菌发酵，离心过滤即可获得灵芝二次发酵液。所获得的灵芝二次发酵液富含小分子功能物质，具有良好的抗氧化和美白功效。
附图说明
图1为实施例1与对比例5、对比例6中小分子物质的分子量信息。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
物质来源
枯草芽孢杆菌：Bacillus subtilis subsp.subtilis trpC2strain 168；
溶菌酶：品牌Ssolarbio，货号L8120，CAS号：12650－88－3，
中性蛋白酶：品牌Ssolarbio，货号Z8031，CAS号：9066－59－1，5万U/g；
木瓜蛋白酶：品牌Ssolarbio，货号G8431，CAS号：9001－73－4，10万U/g；
乳酸菌：植物乳杆菌Picp－2(菌种保藏号：M 20191045，保藏于中国典型培养物保藏中心)；
酵母菌：单胞酿酒酵母菌ZLG－6(菌种保藏号：M 20191046，保藏于中国典型培养物保藏中心)；
LB液体培养基：为氯化钠1wt％，酵母粉0.5wt％，胰蛋白胨1wt％的水溶液，所用物质均来自市售。
灵芝：中华红芝，酶购于索莱宝。(本发明所用的灵芝来自于中华红芝，仅为说明，并不对本发明的保护范围起限定作用)；
纳豆芽孢杆菌：Bacillus│natto，货号BK－J65048。
术语说明
接种量单位为vol％，含义为当种子液的OD600nm值为0.6－0.8(菌株生长对数期)时，在培养基或缓冲体系中接种的种子液，种子液的体积与培养基或缓冲体系的体积比单位为vol％。
本发明所用的灵芝深层液体发酵物通过以下方法制得：
灵芝经由菌种活化、灵芝在液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)中摇培3－5天、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液。
具体的方法如下：
将中华红芝应用机械搅拌式发酵罐进行级联放大的发酵生产。
①100L种子罐的发酵参数
灭菌参数：115℃，30min。
接种方式：火焰接种，将摇瓶中的种子液直接转接进入100L发酵罐中。
接种量：约5％。
参数设置：培养温度28~30℃；罐压0.05MPa；通气量3m3/h；转速21Hz/rpm。
培养周期：2天。
实施例1
灵芝二次发酵液的制备
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，具体方法可参见原料说明；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物进行离心，离心条件为在9000rpm的离心速度下离心10min，得到的沉淀物即为灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体重悬于5倍体积的缓冲体系中，50℃、200rpm条件下酶解4h，得到灵芝菌丝体酶解混合物；
所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物，添加比例为每100ml枯草芽孢杆菌发酵物中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
所述枯草芽孢杆菌发酵物为枯草芽孢杆菌种子液接种量为2vol％的LB液体养基，培养6－8小时而得；
步骤4)酶解结束后，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖(即按照质量体积比添加8％的蔗糖)，获得待发酵的灵芝菌丝体，置于115℃条件下灭菌30min，冷却后，按照10vol％的接种量加入活化好的乳酸菌(Pipc－2)，于37℃培养箱中静置培养7天；
步骤5)再按照1vol％的接种量加入活化好的酵母菌(ZLG－6)，于30℃培养箱中静置培养7天；
步骤6)将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，取上层清液，即可获得灵芝二次发酵液。
对比例1
灵芝二次发酵液的制备
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，具体方法可参见原料说明；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物进行离心，离心条件为在9000rpm的离心速度下离心10min，得到的沉淀物即为灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体重悬于5倍体积的缓冲体系中，50℃、200rpm条件下酶解4h，得到灵芝菌丝体酶解混合物；
所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的纳豆芽孢杆菌发酵物，添加比例为每100ml枯草芽孢杆菌发酵物中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
所述纳豆芽孢杆菌发酵物为纳豆芽孢杆菌种子液接种量为2vol％的LB液体养基，培养6－8小时而得；
