KR102117896B1 - 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 혈소판 활성화 경로를 억제함으로써 강력한 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 혈전증, 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 혈관질환의 예방 및 치료용 천연 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물에 관한 것이다.
혈소판은 인체에서 가장 작은 세포이다. 혈소판은 골수에서 생성되며, 혈관 및 조직에서 손상이 발생할 경우, 지혈 및 혈액 응고에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러나, 혈소판 응집이 과도하게 발생하면 혈전 형성이 일어나 혈전증, 뇌경색 및 심근경색과 같은 치명적인 질병을 유발할 수 있다.
1차 및 2차 지혈 과정은 부상 부위의 지혈을 유도하며, 1차 지혈 과정에서 혈소판의 접착 및 응집이 발생한다. 즉, 혈관벽이 손상되면 내피 아래에 있는 층이 노출되고 혈소판의 당단백질 복합체와 von willebrand 인자가 혈소판에 결합하여 혈관 콜라겐에 부착된다. 혈관에 부착된 혈소판은 ADP, 칼슘, 세로토닌 및 피브로넥틴과 같은 다양한 물질을 분비하도록 활성화되어 주변 혈소판과 결합함으로써 혈소판 플러그를 형성한다. 2차 지혈 과정에서 다음과 같이 피브린이 1차 응집된 혈소판에 엉겨 혈병이 형성된다. 혈관벽이 손상되면 혈관 내피세포에서 발현되는 물질이 혈액 속 인자 VII에 빠르게 결합하여 혈액 응고 인자를 활성화시키고, 혈액응고 연쇄반응을 거쳐 피브리노겐을 피브린으로 활성화시킨다. 결과적으로 혈소판 플러그 및 피브린 클럼프가 함께 뭉쳐 지혈 플러그를 형성함으로써 완전히 지혈된다.
그러나, 이러한 지혈 작용이 과도하게 병리학적으로 발생하면 지혈 정도에 그치지 않고 혈전이 발생할 수 있다. 이러한 현상을 혈전증이라고 한다. 혈전증은 생명을 위협하는 문제를 일으킬 수 있으며, 혈전증이 발생한 부위에서 혈류 장애(순환 장애) 및 혈관 폐색을 유발하여 폐색전증, 뇌졸중, 심근경색 및 일시적인 허혈 발작을 일으킬 수 있으며 이 경우, 항혈전 치료가 필요하다.
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Son E, Kim S-H, Yang W-K, Kim D-S, Cha J. Antiplatelet mechanism of an herbal mixture prepared from the extracts of Phyllostachys pubescens leaves and Prunus mume fruits. BMC Complement Altern Med. 2017 Dec 19;17:541.
본 발명자들은 항혈전 활성을 갖는 천연물 소재를 찾고자 노력한 결과, 산사나무 추출물이 TxA2 합성 및 분비에 대한 억제 작용을 나타내고, pSAPK/JNK 및 pp38 MAPK 경로의 하향조절, ATP/ADP 대사조절 등을 통해 혈소판 활성화 경로를 억제함으로써 우수한 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산사나무 추출물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산사나무 추출물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 산사나무 추출물은 산사나무의 용매 조추출물 및 이의 용매 분획물을 포함하며, 산사나무 추출물은 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타낸다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다
본 발명자들은 항혈전 활성을 갖는 천연물 소재를 찾고자 노력한 결과, 산사나무 추출물이 TxA2 합성 및 분비에 대한 억제 작용을 나타내고, pSAPK/JNK 및 pp38 MAPK 경로의 하향조절, ATP/ADP 대사조절 등을 통해 혈소판 활성화 경로를 억제함으로써 우수한 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
산사나무(Crataegus pinnatifida Bunge)는 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 낙엽활엽 소교목이다. 높이 3-6 m로 나무 껍질은 잿빛이고 가지에 가시가 있고 잎은 어긋나고 달걀 모양에 가까우며 길이 6-8 cm, 나비 5-6 cm로 가장자리가 깃처럼 갈라지고 밑부분은 더욱 깊게 갈라진다. 양면 맥 위에 털이 나고 가장자리에 불규칙한 톱니가 있으며 잎자루는 길이 2-6 cm이며 꽃은 5월에 흰색으로 피고 산방꽃차례에 달리며 꽃잎은 둥글며 꽃받침조각과 더불어 5개씩이다. 수술은 20개이며 암술대는 3-5개, 꽃밥은 붉은색이며 열매는 이과로서 둥글며 흰 반점이 있으며 지름 약 1.5 cm이고 9-10월에 붉은빛으로 익는다. 한국·중국·시베리아 등지에 분포한다.
