KR20140013797A

KR20140013797A - 복합 균주를 이용한 산삼배양근 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20140013797A
Application number: KR1020120082318A
Authority: KR
Inventors: 이현용; 최운용; 서용창; 송치호; 이춘근; 임혜원
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 서원대학교산학협력단; 주식회사 세바바이오텍
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-05
Also published as: KR101440469B1

Abstract

본 발명은 복합 균주를 이용한 산삼배양근 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주를 이용하여 발효시킨 산삼배양근의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 상기 발효 추출물은은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%로 포함된 화장료 조성물; 및 (a) 산삼배양근과 MRS 배양 배지를 1:10 중량비로 혼합하는 단계; (b) 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)를 상기 배양 배지의 5 중량%의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하는 단계; (c) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 추가로 접종하고, 멸균된 MRS 배지를 250ml 첨가한 다음, 12시간 동안 배양 하는 단계; 및 (d) 멸균된 MRS 배지 250ml을 추가로 첨가한 후, 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하고 24시간 동안 배양하면서 발효시키는 단계를 포함하는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법으로 제조된 산삼배양근의 발효물은 베타-글루코시다제 효소의 활성을 증진시켜 발효물 내에 Rg3, Rh2 및 Compound K 함량을 증진시킬 수 있어 피부미백 및 주름개선을 위한 화장품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

복합 균주를 이용한 산삼배양근 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 기능성 화장료 조성물{Method of fermented wild ginseng root using complex strains and cosmetic composition comprising thereof}

본 발명은 복합 균주를 이용한 산삼배양근 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 피부미백 및 주름개선 효능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화는 크게 자연 노화(내재적 노화)와 외적인 노화로 구분되는데 자연노화는 유전적 요소에 의해 조절되는 것으로 인위적으로 조절하기 어려우나 외적인 노화는 환경적인 요인에 의해 영향을 받는 것이므로 다양한 방법에 의해 노화의 진행을 억제할 수 있다. 외적인 노화 원인 중 가장 대표적인 것은 태양광선으로부터 야기 되는 UV에 의한 광노화이다. 최근에는 급속한 산업화와 이에 의한 공기오염과 오존층의 파괴로 UV 양이 증가되고 이는 활성산소종과 같은 강력한 산화 물질들을 발생시켜서 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능저해, DNA 변이촉진, 단백질 작용 변형, 세포내 신호전달 물질들의 변형 등을 유발하여 인간에게 피부주름 생성, 색소 침착 등을 유발시켜 피부노화를 야기 시키게 된다. 그러므로 vitC, 토코페롤, 코엔자임 Q10과 같은 다양한 항산화제가 화장료 제조에 이용되는데 이는 다양한 산화물질들로부터 피부를 보호하는 목적으로 사용되고 있다. 최근에는 한약제를 포함한 다양한 식물에서 미백, 항노화, 항주름, 항산화와 같은 생리 활성 물질들이 많이 존재함이 과학적으로 규명되면서 전 세계적 트렌드인 웰빙과 로하스의 영향으로 각광을 받고 있는 천연화장품이나 한방 화장품 제조에 이들의 추출물들이 다양하게 이용되고 있다.

사포닌과 같은 기능성 성분을 다량으로 포함하고 있어 화장품 산업 분야에서 가장 이용이 높은 식물은 인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer)인데 산삼은 산에서 자연적으로 자라는 Panax ginseng C.A. Meyer이다. 오래전부터 천연산삼은 약초로서 그 효능이 인삼과 비슷하나 그 약효가 월등히 뛰어나다고 알려지면서 과다한 채굴로 점차적으로 고갈되어 희귀성으로 인해 고가일 뿐 아니라 대량생산이 불가능하여 인삼과 달리 체계적인 연구도 미비한 실정이다. 최근에는 식물 조직 배양 기술을 이용하여 대량 배양하는 연구가 행해지고 있으며 천연산삼의 부정근에서 유전적으로 97% 이상 천연 산삼과 동일한 산삼배양근이 생산되어 산업적으로 이용되고 있다. 그러나 산삼배양근은 천연산삼과 유전적으로 동일하다고는 하나 조직 배양을 통해 수득한 산삼배양근의 경우 천연 산삼에 비해 사포닌 함량이 낮고 진세노사이드 종류에 따른 함량 비율도 큰 차이가 나는 문제점이 있어 이를 개선하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.

