CN108077319B - 一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液及其制备方法 - Google Patents

一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y‑3发酵液与长枝木霉CD‑6发酵液按照1：5‑10的质量比混合配制而成；其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×106‑1.0×1010cfu/mL。此外，本发明还提供了一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法。本发明生防菌发酵液具有防治效果好、效率高、复发率低、适应环境能力强、稳定强、不易产生抗药性等多重优点，是生物防治的首选，对提高果树腐烂病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌复发、保护环境具有重要意义。

Description

一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液及其制备方法
技术领域
本发明属于果树病虫害防治技术领域，具体涉及一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液及其制备方法。
背景技术
腐烂病是一种果树的主要枝干病害，在世界各地均有发生。多年来腐烂病在各地大量蔓延，是危害我国果林业的头等病害，被称为果树的癌症。果树腐烂病主要是由真菌引起的病害，该病菌属于弱寄生菌，主要通过伤口侵入，也可从枝干的皮孔和芽眼等处侵入。生长健壮、抗病能力强的树，病菌可潜伏相当长的时间不发病；而树势弱、抗病能力差的树，发病迅速，很快引起树皮腐烂。腐烂病是一种毁灭性的病害，腐烂病发生严重的果园，很可能会造成树体病疤累累，枝干残缺不全，甚至造成死树和毁园。
当前，生产上主要使用化学药剂防治果树腐烂病。然而，长期大量使用化学药剂不仅使果园生态环境恶化并给食品安全带来极大隐患，而且容易导致腐烂病菌抗药性菌株的出现。生物防治技术作为一种安全有效的防治措施越来越受到人们的关注。国内外学者先后报道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)、螺旋毛壳(Chaetomiumspirale)、内生放线菌、链霉菌等对苹果树腐烂病菌具有拮抗作用。目前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌(Agrobacteriumradiobacter)等，但是现有的生防菌在实际应用过程中应用范围较为单一，菌种间的拮抗作用较强，抗菌谱较窄，防效较低，在工业化应用和环境适应性、抗逆性等方面现有产品也存在诸多不足，限制了生防菌在果树腐烂病方面的广泛应用，因此，极有必要开发出新的生防菌，使其能够满足果树腐烂病防治的需要。
发明内容
本发明提供了一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，解决了现有技术中生防菌应用范围较为单一，菌种间的拮抗作用较强，抗菌谱较窄，防效较低，在工业化应用和环境适应性、抗逆性等方面存在诸多不足，限制了生防菌在果树腐烂病方面广泛应用的问题。
本发明中用到的两种菌株分别为：
梅奇酵母Y-3(Metschnikowia zizyphicola Y-3)：保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO.M2016564，保藏日期：2016年10月17日。
长枝木霉CD-6(Trichoderma longibrachiatum)：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5395，保藏日期：2011年10月26日。
本发明的第一个目的是提供一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：5-10的质量比混合配制而成；
其中，所述生防菌发酵液中菌落总数为1.0×106-1.0×1010cfu/mL。
优选的，所述生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：8的质量比混合配制而成；
其中，所述生防菌发酵液中菌落总数为1.0×108cfu/mL。
本发明的第二个目的是提供一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将梅奇酵母Y-3的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，然后挑取单菌落于NYDB液体培养基中以200r/min的振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3的初始发酵液；
将长枝木霉CD-6的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，挑取单菌落于YSP液体培养基中以200r/min的振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6的初始发酵液；
步骤2，将梅奇酵母Y-3的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3发酵液；
将长枝木霉CD-6的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6发酵液；
步骤3，将步骤2中得到的梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：5-10的质量比混合，即得到所述防治果树腐烂病的生防菌发酵液。
优选的，每升所述NYDB液体培养基由以下组分制成：牛肉膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
