KR102163015B1 - 오미자 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물 - Google Patents
오미자 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물, 건강기능성식품 조성물 및 의약품 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물, 건강기능성식품 조성물 및 의약품 조성물은 낮은 세포독성을 가지며, 피부의 산화 및 염증을 억제하고, 피부주름을 방지 또는 개선하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 오미자 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 외부의 물리적 손상 및 화학물질 등으로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 수행한다. 피부는 표피, 진피, 피하지방 등 3개의 층으로 구성되고 표피는 위 3개의 층 중 가장 얇은 층으로 피부의 보습과 보호를 담당하는 중요한 기능을 한다. 특히 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의해 피부가 탄력을 가지게 되며 부드럽게 되는데, 각질층의 탄력성이 유지되려면 10% 이상의 수분 함유가 필수적인 것으로 알려져 있다.
피부의 수화작용(skin hydration)은 표피에서 진피로의 삼투압에 의한 수분이동과 증발작용에 의한 표피의 수분 손실의 평형에 의해서 결정된다. 임상적으로 건성피부는 피부 표면이 건조하고 탄력이 떨어지며, 각질탈리(scaling)가 일어나기 쉽고 거칠다. 또, 가려운 증상이 나타나기도 하고 경우에 따라서는 건조증, 갈라짐 등의 증상이 동반되기도 한다. 표피의 보습수준은 각질세포간 지질, 각질층결합단백질(corneodesmosom), 천연보습인자(natural moisturizing factor: NMF)에 크게 의존한다.
피부층 중 진피는 주로 콜라겐과 엘라스틴 섬유로 이루어지는데, 이들은 피부를 지지하는 역할을 한다. 따라서 진피에 문제가 발생하면 주름이 생기고 피부탄력이 없어져서 피부노화가 진행된다. 특히, 콜라겐은 피부재생, 피부 함수율, 상처치유 및 주름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 섬유아세포로부터 생성된다. 구체적으로 콜라겐은 수분을 다량 함유할 수 있는 기능이 있어서 진피에 수분을 공급하는 역할을 하는데, 노화가 되면 콜라겐의 수분 함유 기능이 떨어지게 되어 주름이 늘어나게 된다. 콜라겐은 또한 상처가 생겼을 때 섬유아세포의 지속적인 콜라겐 생성으로 상처 부위를 메워주어 상처치유 작용도 한다. 한편, 피부 부피의 대부분을 차지하는 피부 진피 내 결체조직의 주성분은 제1 형 콜라겐(type1 collagen)으로 알려져 있고 이 제1 형 콜라겐은 섬유아세포에 의해서 생성되는 것으로 알려져 있다(J. Clin. Immunol. 2005, 25, 592).
본 발명에서는 천연물질인 오미자로부터 유래한 발효추출물을 이용하여 제1 형 콜라겐(type1 collagen)의 발현을 증가시킴으로써 피부주름을 방지 또는 개선할 수 있는 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약품 조성물을 제공하고자 하였다.
본 발명의 목적은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 의약품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부주름 방지 또는 개선용 오미자 발효추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 의약품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 오미자 추출물에 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 및 락토바실러스 하비넨시스(Lactobacillus harbinensis) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 균주를 접종하고 발효시키는 단계를 포함하는, 피부주름 방지 또는 개선용 오미자 발효추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약품 조성물은 낮은 세포독성을 가지며, 피부의 산화 및 염증을 억제하고, 피부주름을 방지 또는 개선하는 효과가 있다.
도 1은 RAW264.7 세포에 오미자 발효추출물을 처리하였을 때, 세포 생존율(A)과 NO생성(B)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 RAW264.7 세포에 오미자 발효추출물을 처리하였을 때, 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-6(A), IL-β(B) 및 TNF-α의 mRNA(C) 발현을 나타낸 그래프이다.
