CN109481356A - 人参花复合发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及日化及植物提取物领域，具体涉及人参花复合发酵物及应用。人参花提取物用酵母菌和乳酸菌先后发酵，发酵产物的上清液中含有的人参花复合发酵物中，稀有人参皂苷s‑Rg2、R‑Rg2、S‑Rg3、R‑Rg3、PPT、F4、Rh4、Rg5、Compound K的含量都上升了。这种人参花复合发酵物能够促进人角质细胞增殖、抑制酪氨酸酶活性、限制黑色素生成，改善皮肤色素沉着，具有美白效果。因此，人参花复合发酵物可用于制备皮肤外用剂，可作为皮肤修复、改善色素沉着或美白的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及日化及植物提取物领域，具体涉及人参花复合发酵物及应用。
背景技术
皮肤是人体重要器官，覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。
角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。因此，如果能促进角质细胞增殖，对于延缓皮肤衰老、修复皮肤功能具有重要意义。
近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物,在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
人参，别名神草、地精或者棒槌，为五加科人参属植物，学名Pnaxa ginsengC.A.Meyer，起源于古生代第三纪，是地球上的孑遗物种，为多年生宿根性草本植物。多长于海拔数百米的落叶阔叶阔叶林或针叶阔混交林下，目前仅野生于我国东北部、俄罗斯东部和朝鲜，现多为人工栽培。中国是认识和使用人参最早的国家。据史书记载，留存至今的商代甲骨文中就有参形字的记载，而最早记载人参功效的医药专著是汉代的《神农本草经》。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智之功效。除常用的人参根和根茎外，人参茎叶、花和果实皆可入药。
化妆品为体外涂抹使用，而皮肤对大多数药物是一道难以渗透的屏障，人参有效成分如人参皂苷等需经皮肤吸收才能发挥作用。有文献报告人参中常见的一些人参皂苷如Re、Rg1、Rb1等因为分子量较大，导致皮肤透过率不高。因此常常会通过生物(微生物或者酶)转化，使之生成更容易吸收并且活性更高的稀有人参皂苷。但现有方法中，稀有人参皂苷的含量提高不多，而且某些稀有人参皂苷仍无法生成。
因此，需要对现有的方法加以改进，将人参皂苷转化为稀有人参皂苷，使之获取的产物更易吸收，产物可用于制备具有抗衰老、美白活性的皮肤外用剂。
发明内容
本发明旨在提供一种人参花复合发酵物及其制备方法。
本发明还将上述人参花复合发酵物用于制备皮肤外用剂，尤其是具有抗衰老和美白功效的皮肤外用剂。
本发明技术方案为，人参花复合发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)酵母培养基中加入人参花提取物，高温高压灭菌冷却后接入酵母菌，20～35℃下培养1-10天；优选的，在25～35℃下培养2～10天；
(2)发酵结束后添加乳酸菌培养基，高温高压灭菌冷却后接入乳酸菌，30～40℃下培养1-10天；优选的，在35～40℃下培养2～10天；
(3)发酵液精滤后取上清液，并高温瞬时灭菌。
优选的，所述的酵母培养基中，人参花提取物的含量为5～50g/L。
优选的，所述的人参花提取物中，总皂苷含量15％～30％；更优选的，含人参皂苷Re 7％～15％，Rg1 0.5％～2％，Rd 2％～10％。所述的人参花提取物中，总糖含量30％～60％，总多酚含量0.5％～2％。
在步骤(1)和(2)中，分别接入对数生长期的酵母菌和乳酸菌。优选的，接种量为1～10mL/L。接种的酵母菌和乳酸菌菌液OD＝0.8～1.5，接种量为2～10mL/L。
经过酵母和乳酸菌复合发酵后，发酵液中分子量较大的人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Ro、Rd含量下降，稀有人参皂苷S-Rg2、R-Rg2、S-Rg3、R-Rg3、PPT、F4、Rh4、Rg5、Compound K的含量都有提高。
通过上述方法所制备的人参花复合发酵物，在0.05％浓度下就能够促进角质细胞增殖，并且能够有效修复皮肤划痕，具有抗衰老作用。同时，人参花复合发酵物还能够抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素生成，改善皮肤色素沉着，具有美白效果；在0.1％浓度下可以显著抑制酪氨酸酶活性。
上述人参花复合发酵物可作为活性成分，用于制备皮肤外用剂，尤其是具有抗衰老、修复皮肤功能或美白功能的皮肤外用剂，如化妆品和护肤品，类型为洁面霜、乳液、霜膏、精华液、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水等。
以人参花复合发酵物干重计，在皮肤外用剂中的用量为0.01％～10％；优选为0.05％～5％。
本发明利用酵母菌和乳酸菌的复合发酵，以人参花提取物为原料，获得人参花复合发酵物，可以减少其中大分子人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Ro、Rd的含量，生成分子量较小的稀有人参皂苷，提高转化率。并且第一步发酵后的发酵液经过灭菌处理，酵母菌菌体还可以作为乳酸菌发酵的营养物质，操作方便，节约成本。
这种复合发酵物制备方法简单，并且抗衰老和美白效果显著，可用于制备皮肤外用剂，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例3人参花提取物发酵前后对角质细胞划痕修复的影响
图2为实施例4用人参花复合发酵物处理细胞共培养模型的照片
图3为实施例4人参花复合发酵物对酪氨酸酶活抑制率
具体实施方式
实施例1人参花复合发酵物的制备