步骤4)酶解结束后，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖(即按照质量体积比添加8％的蔗糖)，获得待发酵的灵芝菌丝体，置于115℃条件下灭菌30min，冷却后，按照10vol％的接种量加入活化好的乳酸菌(Pipc－2)，于37℃培养箱中静置培养7天；
步骤5)再按照1vol％的接种量加入活化好的酵母菌(ZLG－6)，于30℃培养箱中静置培养7天；
步骤6)将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，取上层清液，即可获得灵芝二次发酵液。
对比例2
灵芝二次发酵液的制备
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，具体方法可参见原料说明；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物进行离心，离心条件为在9000rpm的离心速度下离心10min，得到的沉淀物即为灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体重悬于5倍体积的缓冲体系中，50℃、200rpm条件下酶解4h，得到灵芝菌丝体酶解混合物；
所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的无菌水溶液，添加比例为每100ml无菌水中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
步骤4)酶解结束后，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖(即按照质量体积比添加8％的蔗糖)，获得待发酵的灵芝菌丝体，置于115℃条件下灭菌30min，冷却后，按照10vol％的接种量加入活化好的乳酸菌(Pipc－2)，于37℃培养箱中静置培养7天；
步骤5)再按照1vol％的接种量加入活化好的酵母菌(ZLG－6)，于30℃培养箱中静置培养7天；
步骤6)将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，取上层清液，即可获得灵芝二次发酵液。
对比例3
灵芝二次发酵液的制备
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，具体方法可参见原料说明；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物进行离心，离心条件为在9000rpm的离心速度下离心10min，得到的沉淀物即为灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)按照每100ml灵芝菌丝体中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖(即按照质量体积比添加8％的蔗糖)，获得待发酵的灵芝菌丝体，置于115℃条件下灭菌30min，冷却后，按照10vol％的接种量加入活化好的乳酸菌(Pipc－2)，于37℃培养箱中静置培养7天；
步骤4)再按照1vol％的接种量加入活化好的酵母菌(ZLG－6)，于30℃培养箱中静置培养7天；
步骤5)将步骤4)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，取上层清液，即可获得灵芝二次发酵液。
对比例4
灵芝二次发酵液的制备
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备
灵芝经由菌种活化、液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)摇培、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，具体方法可参见原料说明；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物进行离心，离心条件为在9000rpm的离心速度下离心10min，得到的沉淀物即为灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体重悬于5倍体积的缓冲体系中，50℃、200rpm条件下酶解4h，得到灵芝菌丝体酶解混合物；
所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物，添加比例为每100ml枯草芽孢杆菌发酵物中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
所述枯草芽孢杆菌发酵物为枯草芽孢杆菌种子液接种量为2vol％的LB液体养基，培养6－8小时而得；
步骤4)酶解结束后，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖(即按照质量体积比添加8％的蔗糖)，获得待发酵的灵芝菌丝体，置于115℃条件下灭菌30min，冷却后，按照10vol％的接种量加入活化好的乳酸菌(从安琪酵母公司的果蔬发酵剂中分离得到的植物乳杆菌)，于37℃培养箱中静置培养7天；
步骤5)再按照1vol％的接种量加入活化好的酵母菌(从安琪酵母公司活性干酵母菌剂中分离得到的酿酒酵母)，于30℃培养箱中静置培养7天；