인삼 및 산삼에 있어서 가장 대표적인 유효성분인 사포닌은 비당부 (sapogenin, aglycone)에 당류가 결합된 배당체로서 다마렌(Dammarane) 타입의 triterpene인 비당부 (protopanaxadiol과 protopanaxatriol)의 R1, R2 및 R3 위치의 알콜성 -OH기에 glucose, rhamnose, xylose, arabinose와 같은 당류가 에텔결합되어 구성되어 있어 배당체란 뜻으로 진세노사이드(ginsenoside)라 명명되고 있다. TLC에서 분리된 이동거리 순으로 oleanane계 사포닌인 ginsenoside-Ro와 diol/triol계 사포닌인 ginsenoside Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3 및 Rh2 등으로 명명되고 있으며 현재까지 약 40가지의 진세노사이드가 알려져 있다. 특히 배당체 부분의 크기가 작을수록 체내 및 피부 흡수율이 증가되는 것으로 알려지고 있다.

인삼이나 홍삼에서 Rg3와 Rg2, compoundK, ginsenoside F와 같은 배당체 부분이 작은 진세노사이드의 화장품 원료로서 주름개선 및 미백 효능이 밝혀져 있는 상태이다. 그러나 산삼배양근에 있어서는 비록 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으나 여전히 진세노사이드 함량 개선에 있어서 조사포닌 함량의 증가나 배당체 부분인 큰 Rd의 함량을 증가시킨 경우에도 최종적으로 진세노사이드의 함량이 여전히 낮은 편이다.

따라서, 산삼배양근에서 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 새로운 연구가 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2010-0079874호 한국공개특허 제2012-0010687호

따라서 본 발명의 목적은 beta-glucosidase 효소의 활성을 증진시켜 Rg3, Rh2 및 Compound K의 함량이 증가된 기능성 발효 산삼배양근 추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 목적은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주를 이용하여 발효시킨 산삼배양근의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 상기 발효 추출물은은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%로 포함된, 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 복합 균주를 이용하여 피부미백 또는 주름개선 효과를 갖는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주를 이용하여 발효시킨 산삼배양근의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 상기 발효 추출물은은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%로 포함된, 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 저분자 진세노사이드 Rh2, Rg3 및 CK를 각각 (5~7)mg/g, (4~6)mg/g 및 (3~5)mg/g의 농도로 함유하고 있는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 산삼배양근과 MRS 배양 배지를 1:10 중량비로 혼합하는 단계;

(b) 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)를 상기 배양 배지의 5 중량%의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양 하는 단계;

(c) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 추가로 접종하고, 멸균된 MRS 배지를 250ml 첨가한 다음, 12시간 동안 배양 하는 단계; 및

(d) 멸균된 MRS 배지 250ml을 추가로 첨가한 후, 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하고 24시간 동안 배양하면서 발효시키는 단계를 포함하는, 피부미백 또는 주름개선 효과를 갖는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계에서 발효 과정이 완료된 후, 건체 산삼배양근은 건체 산삼배양근과 70%의 에탄올을 1:10의 중량비로 혼합한 후 24시간 동안 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주를 이용하여 발효시킨 산삼배양근의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 상기 발효 추출물은은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%로 포함된 화장료 조성물; 및 (a) 산삼배양근과 MRS 배양 배지를 1:10 중량비로 혼합하는 단계; (b) 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)를 상기 배양 배지의 5 중량%의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하는 단계; (c) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 추가로 접종하고, 멸균된 MRS 배지를 250ml 첨가한 다음, 12시간 동안 배양 하는 단계; 및 (d) 멸균된 MRS 배지 250ml을 추가로 첨가한 후, 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하고 24시간 동안 배양하면서 발효시키는 단계를 포함하는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법으로 제조된 산삼배양근의 발효물은 베타-글루코시다제 효소의 활성을 증진시켜 발효물 내에 Rg3, Rh2 및 Compound K 함량을 증진시킬 수 있어 피부미백 및 주름개선을 위한 화장품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 복합 발효 산삼배양근의 농도에 따른 콜라겐 합성량을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)의 순차적 발효를 통해 제조된 발효 산삼배양근을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은beta-glucosidase 효소의 활성을 증진시키고 Rg3, Rh2 및 CompoundK의 함량이 증가되어 피부미백 및 주름개선에 효과가 있다는 사실을 확인함으로써, 복합균주를 이용한 발효 산삼배양근을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