(1)配制PBD培养基，并加入人参花提取物，使人参花提取物浓度为10g/L；高温高压灭菌后冷却；所使用的人参花提取物中，总皂苷含量15％～30％，其中含人参皂苷Re 7％～15％，Rg1 0.5％～2％,Rd 2％～10％。总糖含量30％～60％，总多酚含量0.5％～2％。
(2)活化、纯化和扩大培养后生长至对数生长期的酵母菌接种至含有人参花提取物的培养基中，接种量5mL/L。
(3)摇床恒温培养，34℃下培养5天，发酵结束后加入适合乳酸菌生长的MRS培养基，高温高压灭菌后冷却；
(3)活化、纯化和扩大培养后生长至对数生长期的乳酸菌接种至发酵液中，接种量5mL/L，摇床恒温培养，38℃下培养5天；
(4)发酵液精滤后取上清液，瞬时高温灭菌后的液体中含有人参花复合发酵物。
菌株活化方法为：挑取酵母或乳酸菌菌落一环放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化方法为：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养方法为：挑取上步平板中单个菌落接种至液体培养基中，摇床培养，得到发酵菌菌液。培养至对数生长期(OD＝0.8～1.5)时可接种进行发酵。
步骤(4)产物用以下方法检测：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动性为乙腈-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷进行分析。结果如表1所示。
表1人参皂苷含量(mg/mL)
由表1可见，复合发酵后，人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Ro、Rd都有不同程度的下降，稀有人参皂苷s-Rg2、R-Rg2、S-Rg3、R-Rg3、PPT、F4、Rh4、Rg5、Compound K的含量都上升了。而酵母和乳酸菌单独发酵对人参皂苷的转化能力较弱。
实施例2人角质细胞增殖实验
角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。
发酵前后样品过滤除菌后，加入到人角质细胞培养液中(终浓度0.05％)，以不含样品的去离子水为空白对照。培养48小时后，用MTT法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，空白对照的增殖率为100％，参比空白对照，评估对人角质形成细胞增殖的影响。
表2人参花发酵前后对人原代角质形成细胞增殖的影响
由表2结果可知，人参花提取物发酵前后对人角质细胞增殖都有一定的促进作用。复合发酵的作用>乳酸菌发酵>酵母菌发酵≈人参花未发酵。
实施例3人角质细胞划痕实验
划痕试验是体外试验中最常用的检测创伤愈合的模型，其有效模拟了创伤愈合初期由细胞伸展、增殖、迁移覆盖创面的过程。因此选择该模型用以观察人参花发酵前后对表皮划痕修复能力的影响。将人原代角质细胞接种于6孔板中，细胞铺满至融合后进行划痕，并同时分别加入或不加入发酵前后样品(0.05％)，于24h后固定细胞，用吉姆萨染液染色观察，拍照并记录划痕愈合情况，以0h划痕作为对照，结果如图1所示。
由图1结果可知，采用人参花发酵液处理人原代角质细胞，可见划痕后24h后细胞已铺满一半或者全部原划痕空白处；而未处理组24h后仍留有较多空白。对角质细胞划痕修复能力：复合发酵的作用>乳酸菌发酵>酵母菌发酵>人参花未发酵。
实施例4人角质细胞和黑素细胞共培养模型实验
近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物,在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
角质形成细胞和人黑素瘤细胞共培养模型是目前体外模拟“表皮黑素单元”的公认模型，研究者得以使用更接近皮肤生理学特点的模型来开展一系列研究。实验中将培养好的原代的黑素细胞和角质形成细胞按照一定比例混合接种，共同培养，然后加入发酵前后样品(0.1％)处理一定时间，用多巴染色法检测黑素含量和酪氨酸酶的活力。结果如图2。
由共培养图片(图2)可知，人参花提取物发酵前后处理后细胞生长状态良好，无细胞毒性，且与NT相比黑素细胞颜色变浅，与阳性对照Arbutin(熊果苷)类似。由酪氨酸酶活抑制率(图3)可知酶活明显受到抑制，判断具有美白功效。同时比较不同发酵方式，认为美白功效：人参花复合发酵产物>人参花乳酸菌发酵产物>人参花酵母菌发酵产物>人参花未发酵。
Claims (9)
1.人参花复合发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)酵母培养基中加入人参花提取物，高温高压灭菌冷却后接入酵母菌，20～35℃下培养1-10天；
(2)发酵结束后添加乳酸菌培养基，高温高压灭菌冷却后接入乳酸菌，30～40℃下培养1-10天；
(3)发酵液精滤后取上清液，并高温瞬时灭菌。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母培养基中，人参花提取物的含量为5～50g/L。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的人参花提取物中，总皂苷含量15％～30％。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，分别接入对数生长期的酵母菌和乳酸菌。
5.一种人参花复合发酵物，其特征在于，通过权利要求1～4任一项所述制备方法制备。
6.权利要求5所述人参花复合发酵物在制备皮肤外用剂方面的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，人参花复合发酵物用作抗衰老、修复皮肤功能或美白的活性成分。
8.权利要求6所述的应用，其特征在于，人参花复合发酵物用作促进角质细胞增殖或抑制酪氨酸酶的活性成分。
9.权利要求6～8任一项所述的应用，其特征在于，人参花复合发酵物的用量为0.01％～10％。
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