步骤6)将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，取上层清液，即可获得灵芝二次发酵液。
对比例5
灵芝在液体培养基(葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L)中发酵3－5天，获得灵芝发酵物。将灵芝发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，即获得灵芝发酵液。
对比例6
灵芝子实体水提物的制备
将灵芝子实体置于80℃烘箱中烘至恒重，用中药粉碎机打碎，过80目筛得到灵芝粉末。以粉末和液体比1：20加超纯水，250W、90℃超声波辅助提取2h，然后在4000rpm离心速度下离心5min，得到灵芝子实体水提物。
说明：灵芝子实体为常规方法培养得到。
功效评价实验
实验例1实施例与对比例的抗氧化功效比较
(1)DPPH自由基清除率的测定
在1mL实施例或对比例的待测样品中加入1mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀静置30分钟，517nm测吸光值。每个样品设置3个平行。用蒸馏水将待测样品稀释10倍，测定稀释后样品的DPPH自由基清除能力，用DPPH自由基清除率A1来表示，并分别列于表1中。同等稀释倍数下，DPPH自由基清除率A1越高，表明该物质抗氧化性越强。DPPH自由基清除率A1的计算公式如下：
A1＝[1-(As-Ax)/A0]×100％
式中：As为1mL待测样品加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Ax为1mL样品加1mL溶剂的吸光值；A0为1mL DPPH乙醇溶液加1mL溶剂的吸光值。
表1实施例与对比例的DPPH自由基清除能力比较
Figure BDA0003284795960000091
(2)羟基自由基(·OH)清除率的测定
采用Fenton反应法，反应体系中依次加入6mmol/L FeSO4溶液、6mmol/L H2O2溶液、实施例或对比例待测样品或蒸馏水(对照)各2mL，静置10min后加入2mL 6mmol/L水杨酸溶液，静置30min，测定510nm波长下的吸光值。用蒸馏水将待测样品稀释5倍，测定稀释后样品的羟基自由基清除能力，用羟基自由基(·OH)清除率A2来表示，并列于表2中。同等稀释倍数下，羟基自由基清除率越高，表明该物质抗氧化性越强。羟基自由基(·OH)清除率A2的计算公式如下：
A2＝(1-A0/Ax)×100％
式中：A0为待测样品的吸光值；Ax为蒸馏水(对照)的吸光值。
表2实施例与对比例的羟基自由基清除能力比较
Figure BDA0003284795960000101
(3)ABTS自由基清除率的测定
将7.4mmoL/L ABTS与2.6mmoL/L K2S2O8溶液各取0.2mL，混匀后暗处反应12h，再用95％乙醇稀释40－50倍，使该混合液(工作液)在734nm波长下的吸光值处于0.68－0.72之间。将0.8mL工作液与0.2mL待测样品或95％乙醇(对照)混匀，静置6－8min，测定734nm波长下的吸光值。用蒸馏水将待测样品稀释5倍，测定稀释后样品的ABTS自由基清除能力，用ABTS自由基清除率A3，并列于表3中。同等稀释倍数下，ABTS自由基清除率越高，表明该物质抗氧化性越强。ABTS自由基清除率A3的计算公式如下：
A3＝(1-A0/Ax)×100％
式中：A0为待测样品的吸光值；Ax为95％乙醇(对照)的吸光值。
表3实施例与对比例的ABTS自由基清除能力比较
Figure BDA0003284795960000111
从表1、表2和表3可知，实施例的抗氧化活性显著高于各组对比例，具有良好的抗氧化功效。
实验例2实施例与对比例的美白功效比较
采用酪氨酸酶活性抑制率指标评价实施例与对比例的美白功效。
酪氨酸酶活性抑制率的测定：以L－酪氨酸作为底物进行测定，在反应体系中分别加入3、2、2和1mL PBS缓冲液(0.2mol/L，pH 6.8)，0、1、0和1毫升酪氨酸酶溶液(200U/mL)，以及0、0、1和1毫升样液，混匀，37℃恒温水浴10min，然后分别加入1、1、1和1毫升L－酪氨酸(0.15mmol/L)，分别得到添加了PBS和L－酪氨酸的体系B1，添加PBS、酪氨酸酶和L－酪氨酸的体系B2，添加了PBS、样液和L－酪氨酸的体系B3，以及添加PBS、酪氨酸酶、样液和L－酪氨酸的体系B4，再在37℃条件下反应10min，然后在冰水中迅速冷却，测定475nm波长下的吸光值。酪氨酸酶活性抑制率N的计算公式如下：
N＝[1-(B4-B3)/(B2-B1)]×100％
式中：B1为添加PBS和L－酪氨酸的体系B1的吸光值；B2为添加PBS、酪氨酸酶和L－酪氨酸的体系B2的吸光值；B3为添加PBS、样液和L－酪氨酸的的体系B3的吸光值；B4为添加PBS、酪氨酸酶、样液和L－酪氨酸的体系B4的吸光值。
表4实施例与对比例的美白功效比较
Figure BDA0003284795960000112
Figure BDA0003284795960000121
从表4可知，实施例1制得的灵芝发酵液的酪氨酸酶活性抑制率与对比例4制得的灵芝发酵液接近，显著高于对比例1、对比例2和对比例3制得的灵芝发酵液，同时显著高于对比例6制得的灵芝子实体水提物，具有良好的美白功效。