도 3은 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF(인간진피세포)에 처리했을 때, 제1 형 콜라겐 및 mRNA의 발현 감소가 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF 세포에 처리했을 때, 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF 세포에 처리했을 때, 프로콜라겐(procollagen) 생합성 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 오미자 발효추출물이 UVB 60mJ/cm2, 4h 조사시킨 HDF 세포 내 ERK-1/2 단백질 인산화(활성화)증가와, c-Fos 단백질 및 mRNA 발현 증가를 나타낸 것이다.
도 7은 간독성 약물에 의해 발생하는 간세포 사멸, 괴사로 인하여 발생하는 간 크기 감소 현상에 의한 간독성 실험 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 간독성 약물에 의해 발생하는 간세포 사멸, 괴사로 인하여 발생하는 간 크기 감소 현상에 의한 간독성 실험 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 GFP 형광에 근거한 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제브라피쉬의 장손상을 유발한 뒤 유출되는 형광을 측정하여 장을 통한 단백유출을 정량적으로 측정한 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 10은 제브라피쉬의 장손상을 유발한 뒤 유출되는 형광을 측정하여 장을 통한 단백유출을 정량적으로 측정한 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과(%비교)를 나타낸 것이다.
도 2는 RAW264.7 세포에 오미자 발효추출물을 처리하였을 때, 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-6(A), IL-β(B) 및 TNF-α의 mRNA(C) 발현을 나타낸 그래프이다.
도 3은 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF(인간진피세포)에 처리했을 때, 제1 형 콜라겐 및 mRNA의 발현 감소가 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF 세포에 처리했을 때, 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 오미자 발효추출물을 UVB 조사된 HDF 세포에 처리했을 때, 프로콜라겐(procollagen) 생합성 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 오미자 발효추출물이 UVB 60mJ/cm2, 4h 조사시킨 HDF 세포 내 ERK-1/2 단백질 인산화(활성화)증가와, c-Fos 단백질 및 mRNA 발현 증가를 나타낸 것이다.
도 7은 간독성 약물에 의해 발생하는 간세포 사멸, 괴사로 인하여 발생하는 간 크기 감소 현상에 의한 간독성 실험 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 간독성 약물에 의해 발생하는 간세포 사멸, 괴사로 인하여 발생하는 간 크기 감소 현상에 의한 간독성 실험 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 GFP 형광에 근거한 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제브라피쉬의 장손상을 유발한 뒤 유출되는 형광을 측정하여 장을 통한 단백유출을 정량적으로 측정한 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 10은 제브라피쉬의 장손상을 유발한 뒤 유출되는 형광을 측정하여 장을 통한 단백유출을 정량적으로 측정한 결과 및 오미자 발효추출물을 처리하였을 때 실험 결과(%비교)를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
피부층 중 진피는 주로 콜라겐과 엘라스틴 섬유로 이루어지는데, 이들은 피부를 지지하는 역할을 한다. 따라서 진피에 문제가 발생하면 주름이 생기고 피부탄력이 없어져서 피부노화가 진행된다. 특히, 콜라겐은 피부재생, 피부 함수율, 상처치유 및 주름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 섬유아세포로부터 생성된다. 구체적으로 콜라겐은 수분을 다량 함유할 수 있는 기능이 있어서 진피에 수분을 공급하는 역할을 하는데, 노화가 되면 콜라겐의 수분 함유 기능이 떨어지게 되어 주름이 늘어나게 된다. 콜라겐은 또한 상처가 생겼을 때 섬유아세포의 지속적인 콜라겐 생성으로 상처 부위를 메워주어 상처치유 작용도 한다. 한편, 피부 부피의 대부분을 차지하는 피부 진피 내 결체조직의 주성분은 제1 형 콜라겐(type1 collagen)으로 알려져 있고 이 제1 형 콜라겐은 섬유아세포에 의해서 생성되는 것으로 알려져 있다(J. Clin. Immunol. 2005, 25, 592).