최근 많은 여성들뿐만 아니라 남성의 경우에도 미용에 대한 관심이 급증하면서 피부미백, 여드름, 아토피 피부염 및 주름 개선을 위한 다양한 기능성 화장품들이 출시되고 있다. 그러나 시중에 판매되고 있는 대부분의 기능성 화장품의 경우, 합성 화합물을 사용한 제품들이 대부분인데 합성화합물이 첨가된 화장품은 피부에 따라 민감한 피부반응을 유발시킬 수 있어, 다양한 피부 부작용을 초래하는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 천연물 유래 피부에 유용한 기능성 효과를 갖는 물질을 연구하고 있던 중, 다양한 활성이 있는 산삼에 주목하였으나 천연산삼은 희귀성으로 인해 고가일 뿐 아니라 대량생산이 불가능하여 인삼과 달리 체계적인 연구도 미비한 실정이다. 최근에는 식물 조직 배양 기술을 이용하여 산삼을 대량 배양하려는 연구가 행해지고 있으나 산삼배양근은 천연산삼과 유전적으로 동일하다고는 하나 조직 배양을 통해 수득한 산삼배양근의 경우 천연 산삼에 비해 사포닌 함량이 낮고 진세노사이드 종류에 따른 함량 비율도 큰 차이가 나는 등의 문제가 있어 이를 개선하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.

인삼 및 산삼에 있어서 가장 대표적인 유효성분인 사포닌은 비당부 (sapogenin, aglycone)에 당류가 결합된 배당체로서 Dammarane 타입의 triterpene인 비당부 (protopanaxadiol과 protopanaxatriol)의 R1, R2 및 R3 위치의 알콜성 -OH기에 글루코스(glucose), 람노오스(rhamnose), 자일로오스(xylose), 아라비노스(arabinose)와 같은 당류가 에테르 결합 되어 구성되어 있어 배당체란 뜻으로 진세노사이드(ginsenoside)라 명명되고 있다. TLC에서 분리된 이동거리 순으로 oleanane계 사포닌인 ginsenoside-Ro와 diol/triol계 사포닌인 ginsenoside Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3 및 Rh2 등으로 명명되고 있으며 현재까지 약 40가지의 진세노사이드가 알려져 있다. 특히 배당체 부분의 크기가 작을수록 체내 및 피부 흡수율이 증가되는 것으로 알려지고 있다.

인삼이나 홍삼에서 Rg3와 Rg2, compoundK, 진세노사이드 F(ginsenoside F)와 같은 배당체 부분이 작은 진세노사이드의 화장품 원료로서 주름개선 및 미백 효능이 밝혀져 있는 상태이다. 그러나 산삼배양근에 있어서 비록 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으나 여전히 진세노사이드 함량이 낮은 편이다.

본 발명에서는 종래의 유전자 조작을 통한 효소의 활성 증진이 아닌 기존에 연구가 거의 되어 있지 않은 서로 다른 수종의 유산균을 복합적으로 사용하여, 발효 시 얻어지는 beta-glucosidase의 활성 시너지 효과를 통해 산삼배양근의 진세노사이드 함량이 증가됨을 확인하였다.

따라서 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)의 순차적 발효를 통해 제조된 피부미백 및 주름개선에 효과가 있는 발효 산삼배양근을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 복합 발효 산삼배양근의 제조를 위해 신균주인 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9,기탁 번호: KCCM11254P)를 먼저 배양 배지의 5%의 농도로 접종을 하여 24시간 동안 배양을 하였다. 배양 후, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 접종하였으며, 멸균된 배지를 250ml를 추가로 넣어준 다음 12시간동안 배양을 하였다. 마지막으로 초기 배양 후 36시간이 되는 시점에 멸균된 배지 250ml을 추가로 넣은 다음 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하여 24시간 배양하여 총 60시간 동안 발효를 진행 하여 본 발명의 복합 발효 산삼배양근을 제조하였다.