优选的，每升所述YSP液体培养基由以下组分制成：蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明生防菌发酵液中梅奇酵母Y-3对果树腐烂病菌有显著的抑制作用，能使腐烂病菌菌丝颜色明显加深、顶端显著膨大、明显畸形、菌丝粗细不均匀、有的菌丝分支增多、部分菌丝细胞质外渗。
长枝木霉CD-6可以以果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，利于生防菌在果树腐烂病斑处长期定殖，发挥长期的生物防治作用，同时诱导自身产生多种胞外细胞壁水解酶，通过协同酶溶作用使病原菌细胞崩解，并且能够产生较强的抗菌活性物质，对果树腐烂病病原菌生长产生抑制作用，多种机制共同作用阻止果树腐烂病病原菌的生长、繁殖，大大提高了对果树腐烂病的生防效果。
本发明生防菌发酵液具有防治效果好、效率高、复发率低、适应环境能力强、稳定强、不易产生抗药性等多重优点，是生物防治的首选，对提高果树腐烂病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌复发、保护环境具有重要意义。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下面各实施例中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用原料均为市售。
实施例1
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：8的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×108cfu/mL。
包括以下步骤：
步骤1，将梅奇酵母Y-3的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，然后挑取单菌落于NYDB液体培养基中以200r/min的振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3的初始发酵液；
将长枝木霉CD-6的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，挑取单菌落于YSP液体培养基中以200r/min的振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6的初始发酵液；
步骤2，将梅奇酵母Y-3的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3发酵液；
将长枝木霉CD-6的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6发酵液；
步骤3，将步骤2中得到的梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：8的质量比混合，即得到防治果树腐烂病的生防菌发酵液。
实施例2
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：5的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×106cfu/mL。
制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1中配方换成实施例2的。
实施例3
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：10的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×1010cfu/mL。
制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1中配方换成实施例3的。
实施例4
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：9的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×1010cfu/mL。
制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1中配方换成实施例4的。
实施例5
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：7的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×109cfu/mL。
制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1中配方换成实施例5的。
实施例6
一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：6的质量比混合配制而成；
其中，生防菌发酵液中菌落总数为1.0×107cfu/mL。
制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1中配方换成实施例6的。
需要说明的是，每升NYDB液体培养基由以下组分制成：牛肉膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
进一步需要说明的是，每升YSP液体培养基由以下组分制成：蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
下面结合防治果树腐烂病的生防菌发酵液在果树腐烂病防治中的应用来对本发明的效果做进一步的说明。
一、对果树腐烂病的防治效果
供试药剂：试验组采用本发明实施例1-6的防治果树腐烂病的生防菌发酵液，使用前用清水将实施例1-6的生防菌发酵液稀释至浓度为1mg/mL；采用涂抹无菌水作为阴性对照，涂抹0.5g/L的苯醚甲环唑溶液作为阳性对照(向接种孔中先涂抹100μL，室温晾干，再涂抹100μL，室温晾干)。
试验过程：分别挑选光滑的苹果树枝条、桃树枝条、梨树枝条，然后用4mm的打孔器打孔作为接种孔，苹果树枝条接种培养3天的苹果腐烂病菌饼(d＝4mm)，桃树枝条接种培养3天的桃树腐烂病菌饼(d＝4mm)，梨树枝条接种培养3天的梨树腐烂病菌饼(d＝4mm)；