한편, 제1 콜라겐은 피부재생, 피부 함수율, 상처치유 및 주름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하며, 본 발명에 따른 오미자 발효추출물은 제1 형 콜라겐(type1 collagen)의 발현을 증가시킴으로써 피부주름을 방지 또는 개선하는 효과가 있다.
이에, 본 발명의 일실시예에 따르면, 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 오미자는 오미자과의 덩굴성 낙엽수 나무에서 열리는 과일로서, 달고 쓰고 시고 맵고 짠 다섯 가지의 맛이 난다고 하여 오미자라고 불린다. 오미자는 일반적으로 혈류 개선, 고혈압, 뇌졸중, 심혈관 질환 예방, 면역력 개선, 당뇨병 예방, 간기능 개선, 원기 회복, 호흡기 질환 개선 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 오미자 발효추출물은 오미자의 다양한 기관 또는 부분으로부터 추출 및 발효하여 얻은 것일 수 있고, 일례로 오미자청 부산물을 열수 추출하여 얻은 추출물을 특정 균주로 발효한 오미자 열수 추출물의 발효물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 사용되는 특정 균주는 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 및 락토바실러스 하비넨시스(Lactobacillus harbinensis) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 균주일 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조되는 데에 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 화장수, 영양 크림, 수분 크림, 에센스, 아이 크림, 로션, 팩, 에센스와 같은 기초 화장품인 기능성 화장품을 제조하는 데 적용이 가능하다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 발효추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 오미자 발효추출물은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량% 함유되는 것일 수 있으며, 상기 중량% 범위 내에서 피부주름 방지 및 개선 효과가 있고, 상기 중량% 범위 미만에서는 피부주름 방지 및 개선 효과가 미미한 문제점이 있을 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 건강기능식품 종류에 특별한 제한은 없으며, 일례로 육류, 소시지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있고, 통상적인 의미에서 식품을 모두 포함하는 것일 수 있다.
한편, 상기 식품 조성물은 상기 발효추출물 이외에 건강기능식품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 의약품 조성물을 제공한다.
상기 의약품 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 보조제 등을 이용하여 공지의 방법으로 피부외용제, 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제 및 유제 등의 제형으로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일례로, 상기 의약품 조성물은 피부 외용제 등의 제형으로 제형화될 수 있으며 상기 발효조성물 이외에 예컨대, 수성 성분, 유성 성분, 분말 성분, 알코올류, 보습제, 중점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라 적절하게 추가로 배합하여 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 오미자 추출물에 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 및 락토바실러스 하비넨시스(Lactobacillus harbinensis) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 균주를 접종하고 발효시키는 단계를 포함하는 피부주름 방지 또는 개선용 오미자 발효추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 오미자 추출물은 오미자 부산물을 준비한 다음, 상기 오미자 부산물 중량대비(wt%) 대비 10 배의 정제수를 넣고, 70 내지 90℃ 온도 조건에서 4 내지 30 시간 동안 열수 추출한 것일 수 있다. 만약 상기 단계에서 온도 조건이 70 ℃ 미만인 경우 추출이 효과적으로 수행되기 어려운 문제점이 있을 수 있고, 온도 조건이 90℃ 초과인 경우 유효 성분이 파괴될 수 있는 문제점이 있다.
한편, 상기 발효는 OD 600 흡광도 값에서 2.0 내지 7.0의 균수에서 미생물을 접종하고, 25 내지 37 ℃ 조건에서 24 내지 72 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, OD 600 흡광도에서 2.0 보다 적은 균으로 발효를 수행하는 경우 균이 생장되지 않을 수 있는 문제점이 있고, OD 600 흡광도에서 7.0 보다 많은 균으로 발효를 수행하면 오염된 균이 접종될 수 있는 문제점이 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 발효는 24 내지 72 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로 24 시간 미만으로 발효되는 경우 발효가 효과적으로 수행되기 어려운 문제점이 있을 수 있고, 72 시간을 초과하여 발효되는 경우 오염이 문제될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 오미자 발효추출물의 제조
오미자 음료 제조에 사용하고 남은 오미자청 부산물 100 g을 준비하고, 다음으로 상기 오미자 부산물을 1000 g의 물에 혼합한 다음 80 ℃ 온도에서 24 시간 동안 열수 추출하여 오미자 열수 추출물을 수득하였다.