상기 제조된 발효 산삼배양근의 진세노사이드 함량을 측정한 결과, 저분자 진세노사이드 Rh2, Rg3, CK의 함량이 매우 높았으며 단일 균주를 이용하여 발효한 경우 얻어지는 진세노사이드 함량보다 본 발명의 복합 유산균을 이용해 발효한 경우 더 많은 양의 진세노사이드가 얻어짐을 알 수 있었다(표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 복합 발효 산삼배양근에 항산화 활성이 있는지를 알아보기 위해 복합 발효 산삼배양근 추출물의 농도별로 DPPH 프리라디칼 소거법 측정을 한 결과, 높은 라디칼 소거능이 있음을 확인하였다(표 3 참조).

복합 발효 산삼배양근의 농도를 각각 0.10%, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.0%, 2.0% 로 만들어 인간의 피부 섬유아세포 CCD986sk 배양한 뒤 대조군의 흡광도와 비교하여 섬유아세포 증식효과를 측정한 결과, 시료의 농도 의존적으로 세포 증식효과가 증가함을 확인하였고(표 4 참조), 콜라겐 합성량도 복합 발효된 산삼배양근 시료의 농도별로 증가하였다(도 1 참조). 따라서 본 발명의 복합 발효 산삼배양근에 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, 복합 발효 산삼배양근에 피부미백 효과가 있는지 알아보기 위하여 복합 발효 산삼배양근 시료 농도별로 멜라닌 합성 억제활성 및 티로시나아제 저해능을 측정한 결과, 복합 발효 산삼배양근 시료 농도 의존적으로 멜라닌 합성 억제활성 및 티로시나아제 저해능이 높아짐을 확인하였다(표 5 참조).

나아가 실제로 복합 발효 산삼배양근을 기능성 화장품으로 사용할 수 있는지를 알아보기 위해 화장수, 영양크림 및 팩의 형태로 제조하여 피부 안정성을 테스트한 결과, 피부 자극이 나타나지 않았으며 15명의 건강한 30~40대 여성 패널에게 실제 제조한 화장품을 2주정도 사용하게 한 결과 80% 정도의 패널이 본 발명의 화장품을 선호하였다.

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9) 복합 균주를 이용한 발효 산삼배양근을 항산화활성, 피부미백 및 주름개선 효과를 위한 기능성 화장료의 제조에 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 복합 균주를 이용한 발효 산삼배양근을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 복합 균주를 이용한 발효 산삼배양근 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 주름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

복합 발효 산삼배양근 추출물 제조

본 발명의 복합 발효를 위해 유산균을 MRS 배지에 배양하였다. 배양 방법은 일반적인 유산균 배양 방법으로 55%의 MRS 배지와 0.5%의 L-Cysteine hydrochloride를 첨가하여 배지를 제작하였고, 배양 온도는 37℃에서 배양하였으며, 밀봉된 형태로 최소한의 교반속도인 50~60 rpm로 배양하여 72시간동안 2L의 플라스크에서 1L 의 부피로 실험을 하였다.

본 발명의 배지에 접종할 유산균으로 신균주인 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9,기탁 번호: KCCM11254P)를 먼저 배양 배지의 5%의 농도로 접종을 하여 24시간 동안 배양을 하였다. 24시간 동안 배양을 한 후, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 접종하였으며, 멸균된 배지를 250ml를 추가로 넣어준 다음 12시간동안 배양을 하였다. 마지막으로 초기 배양 후 36시간이 되는 시점에 멸균된 배지 250ml을 추가로 넣은 다음 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하여 24시간 배양하여 총 60시간 동안 발효를 진행 하였다.

발효 시 산삼배양근과 배양 배지의 양은 전체 중량대비 1:1O의 비율로 배양을 하였으며, 발효가 끝나고 얻어진 발효액을 따로 모아두고 남은 건체 산삼배양근은 전체 중량대비 1:10의 비율로 70% 에탄올을 이용하여 24시간 동안 추출을 하였다. 상기의 얻어진 발효액과 추출액을 함께 감압 농축과 동결건조를 통해 파우더 형태로 제조하였다.