본 발명의 일 양태는 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "혈전"은 생체의 혈관 내에서 혈액이 굳어진 상태를 의미하며, 혈전은 혈관내피의 손상, 혈류의 침체, 혈액성분의 변화 등에 의해서 발생하고, 이러한 혈전에 의하여 일어나는 병태를 혈전증(thrombosis)이라고 한다. 또한, 상처가 복구될 때 생체내의 복잡한 생성기작에 의하여 활성화된 트롬빈(thrombin)이 혈액 중에 존재하는 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 변화시켜 불용성의 중합체를 형성하면서 생성되는데, 피브린 단량체는 수소결합에 의하여 결집되어 부드러운 혈병(soft clot)을 형성하고 이 혈병은 여러 요인에 의하여 딱딱한 혈병(hard clot)으로 전환되어 혈전을 생성하게 된다.
본 발명의 조성물은 항혈전 활성을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 혈전 형성의 억제, 생성된 혈전의 제거, 혈소판 응집 억제 또는 혈액 응고를 억제하는 용도로 사용될 수 있다.
상기 산사나무는 산사나무의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 뿌리 또는 열매일 수 있고, 예를 들어, 뿌리일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 산사나무 뿌리 추출물은 산사나무 줄기 추출물, 산사나무 잎/줄기 추출물 및 산사나무 열매 추출물과 비교하여 혈소판 응집 억제에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.
상기 산사나무 추출물은 산사나무를 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.
상기 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide)또는 이들의 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알코올은 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 산사나무 추출물 제조에 사용되는 용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는, 상기 용매는 10% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 20% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 30% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 40% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 50% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 60% 이상 내지 100%(v/v) 미만, 또는 70% 이상 내지 100%(v/v) 미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액인 것일 수 있다.
상기 비극성 용매는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, 테트라하이드로푸란 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있으며, 바람직하게는 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산, 디에틸에테르 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산사나무 추출물은 산사나무를 메탄올 또는 에탄올을 용매로 하여 추출한 산사나무 추출물이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산사나무 추출물은 산사나무 뿌리를 메탄올을 용매로 하여 추출한 산사나무 뿌리 추출물이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 산사나무 추출물은 산사나무 열매를 에탄올을 용매로 하여 추출한 산사나무 열매 추출물이다.
상기 '추출물'은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 산사나무 추출물은 용액, 농축물 및/또는 분말 상태일 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.
즉, 산사나무 추출물은 상술한 추출 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 산사나무 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 산사나무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 농축물 및/또는 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명은 천연식물재료인 산사나무로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 산사나무 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 항혈전 활성을 나타낸다.
상기 항혈전 활성은 혈소판의 활성 및 응집을 억제함으로써 나타나는 효과이다.
본 발명의 조성물은 혈소판 활성화 경로를 억제함으로써 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타내며, 그에 따라 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 심혈관질환에 밀접하게 관련된 혈전증의 예방 및 치료용 천연 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 내 유효성분으로서 산사나무 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.1 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 99.0 중량%, 0.1 내지 90.0 중량%, 0.1 내지 80.0 중량%, 0.1 내지 70.0 중량%, 0.1 내지 60.0 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%이나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 "혈관질환"은 혈관 안쪽에 덩어리가 생기거나 혈전이 생겨서 혈액의 흐름이 막혀 나타나는 질환을 의미하며 혈전증, 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 산사나무 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 제제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 산사나무 추출물을 포함하는 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 산사나무 추출물을 함유하는 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.
본 발명의 산사나무 추출물을 함유하는 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 1 내지 50 mg/kg, 5 내지 50 mg/kg, 10 내지 50 mg/kg, 15 내지 50 mg/kg, 20 내지 50 mg/kg, 25 내지 50 mg/kg, 30 내지 50 mg/kg, 35 내지 50 mg/kg, 40 내지 50 mg/kg 또는 45 내지 50 mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
본 발명의 조성물은 혈전 형성을 수반하는 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 혈관질환은 혈전증, 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에 상기 산사나무 추출물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 산사나무 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 조성물 중의 상기 산사나무 추출물의 양은 전체 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취시에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 산사나무 추출물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
예를 들어, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 블루베리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 식품 조성물을 인체에 투여하는 경우 천연 추출물의 일반적 특성에 비추어 볼 때, 다른 합성 의약품에 비해 부작용의 염려가 없을 것으로 사료되며, 실제로 규격화된 생약 조성물에 대한 독성 시험 결과 생체에 아무런 영향이 없는 것으로 판명되었다.
