KR20210133491A - 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물 - Google Patents

삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 삼채(Allium hookeri) 추출물을 처리하였을 때, 본 발명의 삼채(Allium hookeri) 추출물은 공간 지각 능력, 단기 기억 인지능, 공간 학습 능력 및 명시적 기억능력을 향상시킴으로써, 상기 삼채 추출물은 인지능 개선용 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 인지능 개선 소재의 개발로 고령화 시대의 사회적 비용절감과 삶의 질 향상에 기여할 수 있다.

Description

삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물{Health functional food composition for improving cognitive ability comprising an extract of Allium hookeri}
본 발명은 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
인지(cognition)는 라틴어로 아는 것, 개념화하는 것 또는 인식하는 것이란 뜻으로 정보를 가공하는 과정에서 지식을 적용하는 것 또는 적용사례를 바꾸는 능력으로 정의될 수 있으며, 인지능(cognitive ability)이란 지식을 획득하고 사용하는 방식에 관한 능력을 의미한다. 인지력의 의미는 사용하는 분야에 따라 달라질 수 있고, 그 예로 심리학의 인지과학에서는 개인의 정보처리 능력을 의미하며 인지력의 발달된 다른 개념으로는 개인의 심리 상태, 집단 및 조직 간의 사회적 연결 기능 등이 포함될 수 있다.
30세 이후부터 인지능력이 저하되고 뇌세포는 감퇴하기 시작하며, 지속적인 스트레스, 과도한 알코올 섭취, 약물, 수면 부족 및 우울 등은 뇌세포의 파괴를 증진시켜 기억력을 떨어뜨릴 수 있다. 인지능력의 저하는 지적기능이 정상적이지 못하고 사회활동을 힘드게 하며, 이러한 기억력, 인지능력의 저하로 나타나는 가장 대표적인 질환은 흔히 치매로 나타난다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 인지기능 저하와 관련된 가장 흔한 질병으로, 대개 만성적이고 진행성으로 나타나며, 점진적인 기억, 판단, 언어능력 등 지적 기능의 감퇴와 일상생활능력, 인격, 행동양상의 장애를 보인다. AD의 주요한 신경병리 소견은 해마와 피질에 두 가지 단백질이 응집하여 침착되는 것으로, 신경세포 밖에는 아밀로이드베타단백(amyloid beta protein, Aß)으로 구성된 노인반(senile plaque, SP)이, 신경세포 안에는 과인산화된 타우단백질로 이루어진 신경섬유농축제(neurofibrillary tangle, NFT)가 축적된다. AD의 발병 원인과 기전에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀진 바 없으며, 신경전달물질인 아세틸콜린의 합성 감소, Aß의 침착, 타우(Tau)단백의 과인산화로 인한 신경세포의 손상이 주된 원인으로 알려져 있다. 이외에도 apoE 유전자, α-synuclein 단백질의 변화, 산화적 스트레스 또는 노화에 따른 미엘린(myelin)의 파괴 등도 뇌세포 손상 및 AD 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
AD 환자의 뇌조직을 관찰해 보면 콜린성 신경의 손상이 심각하게 일어난 것이 확인되는데, 이와 같이 AD의 원인을 콜린성 신경의 손상에 맞추어 설명하는 설을 콜린 가설(Cholinergic Hypothesis in Alzheimer's disease)이라 하며, 최근 이를 바탕으로 하여 아세틸콜린의 기능저하를 유도하는 아세틸콜린에스터라제의 활성을 저해시키려는 시도가 많이 이루어지고 있다. 현재 AD의 치료제로 사용되는 약물은 아세틸콜린에스터라제 저해제로서 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine) 그리고 갈란타민(galantamine) 등이 있다. 이 중에 가장 최근에 FDA의 승인을 받아 사용되는 것은 갈란타민이다. 갈란타민은 아세틸콜린의 분해를 막아 시냅스에서의 아세틸콜린 농도를 유지시킴으로써 저하된 인지기능을 개선시키는 효과를 나타낸다. 하지만 갈란타민은 독성과 부작용으로 그 효능과 안전성이 의심되고 있으며, 이와 같은 부작용은 대중들의 의심과 두려움을 높여주고 있다. 그러므로 보다 안전하고 효능이 우수한 천연 기능성 소재 개발이 요구되고 있는 실정이다.