진세노사이드 함량을 측정하기 위해 식품공정에 명시되어있는 부탄올 추출법을 통해 진세노사이드 함량을 측정 하였다. 인삼 추출물 2g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 넣고 물 60ml에 녹여 분획 깔개기에 옮기고 에테르 60ml로 씻은 다음 물층을 수포화 부탄올 60ml로 3회 추출한다. 얻어진 부탄올 층의 추출액을 모두 합쳐서 물 50ml로 씻었다. 수포화 부탄올 층을 미리 향량으로 한 농축 플라스크에 옮겨 감압 농출 후 105℃에서 20분간 건조하고, 다시 데시게이타에서 30분간 식혀 무게를 달아 조사포닌양을 구하였다.

상기의 방법으로 얻어진 조사포닌에 메탄올 1ml을 가하여 용해시키고, 0.45㎛ 필터로 여과한 다음 표 1에 명시되어 있는 HPLC 조건에 따라 진세노사이드 Rh2, Rg3, CK의 함량을 측정하였다.

그 결과, 복합 발효 공정을 통해 얻어진 산삼배양근의 저분자 진세노사이드 Rh2, Rg3, CK의 함량은 각각 4.69mg/g, 6.21mg/g, 3.76mg/g 으로 저분자 진세노사이드의 합이 1%가 넘는 고농도의 추출물을 얻었으며, 또한, 각각의 단일 균주를 이용하여 발효할 경우 얻어지는 저분자 진세노사이드의 함량은 복합 유산균을 이용해 발효를 하였을 경우보다 적은 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

< 실시예 2>

항산화능 효과 측정

본 발명의 복합 발효 산삼배양근 추출물에 항산화능이 있는지 여부를 알아보기 위해 DPPH 프리라디칼 소거법을 이용하여 측정하였다.

복합 발효 된 산삼배양근을 농도별로 시료를 물에 녹인 후 1.5x10-4M/EtOH 용액 3ml을 첨가한 후, 20분간 실온에 방치후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 감소시키는 정도에 따라 라디칼소거능으로 표시하였다.

라디칼 소거능(%) = (A-B/A)x100

A:시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도

B:시료를 첨가후 흡광도

복합 발효 산삼배양근 추출물의 농도별 자유라디칼 소거능을 측정한 결과, 시료의 농도가 1%이상 될 경우 100%로 라디칼이 소거되는 것을 확인 하였으며, 0.75%의 농도만으로도 약 92%에 달하는 높은 라디칼 소거능이 있는 것을 알 수 있었다(표 3 참조).

따라서 복합 발효를 통한 산삼배양근 내부에 존재하는 고농도의 저분자 진세노사이드 Rh2, Rg3 및 CK는 뛰어난 항산화력을 가지고 있는 것으로 생각된다.

< 실시예 3>

주름개선 효과 측정

<3-1> 섬유아세포 증식 효과 측정

본 발명의 발명자들은 복합 발효 산삼배양근 추출물에 주름 개선 효과가 있는 지를 알아보기 위해, 인간의 피부 섬유아세포인 CCD986sk를 이용하여 측정하였다. 섬유아세포 CCD986sk를 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 5x10³ cell의 농도가 되도록 섬유아세포를 분주하고 우태아 혈청(FBS)이 함유된 DMEM배지에 24시간 동안 37도에서 배양시켰다. 상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 복합 발효 산삼배양근의 시료의 농도가 각각 0.10%, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.0%, 2.0% 로 만든 시료를 섬유아세포 배양 배지에 100 ㎕ 첨가한 후 CO² 인큐베이터에서 37도의 조건으로 72시간 배양한 후, 0.2% MTT용액을 각 웰에 50 씩 첨가하여 4시간동안 정치하였다. 이후 상층액을 제거하고 150 의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가한 후 10분간 진탕하여 포르마잔(formazan)을 녹였다. 이후 DMSO에서 녹은 포르마잔(formazan)을 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 대조군의 흡광도와 비교하여 섬유아세포 증식효과를 나타내었다.

세포증식효과(%)=(실험군의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도*100

그 결과, 시료의 농도 의존적으로 세포증식효과가 증가함을 알 수 있었고,농도가 1.0% 이상일 경우 약 151.2%의 높은 세포증식 효과를 보였으며 또한, 최대 시료의 양인 2.0%일 때는 약 163.8%로 가장 높은 세포증식 효과를 보임을 알 수 있었다(표 4 참조).