본 발명은 산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 혈소판 활성화 경로를 억제함으로써 강력한 항혈소판 및 항혈전 활성을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 혈전증, 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 혈관질환의 예방 및 치료용 천연 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 처리에 의한 혈소판의 세포 생존능을 측정한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 처리에 의한 ERK1/2, p38 MAPK, SAPK/JNK의 인산화 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 p-ERK1/2 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2c는 도 2a의 p-p38 MAPK 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2d는 도 2a의 p-SAPK/JNK 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 혈소판에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 처리하고 ATP 분비 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 혈소판에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 처리하고 TxA2의 대사물인 TxB2 형성 정도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 또는 아스피린을 투여하고 꼬리 출혈 시간을 측정한 결과이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 (혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP(platelet-rich plasma, 혈소판 풍부 혈장)를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6e는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6f는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 에탄올 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6g는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6h는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 물 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6i는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 물 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7f는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 에탄올 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 에탄올을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7g는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7h는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 물 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7i는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 물 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 트롬빈) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 트롬빈) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 세척 혈소판을 이용하여 측정한 결과이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 세척 혈소판을 이용하여 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 (혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐)을 1일 1회씩 3일(50 mg/kg) 또는 5일간(100 mg/kg) 경구투여하고 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 처리에 의한 ERK1/2, p38 MAPK, SAPK/JNK의 인산화 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 p-ERK1/2 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2c는 도 2a의 p-p38 MAPK 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2d는 도 2a의 p-SAPK/JNK 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 혈소판에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 처리하고 ATP 분비 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 혈소판에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 처리하고 TxA2의 대사물인 TxB2 형성 정도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 또는 아스피린을 투여하고 꼬리 출혈 시간을 측정한 결과이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 (혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP(platelet-rich plasma, 혈소판 풍부 혈장)를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6e는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6f는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 에탄올 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6g는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6h는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 물 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 6i는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 물 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7f는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 에탄올 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 에탄올을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7g는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7h는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 물 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 7i는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 초(炒) 물 추출물(열매를 볶은 다음, 용매로 물을 처리하여 추출함)(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 트롬빈) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 잎/줄기 메탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 트롬빈) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: ADP) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 세척 혈소판을 이용하여 측정한 결과이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 열매 에탄올 추출물(혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐) 처리에 의한 혈소판의 응집 억제를 세척 혈소판을 이용하여 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 (혈소판 활성화 및 응집 유발제: 콜라겐)을 1일 1회씩 3일(50 mg/kg) 또는 5일간(100 mg/kg) 경구투여하고 혈소판의 응집 억제를 PRP를 이용하여 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
재료 및 시약
콜라겐, ADP, 트롬빈은 Chrono-Log(Havertown, PA, USA)에서 구입하였다. Thromboxane B2 ELISA, ATP detection Kit는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. 산사나무 추출물은 Korea Plant Extract Bank(Chungju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 상기 산사나무 추출물은 산사나무 뿌리, 줄기 및 열매 각각에 대하여 메탄올, 에탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 적용하여 제조한 것이다. 산사나무 잎/줄기 추출물은 산사나무 잎 및 줄기를 2:1(중량비)로 혼합하여 용매로 메탄올을 적용하여 제조하였다.
실험동물
웅성 Sprague-Dawley 랫트(250-300 g) 및 웅성 ICR 마우스(40 g)는 Orient Bio(Sungnam, Korea)에서 구입하였다. 실험동물은 실험 전 최소 1주일 동안 적응시키고, 건국대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 실험을 수행하였다. 실험동물은 물 및 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 표준 실험동물 시설에서 관리하였다.
통계학적 분석
모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였고, 통계학적 차이는 ANOVA 분석과 다중 비교를 위한 Dunnett's test(Graph Pad Prism version 5, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한 필요시 paired 또는 unpairedt test를 사용하여 분석하였다. P < 0.05 값은 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 1: 산사나무 추출물 처리에 따른 혈소판 세포 생존능 분석
산사나무 추출물에 의한 혈소판 세포 생존능 변화를 EZ-Cytox(seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 세포 생존능은 포르마잔 생성을 측정하여 확인하였다. 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 Tyrode's 버퍼에 희석하여 혈소판에 처리하고 30분 동안 배양하였다. 그 다음, EZ Cytox을 20 ul 처리하고 30분 동안 배양한 후 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
ADP는 활성화 및 응집된 혈소판으로부터 분비되는 화학 물질로 혈소판 응집을 강화시키는 역할을 하며, 조직 손상 부위의 혈관에서 노출된 내피 하(subendothelial) 콜라겐은 주변 혈소판을 포획하고 활성화시킨다. 트롬빈은 혈소판을 직접적으로 활성화시키는 효과 이외에, 피브리노겐에서 피브린으로의 전환을 포함하는 응고 경로를 다수의 부위에서 활성화시킴으로써 혈전을 형성시키는 주요 원인이다.