삼채(Allium hookeri)는 동아시아의 중국 남부, 인도, 부탄, 스리랑카 등에 분포하며, 숲, 습지 및 해발 1400 내지 4200m의 초원지대에서 자란다. 뿌리 부추라고도 하며, 맛과 모양이 인삼과 비슷하다고 하여 삼채(蔘菜)라고도 하며, 쓴맛, 단맛 및 매운맛의 3가지 맛이 난다하여 삼채(三菜)라고도 한다. 식물체의 높이는 약 0.6 내지 1m이며, 삼채의 알뿌리, 잎 및 꽃을 식용 및 약용으로 이용할 수 있는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은, 인체에 부작용이 없으면서 인지능 개선 효과를 가지는 천연물 유래 성분의 약물과 건강기능식품을 개발하기 위해 노력하던 중, 삼채의 발효주정 추출물이 치매 유도 마우스의 공간 지각 능력, 단기 기억 인지능, 공간 학습 능력 및 명시적 기억능력을 향상시킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기존 화합물 치료제가 갖는 독성과 부작용의 문제가 없고 보다 인체에 안전하며, 효능이 우수한 인지능 개선 효과를 가지는 천연물 유래 성분의 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 삼채(Allium hookeri) 추출물은 공간 지각 능력, 단기 기억 인지능, 공간 학습 능력 및 명시적 기억능력을 향상시킴으로써, 상기 삼채 추출물은 인지능 개선용 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 인지능 개선 소재의 개발로 고령화 시대의 사회적 비용절감과 삶의 질 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 Y-미로 시험(Y-maze test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 각 미로에 들어간 횟수를 나타낸 도이다.
도 1a는 치매 유도 마우스 모델을 이용한 Y-미로 시험(Y-maze test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 각 미로에 들어간 횟수를 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 1b는 유전자변형마우스 모델을 이용한 Y-미로 시험(Y-maze test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 각 미로에 들어간 횟수를 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 2는 유전자변형마우스 모델을 이용한 방사형 미로 시험(radial arm maze test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 8방 미로에 도달한 횟수를 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 3은 수중 미로 시험(water maze test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 도피대에 도달하는 시간을 나타낸 도이다.
도 3a는 치매 유도 마우스 모델을 이용한 수중 미로 시험에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 도피대에 도달하는 시간을 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 3b는 유전자변형마우스 모델을 이용한 수중 미로 시험에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 도피대에 도달하는 시간을 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 4는 수동 회피 시험(passive avoidance test)에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 도피하여 탈출하는 시간을 나타낸 도이다.
도 4a는 치매 유도 마우스 모델을 이용한 수동 회피 시험에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 밝은 상자로 도피하여 탈출하는 시간을 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 4b는 치매 유도 마우스 모델을 이용한 수동 회피 시험에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)의 step-through latency time을 나타낸 그래프이다(p<0.05).
도 4c는 유전자변형마우스 모델을 이용한 수동 회피 시험에서 각 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)이 밝은 상자로 도피하여 탈출하는 시간을 나타낸 그래프이다(p<0.05).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 삼채는 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 사용할 수 있으며, 잎, 뿌리, 줄기 및 가지 등 어느 것도 이용가능하고, 바람직하게는 삼채의 뿌리를 이용할 수 있다.
상기 삼채 추출물은 통상적으로 알려진 식물 추출물의 추출방법을 사용하여 제조될 수 있고, 주정 추출, 진탕 추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물은 주정 추출을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 삼채 추출물은 추가적으로 분리, 또는 정제한 분획물, 또는 분획물질일 수 있다. 여기서, 상기 분획물, 또는 분획물질은 본 발명이 실험하여 보이는 실험예와 같이 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 용도 및 인지능 개선 용도로 사용할 수 있는 분획물, 또는 분획물질을 말하고, 또한, 본 발명 하기 실험예에서 보이는 효과와 같이, 공간 지각 능력, 단기 기억 인지능, 공간 학습 능력 및 명시적 기억능력 향상 효과를 나타낼 수 있는 바, 본원에 설명되는 삼채 추출물과 사실상 동일한 기능을 수행하는 것으로, 다만, 상술된 삼채 추출물로부터 유효성분을 함유하는 것으로 분리 정제된 것을 의미한다.