<3-2> 콜라겐 합성량 측정

상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 복합 발효 산삼배양근의 시료의 농도가 각각 0.10%, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.0%, 2.0% 로 만든 시료를 PBS 완충용액에 녹인 후, 섬유아세포 증식효과 측정에서 기술한 조건에서 배양된 CCD986sk 세포주의 배지를 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지로 교체한 다음 최종농도가 0-50 μg/ml 되도록 CCD986sk 세포배양 플레이트에 첨가하고 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 배양한 후 각각의 세포배양액을 채취하고 콜라겐 단백질 측정 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd, JAPAN)를 사용하여 채취한 배양액에 존재하는 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정함으로서 콜라겐 생성 증가효과를 조사하였다. 1차 콜라겐 항체를 96 웰 마이크로 플레이트에 도포시킨 후 각각의 채취된 CCD986sk 세포배양액을 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰고, 세포배양액을 제거한 후 PBS 완충용액을 사용하여 3회 세척하였다. 각 웰에 발색시약을 첨가한 후 상온에서 15분간 반응시킨 후 1N 황산용액을 가해 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 450nm 에서 흡광 값을 측정하였다. 표준용액으로부터 얻어진 표준곡선에 상기의 방법으로 얻어진 흡광 값을 대입하여 각 시료가 첨가된 CCD986sk 세포배양액에서의 콜라겐 생성량을 산출하였다. 콜라겐 생성 합성율은 아래의 계산식으로부터 얻어졌다.

콜라겐 합성 합성율 (%)=[(Ax100)/B]-100

(A:시료를 첨가한 배양액의 콜라겐 생성량, B:시료가 첨가되지 않은 배양액의 콜라겐 생성량)

복합 발효된 산삼배양근 시료의 농도별 콜라겐 합성량을 측정한 결과, 최대의 농도인 2%에서 약 68%로 가장 높은 콜라겐 합성량이 측정되었으며, 특히 시료의 농도가 1%인 경우에도 약 68%에 가까운 높은 콜라겐 합성량이 측정되는 것으로 보아 1%에서 가장 효과적인 콜라겐 합성능을 보이는 것을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 4>

피부미백 활성 측정

<4-1> 멜라닌 생성 억제 활성

본 발명의 복합 발효 산삼배양근이 피부미백에 효과가 있는지 알아보기 위하여 멜라닌 생성 억제(Melanin synthesis inhibition activity)활성실험을 하였다. 실험 쥐 유래 멜라닌세포(melanocyte)인 Clone-M3세포는 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte) 내의 소기관인 멜라닌소체(melanosome)에서 생합성되며 이는 가시광선 영역대의 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교할 수 있다. CloneM-3세포 접종 후 3일간 시료를 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 웰당 1㎖의 1N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 멜라닌성분을 녹여 나오게 하여, 가시광선 영역 대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인, 400㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.

멜라닌세포(melanocyte)인 Clon-M3 세포를 이용하여 시료 투여 시 멜라닌 생합성과 세포 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 복합 발효된 산삼배양근 시료를 농도별로 처리하고 24 시간이 지난 후, 멜라닌 생성 저해율을 측정 하였다.

그 결과, 0.1%에서 2.0% 로 갈수록 저해율이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 최종적으로 약 40%에 달하는 저해율을 보였다(표 5 참조).

<4-2> 티로시나아제 저해능 측정

본 발명의 복합 발효 산삼배양근이 피부미백에 효과가 있는지 알아보기 위하여 티로시나아제 저해능을 측정하였으며, 티로시나아제(Tyrosinase)억제효과는 dopachrome방법을 이용하여 측정하였다. 150㎕의 mushroom tyrosinase, 225㎕의 2.5mM L-tyrosine, 225㎕의 0.4M hepesbuffer(pH 6.8), 그리고 300㎕의 에탄올용액 혹은 시료 (1㎎/㎖)용액을 섞은 후 배양 전과 15분간 배양 후 각각의 흡광도를 475㎚에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다. 티로시나아제의 억제 정도는 다음과 같이 계산하였다.

티로시나아제 억제(%)=(D-C)-(B-A)/(D-C)×100

(여기서, A와 B는 각각 시료가 첨가된 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이며, C와 D는 각각 시료를 넣지 않은 용액 (기준 용액)의 배양 전과 배양 후의 흡광도이다. 이들 티로시나아제 억제효과는 100으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다.)