산사나무 뿌리 메탄올 추출물의 독성 시험을 수행한 결과, 도 1 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 0.03, 0.1, 0.3, 및 1 mg/ml을 세척한 랫트 혈소판에 30분 동안 처리하였을 때, 세포 독성이 나타나지 않았다.
| 약물 | 용량(mg/ml) | 세포 생존률(mean±SEM) |
| 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
0 | 100±0 |
| 0.03 | 95.9±13.1 | |
| 0.1 | 95.2±2.2 | |
| 0.3 | 100.2±4.9 | |
| 1 | 90.3±14.8 |
실시예 2: 산사나무 추출물의 세포 내 신호전달 조절 효과
샘플 또는 용매군을 처리한 혈소판을 콜라겐으로 자극하고 5분 동안 응집계에서 배양하였다. 세포를 원심분리하여 샘플 버퍼[(0.125 M Tris-HCl at pH 6.8, 2% SDS, 2% 
-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.02% bromophenol blue in the presence of protease inhibitors (㎍/ml:1 phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 2 μg/ml aprotinin, 1 ㎍/ml leupeptin, 및 1 ㎍/ml pepstatin A)]에 용해시킨 다음, 원심분리하였다. 단백질 농도는 BCA 어세이(PRO-MEASURE, iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)로 결정하였다. 혈소판 단백질을 10% SDS-PAGE에 분리하고, 트랜스퍼 버퍼[25 mM Tris (pH 8.5), 0.2 M glycerin, 및 20% methanol]를 이용하여 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 5% BSA 용액을 포함하는 TBS-T로 블로킹하고, 블로킹 용액에 희석한 1차 항체와 반응시켰다. HRP가 결합된 2차 항체와 반응시킨 다음, EZ-Western Femto kit(DoGen Bio, Seoul, Korea) 이용하여 멤브레인을 가시화하였다.
상기 방법을 통해 콜라겐에 의해 유발된 혈소판 활성화 및 응집에 작용하는 산사나무 뿌리 메탄올 추출물의 억제 효과에 대한 신호전달 메커니즘을 조사하였다. 다양한 세포 내 신호전달 경로 가운데 혈소판 응집에 대한 신호전달 분자로 알려진 SAPK/JNK, p38, 및 ERK1/2 MAPKS(mitogen-activated protein kinases)의 인산화 형태에 대하여 웨스턴 블롯팅 어세이를 실시하였다. 콜라겐을 이용한 응집 유도에 앞서 랫트 혈소판에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 3분 30초 동안 처리하였다.
도 2a에서 보는 바와 같이, 콜라겐을 처리한 경우, 3종류의 MAPK에 대한 인산화 형태의 단백질 발현이 증가되었다. 산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 100, 300 및 1,000 μg/ml 농도에서 농도 의존적으로 MAPKS Pathway의 주요 인산화 효소인 SAPK/JNK, p38, ERK1/2의 인산화를 감소시키는 경향을 보였다(도 2b 내지 2d, 표 2). 이러한 결과는 산사나무 뿌리 메탄올 추출물이 혈소판 응집 신호 전달 인자인 pSAPK/JNK, pp38, pERK1/2의 발현을 감소시켜 혈소판의 활성화와 응집을 억제시키는 것을 시사한다.
| 약물 | 용량(mg/ml) | phospho ERK1/2 (Fold of NC)(mean±SEM) |
phospho p38 (Fold of NC)(mean±SEM) |
phospho pSAPK/JNK (Fold of NC)(mean±SEM) |
| 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
NC | 1.0±0.0 | 1.0±0.0 | 1.0±0.0 |
| 0 | 2.2±0.6 | 1.5±0.5 | 2.5±0.4 | |
| 0.1 | 2.2±0.8 | 1.5±0.5 | 1.6±0.4 | |
| 0.3 | 1.7±0.4 | 1.1±0.3 | 1.5±0.3 | |
| 1 | 1.9±0.5 | 0.8±0.1 | 0.9±0.8 |
실시예 3: ATP 분비에 대한 산사나무 추출물의 효과
세척한 혈소판을 다양한 농도의 산사나무 뿌리 메탄올 추출물과 37℃에서 3분 동안 전배양(pre-incubation)한 다음, 콜라겐으로 5분 동안 자극시켰다. 자극 후 샘플을 원심분리하여 상등액을 수득하고 ATP 어세이 키트(Biomedical Research Service Center, Buffalo,NY, USA)를 이용하여 광도계(GloMax 20/20, Promega, Madison, USA)로 ATP 분비 정도를 측정하였다.
도 3 및 표 3에서 보는 바와 같이, 혈소판에 콜라겐(5 μg/ml)을 처리하였을 때, ATP 분비가 감소하였다. 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 전처리한 경우, 농도 의존적으로 ATP 분비 감소가 회복되었으며, 콜라겐을 처리하지 않은 그룹(NC 그룹)과 비교하여 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 0.3 mg/ml 처리한 그룹에서 ATP 분비가 현저히 증가하였다.
| 약물 | 용량(mg/ml) | ATP Concentration(nM) (mean±SEM) |
| 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
NC | 18039.7±2058.9 |
| 0 | 2220.5±1283.7 | |
| 0.03 | 2048.4±840.4 | |
| 0.1 | 7905.2±5354.4 | |
| 0.3 | 17887.7±17887.7 |
산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 혈소판에 대한 응집 억제 효과와 더불어 콜라겐에 의해 감소된 혈소판의 ATP 유출량을 농도 의존적으로 회복시켰으며, 이는 두 현상 간에 상호 의존성이 있음을 시사한다.