接种完毕后用脱脂棉蘸水保湿，再用保鲜膜缠绕脱脂棉使菌饼固定在枝条上，3天后解除保湿关系，挑选病斑大小差别不大的各果树枝条进行涂药试验，每次实验处理4个病斑，重复3次，5天后调查病斑的扩展，计算扩展抑制率，具体计算公式如下：
病斑面积＝1/4×π×长径×短径；
病斑面积扩展抑制率＝(空白对照病斑面积-处理病斑面积)/空白对照面积×100％。
表1实施例1-6生防菌发酵液对苹果树腐烂病的防治效果
Figure GDA0002601549060000071
Figure GDA0002601549060000081
由表1可知，相对于阴性对照组的无菌水来说，本发明实施例1-6的生防菌发酵液对苹果树、桃树、梨树施药后病斑面积均小于8mm2，仅为阴性对照组的10％左右，对苹果树和桃树腐烂病的抑制率可达92％以上，对梨树腐烂病的抑制率可达90％以上，效果远好于阴性对照组；且本发明实施例1-6的生防菌发酵液施药后的防治效果与阳性对照组中苯醚甲环唑溶液的效果相当，说明本发明效果显著。
二、对苹果树腐烂病的田间防治
本试验设在山西省高平市石末乡侯庄村500亩苹果示范基地的苹果园内，该园内苹果树腐烂病发生严重。苹果园的面积为500亩，品种为“晋富-18”，15年树龄，每株均有苹果树腐烂病发病，发病率达100％。在苹果园内随机选取160棵有腐烂病的苹果树，随机分为8组，每组20棵，其中6组为实验组，分别涂抹实施例1-6制备出的生防菌发酵液，阴性对照组涂抹无菌水，阳性对照组涂抹浓度为0.5g/L的苯醚甲环唑溶液。
苹果树休眠期进行田间防治实验，具体操作为在苹果树病疤周围延出0.5cm处用刀割深达木质部的保护圈，然后将圈内的病皮和健皮彻底刮除，尽量使伤口形状纵长、横窄，且周边圆滑，刮掉的病组织集中烧毁。
刮除病组织后，在已暴露的木质部分别涂少量药剂(实验组涂抹施例1-6制备出的生防菌发酵液，阴性对照组涂抹无菌水，阳性对照组涂抹浓度为0.5g/L的苯醚甲环唑溶液)，涂抹完毕后稍等2-3min，待药剂渗入后，用刀刮除木质部残留的病斑褐变组织，直到褐变组织完全刮完。在刮好的病斑处分别涂抹药剂，使发酵液完全覆盖病斑并外延1.5cm，处理后每隔10天，再分别涂2次药剂，30天后测量伤口愈合面积。
表2对苹果树腐烂病田间防治效果
Figure GDA0002601549060000091
Figure GDA0002601549060000101
从表2可以看出，实施例1-6制备出的生防菌发酵液对苹果树伤口愈合有促进作用，伤口愈合面积为8cm2以上，显著高于阴性对照组，且防治后病疤复发率小于3.5％，远大于阴性对照组，和阳性对照组效果相当。
生防菌发酵液中的梅奇酵母Y-3与长枝木霉CD-6中含有能促进果树伤口愈合的物质，伤口木质部被愈伤组织完全封闭，能有效阻止腐烂病的复发。因此，在果树休眠期，采用伤口刮治结合涂抹药剂的方法，能有效防治果树腐烂病。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1-6相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种防治果树腐烂病的生防菌发酵液，其特征在于，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：5-10的质量比混合配制而成；
其中，所述生防菌发酵液中菌落总数为1.0×106-1.0×1010cfu/mL；
所述梅奇酵母Y-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2016564；
所述长枝木霉CD-6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5395。
2.根据权利要求1所述的防治果树腐烂病的生防菌发酵液，其特征在于，该生防菌发酵液由梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：8的质量比混合配制而成；
其中，所述生防菌发酵液中菌落总数为1.0×108cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的防治果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将梅奇酵母Y-3的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，然后挑取单菌落于NYDB液体培养基中以200r/min的振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3的初始发酵液；
将长枝木霉CD-6的纯菌株在PDA平板划线培养，28℃培养48h，挑取单菌落于YSP液体培养基中以200r/min的振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6的初始发酵液；
步骤2，将梅奇酵母Y-3的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养72h，得到梅奇酵母Y-3发酵液；
将长枝木霉CD-6的初始发酵菌液置于NYDB液体培养基中，然后在28℃下以200r/min振荡速度培养24h，得到长枝木霉CD-6发酵液；
步骤3，将步骤2中得到的梅奇酵母Y-3发酵液与长枝木霉CD-6发酵液按照1：5-10的质量比混合，即得到所述防治果树腐烂病的生防菌发酵液。
4.根据权利要求3所述的防治果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，其特征在于，每升所述NYDB液体培养基由以下组分制成：牛肉膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
5.根据权利要求3所述的防治果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，其特征在于，每升所述YSP液体培养基由以下组分制成：蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖10g，余量为水。
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