상기 열수 추출물에 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 균주를 접종하여 오미자 발효추출물을 수득하였다. 상기 발효 시 균수는 OD 600 흡광도 값을 4.0 내지 6.0에서 하여 접종하였고, 오미자 부산물을 10wt% 비율로 제조하고, 배양액의 1 내지 2%의 균(OD 600 흡광도 값 0.1)을 접종하고, 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액은 30분간 원심분리하여 균이 없는 상층액을 포집하였고, 포집된 상층액은 필터로 필터링(5 ㎛ pore size)하여 최종적으로 오미자 발효추출물을 수득하였다.
실시예 2. 오미자 발효추출물 30% 에탄올 추출물
실시예 1에 따라 제조된 오미자 발효추출물을 PB-600 흡착레진을 이용하여 추출하여 오미자발효 추출물 30% 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 추출 시 PB-600 흡착레진 300g을 준비하고, 오미자 발효추출물을 1000ml 흘려준다. 그리고, DW, 10% 에탄올, 30% 에탄올을 순차적으로 500ml씩 흘려주었다. 최종적으로 30% 에탄올을 흘려주어 나온 오미자 발효추출물 30% 에탄올 추출물을 수득하였다.
[실험 1. 오미자 발효추출물의 세포독성 실험]
대식 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양 기에서 2∼3회 계대 배양한 후 사용하였다.
세포 생존율 측정
세포 생존율 측정을 위해 Raw 264.7 세포를 48 well plate에 3×105 cells/well로 분주하고 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 및 1 mg/mL 농도로 처리후 2시간 뒤 LPS 1 ug/mL 처리하여 배양하였다. 24시간 뒤 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하고 4시간 반응 후 형성된 포르마잔(formazan)에 DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 녹인 뒤, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 1 (A)참조).
NO(Nitric Oxide) 측정
세포에서 생성되는 NO의 양을 측정하기 위해 Raw 264.7 세포에 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 처리하고 LPS 1 ug/mL로 자극한 다음 24시간 배양 후 세포 배양액과 동등양의 Griess 시약(1% sulfanilamine, 0.1% naphthylethylene diamine di-hydrochloride, 2% phosphoric acid)을 넣고 반응시킨 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 NaNO2 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다(도 1 (B)참조).
사이토카인(cytokine) 측정
세포에서 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β과 TNF-α의 mRNA 의 발현양을 측정하기 위해 Raw 264.7 세포에 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 처리하고 LPS 1ug/mL로 자극한 다음 24시간 배양 후 배양 상층액을 얻었다. 사이토카인 농도는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 각 사이토카인에 대한 포획 항체(capture antibody)를 96 well plate에 100 μL씩 각각 코팅한 다음, 4 ℃에서 12시간 동안 방치하였다. 이 plate를 0.05% tween-20™이 함유된 PBS(phosphate-buffered saline)로 세정 후 10% FBS를 함유한 PBS로 1시간동안 블록킹(blocking)하였다. 다시 세정한 후 얻은 세포 배양액을 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 well을 다시 세정하고 검출 항체(detection antibody)와 효소반응액(SAv-HRP reagent)을 첨가한 후 기질인 ABTS 용액을 첨가하여 반응시켰다. 발색반응은 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 측정하였다(도 2 참조).
실험 결과
실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과, 동일 농도에서의 오미자 발효추출물의 함량이 증가함에 따라 NO 생성이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 오미자 발효추출물의 농도에 비례하여 항염증 효능이 증가함을 알 수 있었다. 한편, 오미자 발효추출물의 NO 생성억제 효과는 세포독성이 없는 최대 농도 0.5mg/ml에서 87% NO 생성억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 1 참조).
한편, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β과 TNF-α의 mRNA의 발현양은 오미자 발효추출물의 농도증가에 따라 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
[실험 2. 오미자 발효추출물의 피부주름 개선인자 단백질 및 mRNA 발현 촉진 실험]
세포 증식률 및 생존율 측정
세포독성 테스트는 cell count와 MTS assay 방법으로 수행하였고, 구체적으로 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물의 농도를 25, 50, 100 ug/ml 농도로 각각 처리하고, Cell Counter로 확인하였다(도 3 (A) 및 (B) 참조).
Western blot 실험
UVB를 조사한 HDF 세포에서 제1 형 콜라겐(type1 collagen)의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 통해 확인하였다.
구체적으로 인간의 진피세포 HDF를 접종하여 24시간 후, 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을, 양성 대조군으로 EGF를 각각 첨가하여 DMEM 배지, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 파쇄하여 단백질만 추출하여 -40℃에 보관하였다. 추출된 단백질은 BCA assay를 통해 단백질을 정량 하였다. 각각의 시료의 단백질량 30g으로 희석한 후 12% SDS-겔에서 전기영동한 후 PVDF membrane 으로 옮겼다. 1차 항체(rabbit anti-aquaporins-3 antibody)와 반응시킨 후 남은 항체를 세척하여 제거하고 2차 항체(rabbit HRP-coupled anti-IgG antibody)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후 항체와 반응하여 발색 반응을 일으키는 시약(peroxidase substrate and chromogen solution)을 첨가하였다. 발색된 밴드는 이미지 분석(BioRad, Universal Hood, USA)을 통해 측정하였다(도 3 참조).
활성산소종 억제 효과 측정
세포 내 ROS 수준을 분석하기 위하여, 세포 투과성 비형광 프로브인 DCFH-DA(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate)(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)를 이용하였다. 100 μg/ml의 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물 투여 하에서 12시간 배양한 후 UVB 처리한 HDF 세포를 10 μM DCFH-DA에서 37℃ 조건으로 30분간 배양하였다. 형광현미경(Nikon Eclipse Ti inverted fluorescence microscopy)(Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포실험하였으며, 형광강도를 측정하기 위하여 세포를 PBS로 세척하고 트립신처리하여 떼어내었다. 떨어진 세포는 세척 후 1% FBS가 포함된 PBS에서 현탁되었다. 각 시료의 형광강도는 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescence microplate reader)(SpectraMax® M4, Molecular Devices, CA)를 이용하여 여기파장(excitation wavelengths) 485nm, 방출파장(emission wavelengths) 525nm에서 측정하고, 해당 단백질 농도로 표준화하였다.
그 결과, UVB 처리는 세포 내 ROS 수준을 3 내지 4배까지 증가시켰으며, 이는 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물에 의해 저해되었다. 이와 같은 UVB로 유도되는 산화 스트레스에 대한 오미자 발효추출물의 세포보호 효과는 오미자 발효추출물의 항산화 활성에 따른 결과인 것으로 판단된다(도 4 참조).
프로콜라겐 생합성 촉진 효과 측정
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, HDF 세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 60mJ/cm2, 4h 조건으로 조사한 후, 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물 100㎍/㎖을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다(도 5 참조).
RT-PCR 실험
먼저 인간진피세포인 HDF(Human dermal fibroblasts) 세포에 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 첨가하여 DMEM 배지, 37℃, 5%, CO2에서 배양하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 RNA를 추출하여 역전사 효소(reverse transcriptase) 와 cDNA(complementary DNA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 스탠다드로 GAPDH를 사용하였다. 아가로즈 겔의 전기영동을 통하여 발현되는 밴드는 이미지 분석(BioRad, Universal Hood, USA)를 통해 측정하였다(도 6 참조).
실험 결과
실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물의 농도에 따른 세포 증식률과 세포 생존율의 경우 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 한편, UVB를 조사한 조건에서 제1 형 콜라겐 및 mRNA 발현 감소가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
한편, UVB 처리는 세포 내 ROS 수준을 3 내지 4배까지 증가시키는데, 실시예 1의 오미자 발효추출물은 세포 내 ROS 수준을 저해하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 UVB로 유도되는 산화 스트레스에 대한 오미자 발효추출물의 세포보호 효과는 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물의 항산화 활성에 따른 결과인 것으로 판단된다(도 4 참조).
한편, UVB 조사된 HDF 세포에서 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물 처리 시 제1 형 콜라겐의 프로콜라겐 생합성이 촉진되는 것으로 확인되었다(도 5 참조).
또한, UVB 조사 시 실시예 1의 오미자 발효추출물을 100 ug/ml 농도로 처리한 경우, 특이적으로 UVB 60 mJ/cm2, 4h 조사시킨 HDF 세포 내 ERK-1/2 p38 MAPK, JNK-1/2, c-JUN 단백질 인산화 (활성화) 증가와 c-Fos 및 c-JUN 단백질 및 mRNA 발현 증가를 초래하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
[실험 3. 오미자 발효추출물의 간보호 및 위장관 보호 실험]
간보호 실험
간독성 약물에 의해 발생하는 간세포 사멸, 괴사로 인하여 발생하는 간의 크기가 감소하는 현상에 의거, 간독성 약물인 아세트아미노펜(acetaminophen)에 의한 간 크기 변화의 표준데이터를 바탕으로 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 전처리한 뒤에 아세트아미노펜을 처리함으로써 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물의 간보호 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 시험에 사용되는 성체 제브라피쉬는 출처가 분명하고 건강한 AB strain과 유전자 조작을 통하여 수립된 LFABP-GFP 동형 형질전환주를 이용하였다.
수정 후 48시간 LFABP-GFP 배아를 부화시킨 후 24 well 플레이트에 well 당 5 개체씩 옮겼다. Well의 볼륨은 1ml가 되도록 조정하였다. 실험은 아래의 4개 군으로 진행하였다.
대조군: 무처치군
실험군 1: 아세트아미노펜 처리군
실험군 2 - 4: 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물 전처치 후 아세트아미노펜 처리군
구체적으로, 시험하는 well 마다 처리하는 약물의 농도를 일일이 기입하였으며, 2일째 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 농도에 맞추어 첨가하였고, well 플레이트를 원형으로 조심스럽게 돌려서 첨가한 약물이 골고루 섞이도록 하였다. 다음으로 항온배양기로 옮겨서 24시간 동안 배양한 다음, 3일째 아세트아미노펜을 첨가하였다. 4일 및 5일째 형광현미경으로 관찰하여 간의 크기와 모양을 측정하였으며, 10마리에서 얻은 데이터를 평균하여 Mean±SD 결과를 얻었다(도 7 및 도 8 참조).
위장관 보호 실험
KR68766은 알부민과 결합하는 형광물질로 제브라피쉬 배아 염색 후 장손상을 유발하면 배지로 유출되는 형광을 측정하여 장을 통한 단백유출을 정량적으로 측정하고자 하였다.
구체적으로 제브라피쉬 성체는 28.5℃에서 낮 14시간, 밤 10시간의 명암으로 조절하여 사육하였다. 전날 오후에 암수 한쌍을 전용 mating cage에 넣어준 후, 다음날 오전에 수정란을 수집하엿다. 수집된 수정란은 petri dish로 옮겨 28.5℃의 배양기에서 발생시키며, 발생과정은 해부현미경을 통해 관찰하였다.
24 well 플레이트에 수정 후 3일째의 발생배아를 well 당 15마리씩 넣었다. 실험군과 대조군으로 구분한 다음, 실험군에는 실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 24시간 전처치 하였다. 다음날, KR68766으로 염색한 뒤 indomethacin을 24시간 처리하여 장손상을 유발하였다. 다음날, 배지를 취하여 형광흡광도를 측정하였다(도 9 및 10 참조).
실험 결과
실시예 2의 오미자 발효추출물의 30% 에탄올 추출물을 처치한 경우, 약물농도 10ug/ml 농도에서 아세트아미노펜에 의한 간손상 보호효과를 보이는 것으로 확인되었으며, 농도가 증가함에 따라 간 보호 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 100ug/ml 단독 처리 군에서 liver size가 감소하였고, 100ug/ml + 아세트아미노펜 군에서는 모두 치사를 보였다(도 7 및 8 참조).
위장관 보호 효과의 경우 간독성 실험과 유사하게 약물 농도가 증가함에 따라 보호 효과가 증가하였으나, 1ug/ml의 농도에서는 유의한 차이는 아니었으며, 100ug/ml 단독 처리 군에서 drug toxicity가 보이고, 100ug/ml + 인도메타신(Indomethacin) 군은 모두 치사를 보였다(도 9 및 10 참조).
따라서, 약물농도 1-10 ug/ml에서 유의한 간 및 위장관 보호 효과를 보이는 것을 판단되었다.
제형예 1. 유연화장수
유연화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 1과 같이 제조하였다.
제형예 2. 에센스
에센스의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 2와 같이 제조하였다.
제형예 3. 팩
팩의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 3과 같이 제조하였다.
이상 본 발명의 실험예에 따르면 실시예들에 따른 본 발명의 오미자 발효추출물의 경우, 피부주름과 관련된 인자로 알려진 제1 형 콜라겐(type1 collagen)의 발현을 증가시킴으로써 피부주름을 방지 또는 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이에 따라 낮은 세포독성을 가지며, 피부의 산화 및 염증을 억제하고, 피부주름을 방지하거나 또는 개선하는 효과에 의해 화장품 원료로 사용할 수 있음을 확인하였다.
Claims (11)
- 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 및 락토바실러스 하비넨시스(Lactobacillus harbinensis) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 균주를 OD600 흡광도 값에서 2.0 내지 7.0의 균수로 접종하고 25 내지 37℃ 조건에서 24 내지 72시간 동안 발효한 오미자 발효추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%로 함유하며,
상기 오미자 발효추출물은 오미자 부산물에 오미자 부산물 중량 대비 10배의 정제수를 넣고, 70 내지 90℃ 온도 조건에서 4 내지 30 시간 동안 열수 추출한 오미자 열수 추출물의 발효물인, 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 오미자 발효추출물은 간 및 위장관 보호 효과를 가지는 것인, 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
- 오미자 발효추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부주름 방지 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서,
상기 오미자 발효추출물은 간 및 위장관 보호 효과를 가지는 것인, 피부주름 방지 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 오미자 추출물에 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라카제이 톨레랑스(Lactobacillus paracasei sub. Tolerans) 및 락토바실러스 하비넨시스(Lactobacillus harbinensis) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 균주를 OD600 흡광도 값에서 2.0 내지 7.0의 균수로 접종하고 25 내지 37℃ 조건에서 24 내지 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는, 피부주름 방지 또는 개선용 오미자 발효추출물의 제조방법.
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| KR1020190001257A KR102163015B1 (ko) | 2019-01-04 | 2019-01-04 | 오미자 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물 |
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| KR20200085126A KR20200085126A (ko) | 2020-07-14 |
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| KR101770036B1 (ko) * | 2015-10-17 | 2017-08-22 | 동의대학교 산학협력단 | 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR101793703B1 (ko) * | 2016-02-29 | 2017-11-03 | (주)진셀팜 | 오미자 발효 추출물을 유효성분으로 하는 미백 및 피부개선용 조성물 |
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2019
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|---|---|---|---|---|
| KR101770036B1 (ko) * | 2015-10-17 | 2017-08-22 | 동의대학교 산학협력단 | 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 중앙일보, "항산화·항염 뛰어난 오미자, 과육보다 씨에 영양소 가득"(2013.10.29.) 1부.* |
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|---|---|
| KR20200085126A (ko) | 2020-07-14 |
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