한편, 상기 분획물, 또는 분획물질은 보다 단리/정제된 형태(form)를 의미할 수도 있다. 예컨대, 삼채 식물 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 삼채 식물의 분획물 또는 분획물질에 포함되는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 삼채 추출물, 이의 분획물, 또는 이의 분획물질은 하기와 같이 수득될 수 있다.
본 발명은 삼채 식물의 전체 또는 적어도 일부를 준비하는 단계;
상기 준비된 삼채 식물의 전체 또는 적어도 일부를 용매에 적어도 일부가 침지될 수 있도록 침지시키는 단계; 및
상기 침지 단계 후, 이를 여과시켜 여액을 수득하는 단계;를 포함하는 삼채 추출물의 제조방법을 제공한다.
여기서, 상기 준비 단계는, 삼채 식물의 잎, 줄기, 뿌리 등 식물 전체, 또는 이의 일부를 절단하여 준비하고, 추가적으로 분쇄하여 준비될 수 있고, 상기 침지 단계는 용매에 상기 준비된 것의 적어도 일부가 침지되게 하되, 상기 용매는 본원에 제시되는 용매를 사용할 수 있고, 예를 들어, 예를 들어 (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, (i) 부틸아세테이트 또는 (j) 물을 추출 용매로 할 수 있다.
한편, 상기 여액 수득 단계는, 통상적인 여과 분리방법, 예를 들어 고체 성분과 액체 성분을 분리, 또는 여과하는데 사용되는 통상적인 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어, 여과지(filter paper)를 사용하여 여액과 잔류물로 분리시킬 수 있다. 또한, 여기서 여과는 1차, 2차, 또는 그 이상의 차수로 반복하여 추출되는 여과 단계일 수 있고, 잔류물로부터 바람직하게 여액으로 되도록 많은 유효성분이 추출될 수 있는 방법이 사용될 수 있다.
다른 한편, 상기 여액은 이 자체로 삼채 추출물일 수 있으나, 또 다르게는 이를 농축, 동결건조시키는 단계를 더 수행하여, 추출물을 수득할 수 있고, 이를 다시 목적하는 사용 용도에 따라, 별도의 용매에 용해, 또는 현탁시켜 사용할 수 있다. 예를 들어, 유효성분을 보다 농도 높게 수득하기 위하여, 본원에 설명되는 분획물, 또는 분획물질의 제조방법 또는 통상적인 분획물, 또는 분획물질의 제조방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 삼채 추출물은 발효 처리된 삼채를 추출하여 얻은 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 발효 처리된 삼채는 증숙과 건조를 반복한 후 24시간 추출 및 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는, 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하여 추출할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 에탄올을 이용하여 추출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 삼채 추출물은 삼채 식물을 에탄올을 이용하여 추출할 수 있고, 예를 들어 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 에탄올을 이용하여 추출할 수 있고, 바람직하게는, 50% 에탄올을 이용하여 추출할 수 있다.
한편, 본 발명의 추출방법의 추출 시간, 추출 횟수 등의 통상적으로 기술자가 용이하게 변경하여 적용할 수 있는 부분은 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 하는 것이나, 추출 시간의 경우 바람직하게는 10 내지 48시간이고, 더욱 바람직하게는 15 내지 30시간이고, 가장 바람직하게는 24시간이다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 4회 반복 추출할 수 있고, 더욱 바람직하게는 2회 반복 추출할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 삼채 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류로는 다음과 같을 수 있다. 상기 삼채 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 삼채 추출물을 함유하는 인지능 개선용 건강기능식품 조성물을 이용하여 공간 지각 능력 및 단기 기억 인지능을 향상시키고(도 1a, 1b 및 2 참조), 감소된 공간 학습 능력을 개선시키며(도 3a 및 3b 참조), 감소된 명시적 기억능력을 회복시킬 수 있으므로(도 4a, 4b 및 4c 참조), 상기 조성물은 인지능 개선 용도로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 발효 삼채( Allium hookeri ) 추출물 제조
1-1. 발효 삼채 제조
각각 1×108~9cfu/g균수의 유산균류인 Lactobacillus acidophilus MG501와 Bifidobacterium longum MG723, 장내 균류인 Enterococcus faecium MG89, Streptococcus thermophilus MG510, 효모인 Saccharomyses cerevisiae MG111의 미생물 농축분말 각각 2g을 50mL의 정제수에 넣고 실온에서 교반하여 균질화시킨 후, 무농약 재배된 성숙되기 전 녹색을 띈 상태의 감을 6개월 정도 당발효시켜 제조된 감발효원액과 삼채잎 착즙액을 1:1로 혼합하여 정제수에 20배 희석시킨 감발효액과 삼채잎착즙액의 혼합액 950mL를 혼합하여 미생물혼합액 1,000mL를 제조하였다.