실시예 4: Thromboxane B
2
(TxB
2
) 형성에 대한 산사나무 추출물의 효과
산사나무 뿌리 메탄올 추출물의 전처리가 콜라겐에 의해 유도된 TxB2 생산에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 혈소판 응집 시험 완료 후 혈소판을 현탁시킨 배지에서 TxB2의 농도를 ELISA로 측정하였다.
먼저, 혈소판에 다양한 농도의 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 3분 30초 동안 처리한 후, 콜라겐(5 ug/ml)을 처리하여 자극시킨 다음 혈소판 응집 시험을 실시하였다. Ice-cold EDTA(2 mM), 및 인도메타신(indomethacin)(5 mM)을 세척한 혈소판 현탁액에 첨가하였다. TxB2 농도는 ELISA 키트(Cayman Chemical, USA)를 이용하여 측정하였다.
도 4 및 표 4에서 보는 바와 같이, 콜라겐은 TxB2 형성을 현저히 증가시켰다. 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 0.1 및 0.3 mg/ml의 농도로 처리한 경우, 콜라겐에 의해 유도된 TxB2 형성이 각각 약 30% 및 90.3% 억제되었다.
| 약물 | 용량(mg/ml) | TxB2 (% of control) (mean±SEM) |
| 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
NC | 2.1±0.2 |
| 0 | 100±27.2 | |
| 0.03 | 120.9±41.0 | |
| 0.1 | 70.6±41.8 | |
| 0.3 | 9.8±0.5 |
산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 콜라겐에 의해 증가된 혈소판의 TxB2 유출량을 농도 의존적으로 억제하였으며, 이는 산사나무 뿌리 메탄올 추출물이 TxB2의 불안정 대사전구체인 TxA2의 생성을 억제함으로써 혈소판 응집을 억제한다는 것을 시사한다.
실시예 5:
산사나무 추출물의 혈액 항응고 효과
산사나무 뿌리 메탄올 추출물이 혈액 응고 경로에 미치는 영향을 알아보기 위해 항응고제를 투여한 랫트의 혈액에서 혈액 응고 시스템의 외인성 경로 표지자인 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT) 및 피브리노겐 양을 측정하였다.
먼저, 에틸 에테르를 이용하여 랫트를 흡입 마취시키고, 20 ml 시린지로 복부 정맥으로부터 혈액을 채집하고 혈액 응고를 예방하는 3.2% 구연산 나트륨이 담겨 있는 튜브로 옮겼다. 전혈을 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 PPP(platelet poor plasma)에 산사나무 뿌리 메탄올 추출물(0.03, 0.1, 0.3 mg/ml)을 30분 동안 처리하였다. 그 후 4시간 이내에 PPP에 Ca2+ 및 인지질을 첨가하여 응고 시간 및 피브리노겐 생산량을 측정하였다.
표 5에서 확인하는 바와 같이, 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 0.03, 0.1, 및 0.3 mg/ml의 농도로 30분 처리한 혈액의 PT는 각각 20.5 ± 0.41초, 20.3 ± 0.95초, 및 20.0 ± 1.29초로 나타났으며, 대조군(21.3 ± 0.76초)과 비교하여 유의한 차이는 없었다. 산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 혈액에서 피브리노겐 양을 감소시키는 경향이 있었으나, 대조군과 비교하여 유의한 차이는 없었다.
산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 항응고제 처리된 랫트 혈액에 처리했을 때 혈액 응고계의 활성화 지표인 PT 및 피브리노겐 함량에 유의적인 변화를 유발하지 않았다. 이는 산사나무 뿌리 메탄올 추출물이 혈액응고계에 대한 조절 작용보다는 혈소판의 활성화와 응집을 억제하여 항혈전 작용을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 6: 마우스 꼬리 출혈 시간에 대한 산사나무 추출물의 효과
마우스 꼬리 출혈시간은 종전에 알려진 방법에 따라 측정하였다(Cho et al., 2008; Yuet al., 2011).
35-40 g의 웅성 ICR 마우스를 본 실험에 사용하였다. 마우스를 실험 전 24시간 동안 금식시켰다. 출혈 시간 분석을 위해 산사나무 뿌리 추출물, 열매 추출물 또는 아스피린을 5% 아라빅 검에 현탁시키고, 실험동물에 5% 아라빅 검, 산사나무 추출물(25, 50, 100 mg/kg) 또는 아스피린(30 mg/kg)을 3일 동안 하루 1회 경구투여하였다.