티로시나아제의 억제 정도를 계산한 결과, 최종적으로 약 21%의 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 멜라닌 합성 저해능과 마찬가지로 복합 발효 산삼배양근의 농도가 높아질수록 활성이 증진되는 경향을 보였다(표 5 참조).

< 실시예 5>

화장품 제형의 제조

<5-1> 유연화장수( skin )

본 발명의 발효 산삼배양근 추출액 또는 발효액을 전체 중량대비 0.001-20% 로 함유한 영양화장수(lotion)를 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.

<5-2> 영양화장수( lotion )

<5-3> 영양크림

본 발명의 발효 산삼배양근 추출액 또는 발효액을 전체 중량대비 0.001-20% 로 함유한 영양크림을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.

<5-4> 팩

본 발명의 발효 산삼배양근 추출액 또는 발효액을 전체 중량대비 0.001-20% 로 함유한 팩을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.

< 실시예 6>

피부 안정성 및 피부보호 화장료 효능 시험

본 발명의 조성물에 대한 피부 안전성을 실험하기 위하여 상기 실시예5 에서 제형한 화장료 조성물을 대상으로 아래와 같은 안전성 시험을 수행하였다.

<6-1> 피부 일차 자극성 시험

등 쪽 피부의 털을 제거한 수컷 백색종 토끼의 피부에 상기 화장료 제조물을 1일 1회, 주 5회, 두께 2㎎/㎠ 이상이 되도록 도포했다. 도포는 2주간 수행하였으며, 털의 제거는 매주 최종 도포일에 수행하였다. 판정은 적용 후 24, 48, 72 시간에 일차 자극성 평정법으로 홍반 및 부종을 지표로 하여 수행하였다.

그 결과, 모든 실험 군에서 홍반 및 부종이 나타나지 않아 음성으로 판정되었다.

<6-2> 피부 누적 자극성 시험

등 쪽 피부의 털을 제거한 수컷 백색종 토끼의 피부에 상기 화장료 제조물을 1일 1회, 주 5회, 두께 2㎎/㎠ 이상이 되도록 도포했다. 도포는 2주간 수행하였으며, 털의 제거는 매주 최종 도포일에 수행하였다. 판정은, 각 도포일 및 최종 도포일의 다음날에 일차 자극성 평정법으로 홍반 및 부종을 지표로 해서 수행하였다.

그 결과, 모든 시험 군에서 제조물의 반복 도포에 의한 피부 자극성 반응은 관찰되지 않아 음성으로 판정되었다.

<6-3> 피부보호 화장료 효능 시험

15명의 건강한 30-40대 여성의 패널에게 제조된 로션과 크림을 0.5g씩 1일 2회 안면에 도포시켜 피부 미용 효과를 측정하였다. 한편 통상의 피부 미용제를 동일한 조건에서 안면에 도포시켜 피부 미용을 측정하였다. 도포기간은 2주였으며 그 후 결과를 평가하게 하였다. 10명의 패널 중 효과가 높다고 평가한 패널은 12명으로 80% 정도의 패널이 본 발명의 피부 미용제를 선호하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 및 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주를 이용하여 발효시킨 산삼배양근의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 상기 발효 추출물은은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%로 포함된, 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 저분자 진세노사이드 Rh2, Rg3 및 CK를 각각 (5~7)mg/g, (4~6)mg/g 및 (3~5)mg/g의 농도로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물.
(a) 산삼배양근과 MRS 배양 배지를 1:10 중량비로 혼합하는 단계;
(b) 락토바실러스 람노서스 HK-9(Lactobacillus rhamnosus HK-9)를 상기 배양 배지의 5 중량%의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양 하는 단계;
(c) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 추가로 접종하고, 멸균된 MRS 배지를 250ml 첨가한 다음, 12시간 동안 배양 하는 단계; 및
(d) 멸균된 MRS 배지 250ml을 추가로 첨가한 후, 비피도박테리아 롱검(Bifidobacterium Longum) 균주를 접종하고 24시간 동안 배양하면서 발효시키는 단계를 포함하는, 피부미백 또는 주름개선 효과를 갖는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 발효 과정이 완료된 후, 건체 산삼배양근은 건체 산삼배양근과 70%의 에탄올을 1:10의 중량비로 혼합한 후 24시간 동안 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 또는 주름개선 효과를 갖는 산삼배양근의 발효물을 제조하는 방법.