实验例3
按照LC/MS操作，测定灵芝二次发酵液(实施例1)、灵芝发酵液(对比例5)和灵芝子实体提取物(对比例6)三个样品中m/z的分布与丰度信息，如附图1所示。
图1实施例1与对比例5、对比例6中小分子物质的分子量信息(m/z与丰度)
由图1可以看出，灵芝二次发酵液的m/z分子量分布更广，小分子物质的丰度较灵芝发酵液和子实体提取物更高。
护肤品的制备
在护肤品中添加0.1－10wt％的实施例1制得的灵芝二次发酵液。
本发明实施例和对比例的枯草芽孢杆菌的发酵物是通过枯草芽孢杆菌发酵得来的，具体步骤如下：将枯草芽孢杆菌菌保液在LB固体培养基上划线培养过夜，待长出单菌落后，挑取单菌落至10－20毫升的LB液体培养基中，37摄氏度180转振荡培养过夜。随后，以2vot％的接种量将活化的枯草芽孢杆菌种子液转接100毫升LB液体培养基中，培养6－8小时，即可得枯草芽孢杆菌发酵物。也就是灵芝菌丝体下一步酶解所用到的缓冲体系。
上述枯草芽孢杆菌的发酵物的制备方法仅为对实施例的进一步说明，并不对本发明的保护范围进行限定。
灵芝深层液体发酵物的制备方法仅为本实施例的一种方法，其它常规方法制得的枯草芽孢杆菌的发酵物和灵芝深层液体发酵物的制备也同样适用于本发明。普通方法得到的灵芝深层液体发酵物在经过本发明所述的二次发酵方法后得到的灵芝二次发酵液，具抗氧化和美白功效也显著提升。
同理，实施例所用的灵芝为中华红芝仅为说明，并不对本发明的保护范围起限定作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备：
灵芝经由菌种活化、培养、扩培和发酵后，获得灵芝深层液体发酵物；
步骤2)将灵芝深层液体发酵物过滤，即获得灵芝深层液体发酵后的灵芝菌丝体；
步骤3)将灵芝菌丝体加入至缓冲体系中，在适宜的条件下进行酶解，得到灵芝菌丝体酶解混合物，其中所述缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物；
步骤4)将酶解后的得到灵芝菌丝体酶解混合物加入乳酸菌发酵；
步骤5)再加入酵母菌再次进行发酵；
步骤6)将步骤5)得到的发酵体系离心过滤，取上层清液，得到灵芝二次发酵液。
2.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述乳酸菌是植物乳杆菌Picp－2，菌种保藏号：M 20191045，保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述酵母菌是单胞酿酒酵母菌ZLG－6，菌种保藏号：M 20191046，保藏于中国典型培养物保藏中心。
3.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)灵芝深层液体发酵物的制备具体为：
灵芝经由菌种活化、灵芝在液体培养基中摇培3－5天、100L一级种子罐扩培和吨级发酵罐发酵后，获得灵芝菌丝体液体深层发酵液，其中所述液体培养基为葡萄糖20g/L；麦芽浸粉20g/L；酵母粉1g/L；蛋白胨1g/L的水溶液。
4.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤2)具体为：将灵芝深层液体发酵物在9000rpm的离心速度下离心10min，过滤得到沉淀物，即为灵芝菌丝体。
5.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)的缓冲体系是添加了溶菌酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵物，添加比例为每100ml枯草芽孢杆菌发酵物中添加0.15g溶菌酶、2g中性蛋白酶和2g木瓜蛋白酶；
所述枯草芽孢杆菌发酵物是枯草芽孢杆菌种子液接种量为2vol％的LB液体培养基，培养6－8小时而得。
6.如权利要求5所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)的酶解条件为50℃、200rpm、酶解3－4h。
7.如权利要求2所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)乳酸菌的接种量为10vol％，发酵条件为37℃培养箱中静置培养7天；
所述步骤5)酵母菌的接种量为1vol％，30℃培养箱中静置培养7天。
8.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤6)具体为：将步骤5)得到的发酵物在9000rpm条件下离心10min，将上清液经0.22μm膜过滤，即可获得灵芝二次发酵液。
9.如权利要求1所述的灵芝二次发酵液的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)在加入乳酸菌进行发酵前，按照每100ml灵芝菌丝体酶解混合物中添加8g蔗糖的比例添加蔗糖。
10.一种权利要求1－9任一项所述的灵芝二次发酵液的应用，其特征在于将灵芝二次发酵液添加在护肤品中，灵芝二次发酵液的添加量为0.1－10wt％。
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