건조된 삼채 뿌리 200g을 발효용 트레이에 넣고 상기 제조한 미생물혼합액 400mL에 침지시켜 실온에서 24시간 방치시킨 후, 발효조 내부 선반에 올려놓고 40℃~50℃를 유지하면서 3일 동안 1차 발효시켰으며, 1차 발효시킨 삼채 뿌리에 미생물혼합액 300mL을 스프레이로 고르게 분사한 후 실온에서 24시간 동안 방치하고 다시 발효조 내부 선반에 올려놓고 40℃~50℃를 유지하면서 3일 동안 2차 발효시킨 후, 상기 2차 발효과정을 한 번 더 반복하여 3차 발효를 시켜 발효 삼채를 제조하였다.
1-2. 발효 삼채 추출물 제조
퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과 및 인지능 저하에 관한 개선 효과를 확인하기 위해 발효 삼채(Allium hookeri)를 시료로 사용하였다. 발효 삼채는 증숙과 건조를 반복한 후 24시간 추출 및 건조한 것을 사용하였으며, 추출물은 50% 에탄올에서 24시간씩 실온에서 2회 추출하여 사용하였다. 모든 시료는 여과 후 농축 및 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea)하여 건조분말 형태로 만들어 각 실험에 사용하였고, 증거 표본(RDABR01, RDAFAH01)은 농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부에 보관하였다.
<실시예 2> 실험군 제조
2-1. 치매 유도 약물(Scopolamine)을 이용한 단기 기억 저하 모델 제조
발효 삼채의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과 및 인지능 개선 효과를 확인하기 위한 실험을 위해 마우스를 실험 동물로 선정하였다. 마우스는 C57BL/6 수컷 검정 마우스(12주령)를 사용하였고, 정상군과 치매 유도군은 임의 섭식 조건으로 무균 조건 내에서 사육하였다. 치매 유도군에 대하여 기억 손상을 유발하기 위해 행동평가시험을 수행하기 120분 전에 스코폴라민(scopolamine, Sigma Aldrich, S0929)을 몸무게 2mg/kg BW이 되도록 복강 투여하였다. 스코폴라민은 Ach(신경전달물질)와 무스카린 수용체(muscarinic receptor)의 결합을 억제하여 기억력 손상시키는 약물이다. 본 연구에 사용된 동물실험에 관련된 모든 실험과정과 절차는 농촌진흥청 국립농업과학원 동물실험윤리위원회(NAS-201906)의 규정을 준수하여 수행되었다.
2-2. 치매 유도 유전자변형마우스(C57BL/6-Tg) 모델 제조
발효 삼채의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과 및 인지능 개선 효과를 확인하기 위해 유전자변형된 실험동물(NSE-hps2*N1411)을 식품의약품안전평가원(NIFDS)에서 분양받아 사용하였다. 정상군 모델은 C57BL/6 수컷 검정 마우스를 16주령을 사용하였고, 정상군과 치매 유도군은 임의 섭식 조건으로 무균 조건 내에서 사육하였다. 사육기간 중의 식이는 일반 고형사료(중앙실험동물, Seoul, Korea)와 물을 자유롭게 섭취시켰으며, 온도 23±2℃ 및 습도 50±10%를 조절하였고, 명암주기는 12시간 단위로 조절하였다. 본 연구에서 동물실험에 관련된 모든 실험과정과 절차는 농촌진흥청 국립농업과학원 동물실험윤리위원회의(NAS-201906)의 규정에 따라 수행하였다.