마지막 경구투여 1시간 후, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨(i.p., 75 mg/kg)로 마취시키고 체온을 37℃로 유지시키기 위해 가열 패드 위에 올려두었다. 마우스 꼬리 끝 3 mm 지점을 면도날로 그은 다음, 37℃로 유지시킨 식염수 용액을 담고 있는 15 ml에 담갔다. 혈류가 멈춘 시간(15초 동안 출혈이 나타나지 않았을 때)을 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다.
도 5a에서 확인하는 바와 같이, 대조군에서의 출혈 시간은 32 ± 6.5초로 나타났으며, 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 25, 50, 및 100 mg/kg 농도로 처리한 경우, 출혈 시간은 각각 61.6 ± 13.7초(P < 0.01 vs. control group), 168.4 ± 99.1초(P <0.05), 및 197.8 ± 70.4초(P <0.01)로 농도 의존적으로 증가하였다. 이 동물 모델에서 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 50 mg/kg은 30 mg/kg 아스피린과 비슷하게 출혈 시간을 증가시켰다.
도 5b에서 확인하는 바와 같이, 대조군에서의 출혈 시간은 64.0 ± 9.4초로 나타났으며, 산사나무 열매 에탄올 추출물을 50 및 100 mg/kg 농도로 처리한 경우, 출혈 시간은 각각 115.8 ± 39.7초 및 181.6 ± 49.6초로 농도 의존적으로 증가하였다.
또한, 산사나무 뿌리 메탄올 추출물 및 산사나무 열매 에탄올 추출물은 1일 1회 3일간 경구투여 시, 마우스 꼬리 말단의 절단에 의해 유발된 꼬리 출혈시간을 용량 의존적으로 증가시키고, 경구투여 후 랫트로부터 확보한 혈소판에 대한 콜라겐의 응집반응을 용량 의존적으로 감소시켰다. 이는 산사나무 추출물이 경구투여 후에도 혈소판 활성 억제 작용과 응집 억제 작용을 나타내는 것을 의미한다.
실시예 7: PRP에서 혈소판 응집에 대한 산사나무 추출물의 효과
랫트 PRP(platelet-rich plasma)는 이전에 기술된 방법에 따라 준비하였다(Eskandariyan et al., 2014; Junget al., 2002).
먼저, 체중 200-230 g의 SD 랫트를 디에틸 에테르를 이용하여 가볍게 마취시켰다. 복부 대동맥에서 6 ml의 혈액을 채취하여 3.8% 구연산 나트륨(1:9 v/v)를 포함하는 시린지에 수집하고, 상온에서 150 g의 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 수득한 상등액(PRP)을 응집 시험에 사용하였다. Tyrode 용액(pH 7.4, NaCl 134 mM, KCl 3 mM, MgCl2 2 mM, NaH2PO4 0.3 mM, NaHCO3 12 mM, EDTA 1 mM, glucose 12 mM, BSA 3.5 mg/ml)에 2.8 x 108 세포/ml이 되도록 혈소판 수를 조절하였다.
혈소판 응집은 종전에 알려진 탁도 측정 방법으로 응집측정기(Chrono-log, Havertown, USA) (Kim et al., 2011; Pyo et al., 2002)를 이용하여 측정하였다. 다양한 농도의 부위별 산사나무 추출물을 RPP에 37℃ 조건에서 3분 30초 동안 PRP에 처리하고 그 동안 1,000 rpm 조건으로 응집측정기를 이용하여 교반하였다. 그 다음, 혈소판 응집 활성화 및 응집 유발제(ADP, 콜라겐, 트롬빈)로 PRP를 자극하였다. 혈소판 응집 정도는 자극 후 5분 내 응집 곡선에 도달한 기저선 보다 높은 최대 높이를 측정하여 평가하였다.
산사나무 뿌리 추출물, 산사나무 줄기 추출물, 산사나무 잎/줄기 추출물, 산사나무 열매 추출물 또는 산사나무 열매 초(炒) 추출물(열매를 볶은 다음, 용매를 처리하여 추출함)을 0.1, 0.3 또는 1.0 mg/ml의 농도로 PRP에 처리하고, 혈소판 응집 활성화 및 응집 유발제로 ADP, 콜라겐 또는 트롬빈을 처리하여 PRP를 자극한 다음, 혈소판 응집 정도를 측정하였다.
도 6a 내지 도 6i 및 표 6에서 확인할 수 있듯이, 혈소판 활성화 및 응집 유발제로 ADP를 사용한 경우, 산사나무 뿌리, 줄기 및 잎/줄기 추출물에서 산사나무 열매 추출물 보다 혈소판 응집 억제 효과가 높게 나타났다.
| 용량(mg/ml) | 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
산사(줄기) 메탄올추출물 |
산사(잎/줄기) 메탄올추출물 |
산사(열매) 메탄올추출물 |
산사(열매) 에탄올추출물 |
산사(열매,초) 에탄올추출물 |
산사(열매) 에탄올추출물 |
산사(열매) 물추출물 |
산사(열매,초) 물추출물 |
| 0 | 65.5±1.6 | 66.8±3.1 | 67.5±1.2 | 61.3±1.8 | 68.3±2.7 | 70.8±2.8 | 68.0±3.3 | 66.5±2.4 | 67.5±3.7 |
| 0.1 | 68.8±0.9 | 66.3±6.2 | 70.0±4.2 | 71.0±3.3 | 68.8±2.5 | 65.0±3.7 | 71.3±0.5 | 70.8±0.9 | 69.8±4.7 |
| 0.3 | 49.8±3.1 | 55.5±2.2 | 59.3±2.3 | 58.3±1.9 | 61.3±1.6 | 57.5±3.1 | 58.8±2.7 | 58.3±2.3 | 52.8±2.5 |
| 1 | 31.8±3.1 | 36.8±3.4 | 25.3±2.1 | 59.3±1.2 | 52.0±3.1 | 59.5±1.8 | 56.5±4.4 | 55.0±3.5 | 58.8±3.2 |
도 7a 내지 도 7i 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, 혈소판 활성화 및 응집 유발제로 콜라겐을 사용한 경우, 산사나무 뿌리, 줄기 및 잎/줄기 추출물에서 산사나무 열매 추출물 보다 혈소판 응집 억제 효과가 높게 나타났다.
| 용량(mg/ml) | 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
산사(줄기) 메탄올추출물 |
산사(잎/줄기) 메탄올추출물 |
산사(열매) 메탄올추출물 |
산사(열매) 에탄올추출물 |
산사(열매,초) 에탄올추출물 |
산사(열매) 에탄올추출물 |
산사(열매) 물추출물 |
산사(열매,초) 물추출물 |
| 0 | 66.0±3.9 | 69.3±1.5 | 68.0±1.7 | 65.5±2.3 | 66.8±1.7 | 68.5±3.7 | 72.5±2.4 | 66.5±2.3 | 68.8±1.6 |
| 0.1 | 65.8±4.2 | 75.8±5.3 | 65.3±3.1 | 73.5±1.0 | 75.5±2.5 | 73.8±1.3 | 75.0±1.5 | 70.5±3.2 | 72.0±2.4 |
| 0.3 | 46.8±5.7 | 52.8±2.3 | 50.5±2.5 | 54.3±1.9 | 58.3±2.3 | 61.8±0.3 | 54.0±8.7 | 57.0±3..8 | 46.8±4.8 |
| 1 | 17.0±3.4 | 42.0±2.0 | 24.5±7.0 | 62.3±2.7 | 58.8±1.7 | 61.5±1.2 | 64.5±1.0 | 63.5±1.9 | 59.3±2.4 |
도 8a 내지 도 8b 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, 혈소판 활성화 및 응집 유발제로 트롬빈을 사용한 경우, 산사나무 뿌리 추출물 및 산사나무 잎/줄기 추출물에서 혈소판 응집 억제 효과가 높게 나타났다.
| 용량(mg/ml) | 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
산사(잎/줄기) 메탄올추출물 |
| 0 | 47.1±1.1 | 50.5±3.7 |
| 0.1 | 39.8±2.4 | 41.0±6.9 |
| 0.3 | 13.6±4.3 | 18.2±4.8 |
| 1 | 14.0±4.0 | 12.2±4.0 |
실시예 8: 혈소판 응집에 대한 산사나무 추출물의 효과(in vitro)
혈소판은 기존에 알려진 방법(Vascul Pharmacol. 2013 ;59(3-4):83-9.)을 이용하여 준비하였다. 먼저, 랫트 복부대동맥에 23G 주사바늘을 삽입하여 전혈을 채취한 다음, 1 ml ACD(85 mM trisodium citrate, 83 mM dextrose, and 21 mM citric acid)가 담긴 15 ml 튜브에 옮겨 담았다. 전혈 샘플을 170 g 조건으로 7분 동안 원심분리하여 PRP를 분리하고, 120 g 조건으로 7분 동안 다시 원심분리하여 남아있는 적혈구를 제거하였다. PRP를 세척버퍼로 10분 동안 세척하고 350 g에서 2회 원심분리하여 ACD 용액으로부터 혈소판을 분리하였다. 침전된 혈소판은 Tyrode's 버퍼(137 mM of NaCl, 12 mM of NaHCO3, 5.5 mM of glucose, 2 mM KCl, 1 mM of MgCl2, 0.3 mM of NaHPO4, pH7.4)에 1.8x108 cells/ml 농도가 되도록 준비하였다.
혈소판 응집은 종전에 알려진 방법을 이용하여 측정하였다(Eur J Pharmacol 2010;627:85-91.). 응집은 응집측정기(Chronolog, Havertown, PA)를 이용하여 빛 투과율을 측정함으로써 모니터링하였다. 세척한 혈소판을 1 mM CaCl2로 37℃에서 2분 동안 전배양(pre-incubation)하고, 다양한 농도의 산사나무 뿌리 추출물, 잎 추출물 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide, 0.1% 이하)를 3분 30초 동안 처리하였다. 그 다음, 혈소판 활성화 및 응집 유발제(트롬빈, ADP, 콜라겐)로 혈소판을 자극시켰다. 반응 혼합물을 250 g 조건에서 8분 동안 교반하면서 혈소판 응집을 측정하였다.