2-3. 실험군 제조
인지능 개선 효과 시험은 1주간의 적응 기간을 거친 후 체중 감소가 없는 건강한 동물을 선별한 뒤, 난괴법(randomized complete block design, RCB)에 따라 5개의 실험군(정상군, 음성대조군, 양성대조군, 저농도 시료 투여군 및 고농도 시료 투여군)을 나누어 수행하였다. 정상군의 경우 치매 유도가 되지 않은 마우스를 사용하였고, 음성대조군, 양성대조군 및 시료 투여군의 경우 치매 유도 약물을 이용한 마우스 모델 또는 치매 유도 유전자변형마우스(C57BL/6-Tg)를 사용하였다. 시료 투여군은 발효 삼채 추출물을 용매(Phosphate Buffer Saline, PBS)에 녹여 150mg/kg(저농도) 또는 300mg/kg(고농도) BW 수준에서 급여하였고, 음성대조군(negative control)은 동량의 PBS만을 급여하였으며, 양성대조군(positive control)은 타크린(tacrine, Sigma-Aldrich, A3773)을 1mg/kg BW 수준에서 급여하였다. 타크린은 초기 및 중기에 알츠하이머 환자들의 뇌에서 생성되는 아세트콜린이 분해되는 것을 억제함으로써 환자의 인지기능 소실을 늦출 수 있는 약물이다. 상기 약물 및 발효 삼채 추출물은 매일 주 5회 일정한 시간에 경구 투여하였다.
<실험예 1> 발효 삼채 추출물 투여에 따른 공간 지각 능력 및 단기 기억 인지능 개선 확인
1-1. 공간 지각 능력 및 단기 기억 인지능 개선 확인을 위한 Y-미로 시험(Y-maze test)
발효 삼채 추출물의 투여에 따라 감소된 공간 지각 능력 및 단기 기억 능력이 회복되는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델 또는 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 Y-미로 시험(Y-maze test)를 각각 수행하였다. Y-미로 시험은 행동 유형 측정 방법 중 한 가지로 뇌 손상에 대한 내성 및 기능 향상을 포함하는 여러 신경 보호 메커니즘이 운동성과 관련되어 있기 때문에 가장 기본적으로 사용되는 방법으로(Nichol, K. E. 2007), 해당 시험은 마우스의 자연적인 탐색적 행동과 경향성에 의존하며 공간 작업 기억을 평가하는 가장 기초적인 시험으로 간주된다(Webster, S. J. 2014).
구체적으로, Y자형 미로는 Y자 형태로 된 3개의 통로로 이루어져 있고 각각 길이 50cm, 높이 20cm와 넓이 10cm의 흰색 플라스틱 재질로 구성되어 있고, 세 방향의 미로를 A, B 및 C 영역으로 선정하여 마우스를 한쪽 시작 지점의 끝에 놓고 각 미로에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 변경 행동력을 평가하였다. 다른 두 영역에 순차적으로 들어간 경우 1점, 한 영역에만 들어간 경우 0.5점을 부여하였다. 발명자는 학습 및 기억능력 평가 기준에 있어서 기본 조건을 수립하여 시험방법의 합리성, 정확성, 재현성을 고려하여 검증하였다.
모든 데이터는 Mean±S.E.로 나타내었고, 통계처리는 SPSS 프로그램(Statistical Package for the Science ver. 24, IBM Corp, Armonk, NY, USA)을 이용하여 One-way ANOVA를 실시한 후, p<0.05 수준에서 유의성을 표시하였다.
상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델을 이용한 Y-미로 시험 결과, 음성대조군은 반복적으로 한 영역으로 들어가는 횟수가 많았고, 시료 투여군은 각각 A, B 및 C 영역에 도달하는 점이 증가하여 평균 저농도군은 음성대조군 대비 35.4%, 고농도군은 음성대조군 대비 39.78% 증가하였다(도 1a).
또한, 상기 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 Y-미로 시험을 수행한 결과, 1분 동안 Y-미로의 세 영역에 도달한 횟수가 시료 투여군에서 유의적으로 높게 나타나 평균 저농도군은 음성대조군 대비 47.5%, 고농도군은 음성대조군 대비 21.5% 증가하였다. 저농도 시료 투여군의 경우 정상대조군에 비해서도 높은 점수를 획득하였다(도 1b).
이는, 발효 삼채 추출물을 투여할 경우 단기 기억 인지능이 개선되고, 그와 함께 감소된 공간 지각 능력도 회복되는 효과가 있음을 나타내고, 이를 바탕으로 발효 삼채 추출물이 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물로 이용될 수 있음을 제시한다.
1-2. 발효 삼채 추출물 투여에 따른 단기 기억 인지능 개선 확인을 위한 추가 시험(Radial arm maze test)
발효 삼채 추출물을 투여함에 따라 단기 기억 인지능이 개선됨을 추가적으로 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 방사형 미로 시험(radial arm maze test)를 수행하였다. 방사형 미로 시험은 단기 기억 검사를 시험하기 위한 방법으로 설치류 모델에서 널리 사용되는 8방 방사형 미로를 이용한다(Huang, J. 2007).
구체적으로, 시험에 사용된 8방 미로는 투명한 아크릴 소재로 중앙의 출발 상자(central platform)와 이것에서 방사형으로 갈라지는 8개의 동일한 주로들로 구성되어 있으며, 각 실험군들을 출발점에 놓는 순간부터 소요되는 시간(Latency; 반응 잠재기)을 측정하고 각각 8개 주로의 종착 지점까지 방문하는 횟수와 빈도수를 측정하여 이를 학습 성적의 지표로 삼았다. 동일한 주로를 2회 이상 방문하는 행동은 오류로 간주하였으며, 5분 동안 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 하였다. 실험 데이터는 상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 방사형 미로 시험을 수행한 결과, 음성대조군이 획득한 점수(5.48점)에 비하여 시료 투여군은 저농도(7.84점)와 고농도(7.57점)에서 유의적으로 높게 나타났다(도 2).
이는, 발효 삼채 추출물이 단기 기억 능력의 회복 및 개선 효과를 가진다는 것을 나타내고, 이를 바탕으로 발효 삼채 추출물이 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도로 쓰일 수 있음을 제시한다.
<실험예 2> 발효 삼채 추출물 투여에 따른 공간 학습 능력 회복 확인
발효 삼채 추출물을 투여함에 따라 공간 학습 능력 및 공간 기억 인지능 회복되는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델 또는 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 수중 미로 시험(water maze test)를 각각 수행하였다. 수중 미로 시험은 공간학습능력을 평가하기 위해 가장 선호도가 높고 명확한 행동 유형 평가 방법으로(Higaki, Akinori. 2018, Smith, S. 2000), 뇌손상으로 인해 해마가 손상된 동물은 공간학습능력에 장애가 생겨 수중미로 검사시 처리에 의한 효과를 비교할 수 있다는 선행 연구를 바탕으로(Jolkkonen, J. 2003, Jiwa, N. S. 2010), 마우스의 해마 의존성과 공간 학습 능력을 측정하기 위해 수행되었다.
구체적으로, 수중 미로 시험은 직사각형 수조와 도피대로 구성되었고, 검사 공간은 직경 42cm 및 높이 18cm이며 도피대의 높이와 직경이 10cm인 백색 아크릴로 만들어져 있다. 수조의 한쪽 도달점에 도피대를 설치하여 15cm로 물을 채우고 실험기간 동안 물의 온도는 22±3℃로 유지하며 검사자의 위치 또한 동일하게 하였다. 실험군의 마우스를 반대 구간에서 출발하게 하여, 마우스가 60초 동안 자유유영으로 도피대를 인지한 후 수영하여 도달하는 시간을 측정(second)하였다. 실험 데이터는 상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델을 이용하여 수중 미로 시험을 수행한 결과, 최종 측정시 음성대조군(25.16초)과 비교하여, 저농도 시료 투여군에서는 16.59초, 고농도 시료 투여군에서는 16.07초로 도피대를 인지한 후 도달하는 시간이 유의적 수준으로 감소하였다(도 3a). 또한 시료 투여 기간이 증가함에 따라 도피대를 인지하여 평균 탈출 잠복 시간이 정상대조군(14.75초)과 큰 차이를 나타내지 않았다.
또한, 상기 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용한 수중 미로 시험에서는 2주 간격으로 10주 동안 총 5회 측정하였으며, 음성대조군(41.57초)에 비하여 시료 투여군의 경우 도피대를 인지하여 찾아가는 시간이 평균 20.00초가 감소하였고, 특히 저농도 시료 투여군은 30.64초가 감소함으로써 월등히 유의적인 차이를 나타냈다(도 3b). 그리고, 투여기간이 증가함에 따라 마우스는 반복을 통한 학습 훈련을 통해 도피대를 찾아가는 수행력이 향상되었다.
이와 같은 실험 결과는 발효 삼채 추출물을 투여한 시료 투여군이 목적 있는 훈련을 통해 공간 인지 기억이 강화되었음을 나타내고, 이는 발효 삼채 추출물이 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료와 관련 있음을 제시한다.
<실험예 3> 발효 삼채 추출물 투여에 따른 명시적 기억 능력 향상 확인
발효 삼채 추출물을 투여함에 따라 명시적 기억 능력이 향상되는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델 또는 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용하여 수동 회피 시험(passive avoidance test)를 수행하였다. 수동 회피 실험은 어두운 곳을 선호하는 마우스의 특성을 이용한 실험으로, 기억 능력 증진 및 명시적 기억력을 평가하기 위한 일반적인 방법 중 하나이며, 기억력 상실 또는 치매를 포함한 질병의 증상을 스크리닝 하기 위해 셔틀 박스를 이용한 수동 회피 시험은 간단하고 효율적인 방법으로 많은 선행 연구에서 사용되고 있다(Shudo, K. 2004). 혐오 자극에 대한 수동 회피 반응은 혈관성 치매의 기억 손상 현상과 유사성을 갖는 것으로 보고되었고(강신정 2013, Kimura S. 2000), 기억력이 저하된 마우스의 수동 회피 반응과 해마 아세틸콜린 수준의 상관관계가 보고된 바 있다(Kimura, S. 2000).
구체적으로, 수동 회피 시험에서 어두운 상자와 밝은 상자로 이루어진 두 개의 아크릴 상자 사이에는 마우스가 이동할 수 있는 길로틴 문이 설치되어 있고, 아크릴 상자 바닥에는 스테인리스 막대가 깔려있어 발명자의 조건에 따른 전기충격을 가할 수 있는 장치가 연결되어 있다. 실험 시작 전, 각 실험군의 마우스를 어두운 상자에 10초 동안 적응하게 한 후, 밝은 상자에 조명을 통해 불빛을 비추고 길로틴 문이 열리면서 혐오자극(전기충격, 0.3 mA)을 가해 마우스가 반대편 상자로 이동하는 step through latency를 1분 내 측정한다. 또한, 밝은 상자로 이동한 마우스가 어두운 상자의 전기 기억을 기억한 후 어두운 상자로 가고 싶은 본성을 억제하다가 다시 어두운 상자로 돌아가는지를 1분 내로 측정하였으며, 그 후 움직임이 없으면 실험을 멈추었다. 실험 데이터는 상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
상기 실시예 2-1의 치매 유도 약물(scopolamine) 투여 모델을 이용하여 수동 회피 시험을 수행한 결과, 음성대조군은 혐오자극을 가하는 어두운 공간에서 밝은 공간으로 나오는 시간이 평균 8.76초였으나, 시료 투여군은 3.85초(저농도) 및 3.80초(고농도)로 음성대조군에 비해 유의적으로 명시적 기억력 개선 효과를 보여주었다(도 4a 및 4b).
또한, 상기 실시예 2-2의 치매 유도 유전자변형마우스를 이용한 수동 회피 시험에서는 발효 삼채의 명시적 기억력 증진 효과를 측정하기 위해 2주마다 수동 회피 반응을 평가하였다. 최종 측정 시, 음성대조군(8.00초)에 비해 저농도 시료 투여군(5.57초) 및 고농도 시료 투여군(5.57초)에서 유의적으로 혐오 자극을 가하는 어두운 상자로부터 밝은 상자로의 이동 시간이 감소하였다(도 4c).
이는, 발효 삼채 추출물이 명시적인 기억 능력을 향상시킬 수 있음을 제시하며, 해당 추출물이 기억력 손상을 효과적으로 예방하고 기억 기능이 해마 신경 발생과 관련성(Lee, Kwang-Sik. 2005)이 있다는 것을 보여주고, 상기 추출물이 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물로 쓰일 수 있음을 제시한다.

Claims (5)

  1. 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 삼채 추출물은 삼채의 전체 또는 적어도 일부를 용매 추출법으로 추출한 추출물이거나, 또는 상기 추출물을 추가적으로 분리, 또는 정제한 분획물, 또는 분획 물질인 것을 특징으로 하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 삼채 추출물은 발효 처리된 삼채를 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 삼채 추출물은 50% 에탄올로 추출한 것을 특징으로 하는, 인지능 개선용 건강기능식품 조성물.
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