도 9a 내지 9b 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, ADP(10 μM) 또는 콜라겐(5 ㎍/ml)을 혈소판 활성화 및 응집 유발제로 사용한 혈소판 응집 시험에서 산사나무 열매 에탄올 추출물(0.1, 0.3, 및 1.0 mg/ml)은 농도 의존적으로 ADP 및 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제하였다.
| 약물 | 용량(mg/ml) | ADP 유도 세척 platelet aggregation(%) (mean±SEM) |
Collagen 유도 세척 platelet aggregation(%) (mean±SEM) |
| 산사(열매) 에탄올추출물 |
0 | 66.6±9.1 | 75.9±5.5 |
| 0.1 | 51.0±7.6 | 68.9±6.9 | |
| 0.3 | 39.6±11.3 | 58.5±9.3 | |
| 1 | 32.8±7.5 | 54.9±9.1 |
실시예 9: 혈소판 응집에 대한 산사나무 추출물의 효과(ex vivo)
생체 이용률 및 대사와 같은 약물동력학적 성질이 혈소판 활성화 및 응집에 대한 산사나무 뿌리 메탄올 추출물의 억제 효과에 영향을 미치는지 알아보기 위해 혈소판 응집 시험을 생체 외(ex vivo) 실험으로 수행하였다.
5% 아라빅 검에 현탁시킨 50 및 100 mg/kg 산사나무 뿌리 메탄올 추출물을 3일 및 5일 동안 하루 한번 랫트에 각각 투여하였다. 마지막 투여 1시간 후, 랫트 PRP를 이전에 기술된 방법에 따라 준비하였다(Eskandariyan et al., 2014; Junget al., 2002). 먼저, 체중 200-230 g의 SD 랫트를 디에틸 에테르를 이용하여 가볍게 마취시켰다. 복부 대동맥에서 6 ml의 혈액을 채취하여 3.8% 구연산 나트륨(1:9 v/v)를 포함하는 시린지에 수집하고, 상온에서 150 g의 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 수득한 상등액(PRP)을 응집 시험에 사용하였다. PPP(platelet-poor plasma, 혈소판-결핍 혈장)로 2.8 x 108 세포/ml이 되도록 혈소판 수를 조절하였다.
혈소판 응집은 종전에 알려진 탁도 측정 방법으로 응집측정기(Chrono-log, Havertown, USA) (Kim et al., 2011; Pyo et al., 2002)를 이용하여 측정하였다. 혈소판 수를 조절한 PRP를 37℃ 조건으로 유지된 응집측정기에서 1,200 rpm 조건으로 교반하면서 혈소판 응집 활성화 및 응집 유발제(콜라겐)로 PRP를 자극하였다. 혈소판 응집 정도는 자극 후 5분 내 응집 곡선에 도달한 기저선 보다 높은 최대 높이를 측정하여 평가하였다.
도 10 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, 50 및 100 mg/kg 산사나무 뿌리 메탄올 추출물은 혈소판 응집을 각각 84.75 ± 5.57% 및 77.9 ± 4.31% (P < 0.05 vs. 대조군) 유도하였고, 이는 산사나무 뿌리 메탄올 추출물이 농도 의존적으로 혈소판 응집을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
| 약물 | 용량(mg/kg) | Collagen 유도 ex vivo platelet aggregation(%) (mean±SEM) |
| 산사(뿌리) 메탄올추출물 |
0 | 93.5±6.5 |
| 50 | 89.3±3.9 | |
| 100 | 75.5±2.3 |
Claims (9)
- 산사나무(Crataegus pinnatifida Bunge) 뿌리 메탄올 추출물 또는 산사나무 잎 및 줄기의 혼합 메탄올 추출물을 포함하는 항혈전용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 산사나무 잎 및 줄기의 혼합 메탄올 추출물은 산사나무 잎 및 줄기를 2:1의 중량비로 혼합하여 추출한 것인, 항혈전용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판 응집 억제 활성을 나타내는 것인, 항혈전용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판의 활성화를 억제하는 것인, 항혈전용 약제학적 조성물.
- 산사나무(Crataegus pinnatifida Bunge) 뿌리 메탄올 추출물 또는 산사나무 잎 및 줄기의 혼합 메탄올 추출물을 포함하는 혈전증, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 산사나무(Crataegus pinnatifida Bunge) 뿌리 메탄올 추출물 또는 산사나무 잎 및 줄기의 혼합 메탄올 추출물을 포함하는 혈전증, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 삭제
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |