KR100411198B1

KR100411198B1 - 암 세포주 증식 억제제

Info

Publication number: KR100411198B1
Application number: KR10-2001-0012973A
Authority: KR
Inventors: 이형주; 김지연; 우희종; 정대균; 유리나
Original assignee: 매일유업주식회사; 이형주
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2003-12-18
Also published as: KR20020072913A

Abstract

본 발명은 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는 특정 균주의 세포질 분획을 유효 성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 제공한다. 본 발명에 따른 특정 균주의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 사용하면, 암 세포주 특히, 위암 및 대장암 세포주의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, 상기 균주를 식품 등급으로 사용할 수 있어 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 안전하게 섭취하여 항암효과를 얻을 수 있다. 또한, 세포질 분획만을 분리하여 제제화하면 되므로, 기존의 항생제를 포함하는 여러 종류의 항암제들에 비하여 생산 원가를 낮출 수 있다.

Description

암 세포주 증식 억제제{Formulation for inhibiting proliferation of tumor cell line}

본 발명은 암 세포주 증식 억제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는 특정 균주의 세포질 분획을 유효 성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제에 관한 것이다.

젖산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물이다. 젖산균은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하여 동서양을 막론하고 식품의 중요한 보존 수단으로 응용되어 왔으며, 특히, 우유, 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 이용되어 왔다. 젖산균은 이들의 대산산물인 여러 종류의 유기산에 의해 pH를 감소시키면서 식품의 보존성을 증진시키는데, 젖산 및 초산과 같은 유기산은 대부분의 미생물에 대하여 살균작용(bacteriocide)이 있기 때문이다.

최근에, 젖산균은 식품산업분야에서 많은 주목을 받고 있는데, 이러한 젖산균은 위장의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 젖산균을 섭취함으로써 건강을 증진시킬 수 있음이 보고되어 있다(Matsuzakiet al.,Int. J. Food.Microbiol., 41:133-140; Bengmart,Gut, 42:2-7; Gilliard,FEMS Microbiol.Rev., 87:175-188; Perdigonet al.,J. Diary. Sci., 70:919-926; Tejada-Simonet al.,J. Food. Prot., 62:1435-1444). 구체적으로,섭취되는 젖산균이 대장에서 종양을 억제할 수 있다는 내용이 보고된 이후로, 암과 같은 식생활과 연관된 만성적인 질병들의 치료에 있어서 젖산균의 중요성이 부각되게 되었다.

설치류에서 화학적으로 유발된 암세포가 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei)를 투여함으로써 저해되었다(Tomitaet al., Nihon Hinyoukika Gakkai, 85:655-663, 1994; Yokokura,Intestinal Flora and Human Health, 72-88, 1994). 또한, DMH(1, 2-dimethylhydrazine)로 암을 유발시킨 쥐에게 매일 생균 상태의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 10¹⁰개 세포를 섭취시킴으로써 종양이 억제되는 것을 확인하였고, 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosusGG)도 DMH로 유발시킨 종양을 효과적으로 억제시키는 것이 보고되었으며, 발암 물질로 유발시킨 대장암이 동결 건조시킨 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)과 같은 특정 비피도 균의 섭취에 의해 억제되는 것이 보고되었다(Goldinet al.,J. Natl. Cancer Inst., 64:263-265, 1980; Reddyet al.,Cancer Res., 53:3914-3918, 1993; Kulkarmiet al.,Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 207:278-293, 1994; Singhet al.,Carcinogenesis, 18:833-841, 1997; McIntoshet al.,Nutr. Cancer, 35:153-159, 1999).

더욱이, 발효된 유제품이나 젖산균이 종양 억제 기능이 있는 것으로 나타났으며, 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)가 쥐에서 DMH에 의해 유발되는 종양의 빈도를 감소시켰다(Shakelfordet al.,Nutr. Cancer5:159-1647, 1983). 락토바실러스 불가리커스에 의해 발효된 유제품은 쥐에서 DMH에 의해 유발되는 암화과정과 햄스터(hamster)에서 DEN(diethylnitrosamine)에 의해 유발되는 상부 호흡 기관의 암화과정을 억제하였다(Balanskyet al.,Cancer Lett., 147:125-137, 1999).

비피도박테리움 인판티스 균주(Bifidobacterium infantisATCC 15697)로부터 분리된 펩티도글라이칸(peptidoglycan)을 단회 피하 주사함으로써 종양(syngeneic fibrosarcoma, Meth A in Balb/c mice)이 억제되었다(Sekineet al.,Cancer Res., 45:1300-1307, 1985). 락토바실러스 헬베티쿠스 배양액으로부터 유래한 다당류 분획은 종양(sarcoma 180) 억제 효과가 있었으며, 당단백질은 자궁 경부암 세포주에서 세포 독성 효과를 보였다(Odaet al.,Agri. Biol. Chem., 47:1623-1625, 1983; Manjunathet al.,Indian Journal Exp. Biol., 27:141-145, 1989). 또한, BCG(Bacillus Calmette-Guerin)로부터 유래한 대식 세포구 활성화 물질에 의해 대식 세포 종양 세포주가 억제되었다(Ralphet al.,Nature, 249:49-51, 1974; Ralphet al.,Cancer Res., 37:546-550, 1977).

최근 개발된 많은 기능성 식품들이 신체의 면역활성이나 항암 효과를 주장하고 있다. 그 중 대표적인 것으로 발효 유제품을 들 수 있는데 유산균의 항암작용은 장내 미생물 군의 개선에 의한 발암물질의 생성억제와 장내면역 기능의 활성화에 의한 암세포 증식억제에 의한 것으로 동물실험 등에서 입증되고 있다. 여러 보고에 의하면, 열처리한 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei)는 종양과 전이암세포에서 면역력을 강화시킴으로써 항암효과를 보였으며(Hashimoto, S.et al.,Cancer Immunol. Immunother., 24:1-7, 1987; Kato, I.et al., Gann, 72:517-53, 1981; Matsuzaki, T.et al.,Cancer Immunol. Immunother., 26:209-214, 1988), 상기 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이 파쇄액 그 자체도 생체외(in vitro)에서 세포의 단백질 합성을 억제하는 능력이 있어 T-세포 백혈병(T-cell leukemia)을 억제할 수 있다고 보고된 바 있다(Katayama, Y,Kansenshogaku Zasshi, 64:781-786, 1990).

그러나, 상기 연구 결과들은 생체내에서 진행된 실험으로 종양 억제 효과는숙주 세포의 면역 자극 효과(immune stimulating effect)에 의한 것이며, 그 주된 화합물은 세포벽의 펩티도글라이칸이라 보고되고 있다. 한편, 유산균이 숙주 세포의 면역 작용을 촉진시켜 항암효과 이외에도 암세포에 대한 직접적인 세포독성효과가 있다는 것이 보고되었고, 이러한 활성의 본체는 펩티도글라이칸이라고 보고된 바 있다(Fichera, G. A., and Giese, G.,Cancer Lett., 85:93-103, 1994). 이외에도 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이의 세포벽 성분인 다당류 펩티도글라이칸이 항암 활성을 보유하고 있음이 보고되었고, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 세포벽 성분이 종양세포 증식억제 효과가 있다고 보고된 바 있다(Nomoto, K.,Biotherapy, 1:169-177, 1989; Park, S.J.et al.,Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27:8-14, 1999).

본 발명자들은 암 세포주 특히 위암 세포주 및 대장암 세포주에 대해 증식 억제 활성을 나타내는 몇몇 균주에 있어서, 균주의 어떠한 성분이 암 세포주 증식 억제 활성을 나타내는지, 예컨대, 전체 세포인지, 종래 보고된 결과처럼 균주의 세포벽을 구성하는 펩티도글라이칸인지 또는 균주내에 존재하는 세포질 분획인지 여부를 밝히기 위하여 이들 각각에 대해 암 세포주 증식 억제 효과를 조사한 결과, 종래 펩티도글라이칸 성분이 생체내 종양의 억제에 효과가 있었다고 보고된 바와 달리, 균주내에 존재하는 세포질 분획이 펩티도글라이칸보다 더 효과적으로 암 세포주의 증식을 억제하는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는 특정 균주의 세포질 분획을 유효 성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 특정 균주의 세포질 분획을 첨가한 가공식품을 제공하는 것이다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 론검 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 농도별로 위암 세포주인 SNU-C2A에 처리하여 암 세포주 생장 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2a는 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 론검 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 농도별로 위암 세포주인 SNU-C2A에 처리하여 MTT 어세이 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 2b는 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 론검 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 농도별로 위암 세포주인 SNU-C2A에 처리하여 SRB 어세이 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 SNU-C2A에 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 세포 주기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 SNU-C2A에 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 첨가하여 72시간 동안 배양한 후 세포 주기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 세포주 증식 억제 활성을 갖는, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus caseissp.casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 락티스 에스에스피크레모리스(Lactococcus lactisssp.cremoris), 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococcus lactisssp.lactis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 및 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)의 세포질 분획으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 제공한다.

본 발명에 따른 암 세포주 증식 억제제에 있어서, 상기 암 세포주는 위암 세포주 또는 대장암 세포주인 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 상기 위암 세포주는 SNU-1(KCLB00001)일 수 있으며, 상기 대장암 세포주는 SNU-C2A(KCLB0000C2A)일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스, 비피도박테리움 브레베 및 비피도박테리움 론검의 세포질 분획으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 첨가한 가공식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 암 세포주 특히, 위암 세포주 및 대장암 세포주의 증식 억제 활성을 갖는 특정 균주의 세포질 분획을 유효성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제 및 상기 세포질 분획을 첨가한 가공식품을 제공한다.

종래에 암 세포주 특히 위암 세포주 및 대장암 세포주에 대해 증식 억제 활성을 나타내는 몇몇 균주에 있어서, 균주의 전체 세포(whole cell) 또는 균주의 세포벽을 구성하는 펩티도글라이칸이 암 세포주 증식 억제 효과를 나타낸다고 보고된 바가 있지만, 본 발명은 균주의 전체 세포 및 펩티도글라이칸 성분보다 균주내에 존재하는 세포질 분획(cytoplasmic fraction)이 훨씬 강력한 암 세포주 증식 억제 효과를 나타낸다는 것을 입증함으로써, 특정 균주내에 존재하는 세포질 분획을 유효성분으로 하는 보다 효과적인 암 세포주 증식 억제제를 제공한다는 데에 특징이 있다.

본 발명에서는 세포질 분획을 분리해낸 균주로 젖산균을 포함하는 유산균주들을 사용하였다. 구체적으로는, 락토바실러스 애시도필러스 IAM(Institute of applied microbiology)1084, 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이 KCTC3109, 락토바실러스 플란타룸 KCTC3099, 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스 ML4, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 ATCC7962, 비피도박테리움 브레베 ATCC15700 및 비피도박테리움 론검 ATCC1570을 이용하였다.

상기 젖산균을 포함하는 유산균주들의 세포질 분획에 의해 생장이 억제되는 암 세포주로는, 대장암 세포주, 위암 세포주, 백혈병 세포주, 폐암 세포주, 신장암 세포주, 방광암 세포주, 자궁 경부암 세포주, 유방암 세포주, 간암 세포주 또는 전립선암 세포주 등이 해당할 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장암 세포주와 위암 세포주인 것이 바람직하다.

구체적으로, 본 발명에서는 한국 세포주 은행(KCLB; Korea cell line bank)에서 분양받은 대장암 세포주 SNU-C2A(KCLB0000C2A)와 위암 세포주 SNU-1(KCLB00001)를 사용하였다.

본 발명에 따른 젖산균을 포함하는 유산균주들의 세포질 분획을 유효 성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 제공하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행할 수 있다.

유산균주의 배양하기 위하여 그 배지로는 MRS, M17, BHI 등의 배지를 사용할 수 있고, 상기 배지에 유산균주를 접종하고 배양한 후, 세포를 회수하여 유산균주의 세포 분획을 제조한다. 여기에서 유산균주의 세포 분획이라 함은 열처리한 전체 세포, 펩티도글라이칸 및 세포질 분획을 의미한다.

열처리한 전체 세포는 회수된 세포를 95 내지 125℃로 3 내지 20분간 열처리하여 얻을 수 있고, 펩티도글라이칸은 회수된 세포로부터 공지의 방법(Sekineet al.,Cancer Res., 45:1300-1307. 1985)에 따라 분리할 수 있으며, 세포질 분획은 회수된 세포를 초고속 세포 파쇄기(ultrasonicator) 등으로 파쇄하고, 원심분리함으로써 분리할 수 있다.

상기와 같이 제조된 유산균주의 세포 분획을 암 세포주 배양시 처리하여 암 세포주 생장 억제를 조사한다. 암 세포주 생장 억제를 조사하기 위해서 세포 분열을 측정할 수 있는³H-티미딘 업테이크 어세이(thymidine uptake assay), 브로모 유리딘 업테이크 어세이(bromouridine uptake assay) 등의 방법이 사용될 수 있고, 본 발명에서는³H-티미딘 업테이크 어세이를 사용하였다.

³H-티미딘 업테이크 어세이의 원리는 다음과 같다. 세포의 증식은 게놈 DNA의 복제를 요구하므로, DNA 합성 속도를 측정하는 것은 세포 증식에 대한 간접적인 지표가 될 수 있으며, DNA 합성 자체의 조절에 대한 연구에도 적합하다. 또한, DNA 합성 속도는³H-티미딘 결합 속도에 의해 측정되므로,³H-티미딘 업테이크 어세이 방법을 이용하여 인간 유래 암 세포주에 대한 세포 증식 억제 효과를 측정할 수 있다.

이러한 실험 결과, 본 발명에서 사용한 모든 유산균주의 세포 분획, 즉, 열처리한 전체 세포, 펩티도글라이칸 및 세포질 분획에 의해 대장암 세포주의 생장이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 이 경우 특히, 세포질 분획의 첨가에 의해 가장 높은 암 세포주 생장 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 구체적으로 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이는 75% 이상, 비피도박테리움 브레베는 87%, 락토바실러스 플란타룸 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스는 93% 이상 및 비피도박테리움 론검은 96% 이상의 암 세포주 생장 억제 효과를 나타내었다.

또한, 위암 세포주에 대해서는 본 발명에서 사용한 유산균주의 세포 분획 중, 열처리한 전체 세포 및 펩티도글라이칸 첨가에 의해서는 암 세포주의 생장이 전혀 억제되지 않은 반면, 세포질 분획의 첨가에 의해서는 암 세포주의 생장이 억제되었으며, 구체적으로 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이는 68% 이상, 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스는 71% 이상, 비피도박테리움 론검은 72% 이상 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스는 75% 이상의 암 세포주 생장 억제 효과를 나타내었다.

결국, 본 발명에서 사용한 유산균주의 세포질 분획은 암 세포주의 생장을 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 유산균주 세포질 분획에 의한 암 세포주 생장 억제 기작을 조사하기 위하여, 세포 독성을 측정할 수 있는 MTT 어세이, SRB 어세이 및 세포 주기를 분석할 수 있는 FACS 분석(FACS analysis)을 수행하였다. 그 결과, 유산균주의 세포질 분획에 의한 암 세포주의 생장 억제 효과(cytostatic effect)는 세포 독성 효과(cytotoxic effect)가 아닌 암세포주의 면역 반응 촉진 기작이나 종양 억제 기작 등의 다른 기작을 통하여 얻어지는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에서 사용한 유산균주의 세포질 분획을 함유하는 가공식품을 제공한다.

본 발명에서 사용한 유산균주는 식품 등급으로 사용할 수 있어 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 안전하게 섭취할 수 있는 잇점이 있으므로 암 세포주 억제 활성을 갖는 유산균주의 세포질 분획을 분말 상태 등으로 식품에 첨가하여 섭취하게 되면 항암효과를 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 세포 분획의 준비

<1-1> 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 배양

젖산균인 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococus lactis ssp. lactis)를 5% 글루코스가 첨가된 M17 액체 배지(Difco) 3 ℓ에 접종하여 30℃로 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm, 4℃로 원심분리(Vision, Korea)하여 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 회수하였고, 증류수로 3회 세척한 후 동결 건조시켜 보관하거나 실시예 2 내지 5에서 사용하였다.

<1-2> 열처리한 전체 세포의 준비

암세포주 배양시 첨가하기 위한 열처리한 전체 세포(heat-treated whole cell)를 준비하기 위하여, 실시예 1-1에서 동결 건조시킨 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 증류수로 현탁하였다. 현탁한 젖산균을 121℃로 15분간 처리한 후, 암세포주 배양시 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.

<1-3> 세포질 분획의 분리

암세포주 배양시 첨가하기 위한 세포질 분획을 분리하기 위하여, 실시예 1-1에서 동결 건조시킨 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 증류수에 10 ㎎/㎖ 농도로 현탁하였다. 현탁한 세포를 세포 파쇄기(Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA)를 이용하여 30분간 파쇄하되, 발생되는 열을 얼음으로 냉각시키면서 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 5℃에서 800 g로 30분간 원심분리하여 세포 침전물을 제거하였다. 파쇄된 세포의 상층액으로부터 세포벽을 분리하기 위하여, 70,000 g로 30분간 초고속 원심분리(Ultracentrifuge, Hitach, Tokyo, Japan)하여 세포벽이 포함된 침전물을 제거함으로써 상층액인 세포질 분획을 분리하였다. 이와 같이 분리된 세포질 분획을 암세포주 배양시 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.

<1-4> 펩티도글라이칸의 분리

암세포주 배양시 첨가하기 위한 펩티도글라이칸을 분리하기 위하여, 실시예 1-3에서 분리된 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포벽이 포함된 침전물을 이용하여 공지의 방법(Sekineet al.,Cancer Res., 45:1300-1307, 1985)에 따라 다음과 같이 실험을 수행하였다. 1 g의 세포벽을 0.05% Triton X-100(Sigma)이 포함된 0.05 M 인산 완충용액(phosphate buffer) 10 ㎖로 85℃에서 1시간 동안 현탁시켰다. 세포벽 현탁액을 급속히 냉각시키고 증류수로 세척한 후, 메탄올과 증류수의 2:1 혼합물, 메탄올, 아세톤 순서로 세척하여 Triton X-100의 잔여물을 제거하였다. 이후, 10 mM MgCl₂를 포함한 Tris-HCl(pH 7.2) 20 ㎖에 현탁시키고, 트립신(trypsin, Sigma) 1 ㎎/㎖, DNase 100 ㎍/㎖, RNase 150 ㎍/㎖을 첨가하여 37℃에서 14시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물을 20,000 g 에서 40분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 분리하였다. 불용성 물질에 Tris-HCl 20 ㎖을 첨가하고, 트립신 0.5 ㎎/㎖ 및 키모트립신(α-chymotrypsin, Sigma) 0.5 ㎎/㎖을 첨가하여 37℃에서 14시간 동안 가수분해하였다. 가수분해 산물을 20,000 g에서 40분 동안 원심분리한 후, 잔류물에 0.01 N HCl 10 ㎖을 첨가하고, 펩신(pepsin) 1 ㎎/㎖을 첨가하여 37℃에서 14시간동안 가수분해하였다. Tris-HCl 20 ㎖을 첨가하고, 프로나아제 P(Pronase P, Sigma) 1 ㎎/㎖를 첨가하여 37℃에서 14시간 동안 다시 가수분해하였다. 가수분해 산물을 20,000 g로 40분 동안 원심분리한 후, 잔류물을(주: 침전물을 의미하는 것인지 확인하여 주시기 바랍니다) 메탄올, 메탄올:클로로포름의 1:1 혼합물, 클로로포름(Hayman, Witham, UK) 순으로 세척하였다. 상기 방법과 동일하게 프로나아제 처리를 3회 반복한 후, 증류수로 24시간 동안 3회 투석하였다. 투석이 완료된 액체에 0.01 N HCl(Junsei Chemical Co, Tokyo, Japan) 10 ㎖을 첨가하여 90℃에서 5분 동안 열처리하고, 즉시 냉각시킨 후 15,000 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 증류수로 7일 동안 투석하고 0.2 μm 필터(filter, Advantec MFS Inc., Pleasanton, CA, USA)로 멸균한 후, 동결건조시켜 보관 및 암세포주 배양시 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.

<실시예 2> 암세포주 배양 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스 세포 분획의 처리

암세포주로는 인간 유래 대장암 세포주인 SNU-C2A(KCLB 0000C2A, colon adenocarcinoma)와 인간 유래 위암 세포주인 SNU-1(KCLB 00001, gastric cancer cell line)을 사용하였다.

RPMI-1640에 FBS를 10%로 첨가하고, 페니실린(penicillin) 100 IU/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖을 첨가한 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 상기 암세포주들을 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을 사용하였다.

락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포 분획, 즉, 열처리한 전체 세포, 세포질 분획 및 펩티도글라이칸 첨가에 의한 암세포주의 생장 억제 효과를 조사하기 위하여, 상기 배양한 SNU-C2A와 SNU-1 암세포주를 96 웰 플레이트(well plate)에 1 x 10⁴개 세포를 분주하고, 실시예 1-2, 1-3, 1-4에서 각각 분리한 열처리한 전체 세포, 세포질 분획 및 펩티도글라이칸을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 72시간 경과시³H-티미딘 업테이크 어세이(³H-thymidine uptake assay), MTT 어세이 및 SRB 어세이를 실시하여 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포 분획을 첨가하지 않은 대조구와 비교하였다.

<실시예 3> 세포 분화 억제 정도 측정

<3-1> ³ H-티미딘 업테이크 어세이

세포 분화 억제 정도를 측정하기 위하여, 공지의 방법(Trautet al.,Int. J. Cancer, 23:193-196, 1979)에 따라³H-티미딘 업테이크 어세이를 수행하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스를 배양하되, 세포를 회수하기 10시간 전에 웰 당 1 μCi를 첨가하여 배양하였다. 배양 후 세포 회수 기구(Cambridge Scientific Inc., cambridge, MA, USA)를 이용하여 세포를 유리 섬유 필터(Brandel Inc., Gaithersburg, MA, USA)에 회수하였다. 회수된 세포를 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail, Wallac, Turku, Finland) 3 ㎖을 혼합하여 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter, Wallac, Turku, Finland)로 방사능을 측정하였다. 본 실시예에 따라 3회 반복 실험을 수행하였으며, 세포 증식 억제 정도를 %로 계산하여 하기표 1에 나타냈다.

또한, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 0 내지 100 ㎍/㎖ 농도별로 SNU-C2A에 처리하여 배양한 후,³H-티미딘 업테이크 어세이를 수행하여, 그 결과를도 1에 나타냈다.도 1에 나타낸 바와 같이, 처리한 세포질 분획의 농도가 점차 증가할수록 암 세포주의 생장이 억제되는 것을 관찰함으로써, 암 세포주의 생장 억제율이 처리한 세포질 분획의 농도에 의존적인 것을 알 수 있다.

<3-2> IC ₅₀ 값의 결정

대조구에 비교하여 암세포주의 증식을 50% 억제하는 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 농도를 IC₅₀값으로 계산하여 하기표 2에 나타냈다.

<실시예 4> 세포 독성의 측정

<4-1> MTT 측정

세포 독성을 측정하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 암세포주를 배양한 다음 공지의 방법(Mosmann,J. Immunol. Method, 65:55-63, 1983)에 따라 MTT 측정을 실시하였다. 배양된 세포를 인산 완충용액으로 2회 세척하였다. 96 웰 플레이트에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 96 웰 플레이트를 800 g로 실온에서 25분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 파란색의 포르마잔(formazan) 생성물에 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 0.1 ㎖을 첨가하여 쉐이커(shaker) 위에서 80 rpm으로 30분 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를도 2a에 나타내어 세포 독성을 조사하였다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획은³H-티미딘 업테이크 어세이 보다 낮은 활성을 나타내어 암세포주에 대해 세포 독성 효과가 없는 것으로 나타났다. 이로부터 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획에 의한 암세포주의 생장 억제 효과는 세포 독성 효과가 아닌 암세포주의 면역 반응 촉진 기작이나 종양 억제 기작 등의 다른 기작을 통하여 얻어지는 것을 알 수 있다.

<4-2> SRB 측정

세포 독성을 측정하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 암세포주를 배양한 다음 공지의 방법(Skehan et al.,J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1113, 1990)에 따라 SRB(sulforhodamine B) 측정을 실시하였다. 배양된 세포에 50% TCA를 첨가하여 2℃에서 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 탭 워터(tap water) 방법으로 세척하고 공기중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 세포에 설포로다민 B(sulforhodamine B, Sigma)를 각 웰 당 0.2 ㎖를 첨가하여 30분 동안 염색한 후, 1% 빙초산(glacial acetic acid)으로 수회 세척하였다. 세포가 건조되었을때, 염색된 SRB를 10 mM Tris-HCl(pH 10.5)로 용해시켜 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를도 2b에 나타내어 세포 독성을 조사하였다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획은³H-티미딘 업테이크 어세이보다 낮은 활성을 나타냈으나, SRB 측정에서 세포 독성을 나타냈다.

<실시예 5> 세포 주기의 분석

실시예 2와 동일한 방법으로 세포를 배양하되, 암세포주로는 SNU-C2A를 사용하였고 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획을 사용하여 48시간, 72시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하여 0.2 ㎖의 cold citrate buffer에 3 X 10⁶세포를 넣고, PI(propidium iodide, Sigma) 20 ㎍/㎖를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 염색한 후 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson)로 세포 주기를분석하여 그 결과를도 3및도 4에 나타냈다.

도 3및도 4에 나타낸 바와 같이, 첨가한 세포질 분획의 농도가 증가함에 따라 G2/M 기 및 G0/G1 기의 세포는 점차로 감소하였고, S 기의 세포는 점차로 증가하였다. 이로부터 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획은 암세포주의 세포 주기를 S 기에 정지되도록 하여 G2/M 기 및 G0/G1 기로의 진행을 억제함으로써 암세포주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.

<실시예 6> 락토바실러스 애시도필러스의 암세포주 억제 효과

락토바실러스 애시도필러스 IAM1084를 사용하고, 배양 배지로 MRS배지(Difco)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다.

<실시예 7> 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이의 암세포주 억제 효과

락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이를 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이 KCTC3109를 사용하고, 배양 배지로 MRS 배지를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다.

<실시예 8> 락토바실러스 플란타룸의 암세포주 억제 효과

락토바실러스 플란타룸 KCTC3099를 사용하고, 배양 배지로 MRS 배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다. 또한, MTT 어세이 및 SRB 어세이 결과를도 2a및도 2b에 나타냈으며, 그 결과 락토바실러스 플란타룸의 세포질 분획에 의한 암 세포주의 생장 억제 효과는 세포 독성 효과에 의한 것이 아님을 알 수 있다.

<실시예 9> 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스의 암세포주 억제 효과

락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스 ML4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다.

<실시예 10> 비피도박테리움 브레베의 암세포주 억제 효과

비피도박테리움 브레베 ATCC15700을 사용하고, 배양 배지로 BHI(Difco)에 0.5% 글루코스 및 0.05% 시스테인(cysteine)을 첨가하여 사용하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 것을 제외하고는 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다.

<실시예 11> 비피도박테리움 론검의 암세포주 억제 효과

비피도박테리움 론검 ATCC1570을 사용하고, 배양 배지로 BHI에 0.5% 글루코스 및 0.05% 시스테인(cystein)을 첨가하여 사용하였고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 것을 제외하고는 실시예 1 내지 5와 동일한 방법에 따라 실시하여,³H-티미딘 업테이크 어세이 결과는 하기표 1에 나타냈고, 하기표 2에는 IC₅₀값을 나타냈다. 또한, MTT 어세이 및 SRB 어세이 결과를도 2a및도 2b에 나타냈으며, 그 결과 비피도박테리움 론검의 세포질 분획에 의한 암 세포주의 생장 억제 효과는 세포 독성 효과에 의한 것이 아님을 알 수 있다.

	SNU-C2A	SNU-1
락토바실러스 애시도필러스	열처리한 전체 세포	23.5	-
	펩티도글라이칸	28.8	-
	세포질 분획	43.6	45.8
락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이	열처리한 전체 세포	45.5	-
	펩티도글라이칸	36.7	-
	세포질 분획	75.1	68.5
락토바실러스 플란타룸	열처리한 전체 세포	29.1	-
	펩티도글라이칸	39.0	-
	세포질 분획	93.3	18.6
락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스	열처리한 전체 세포	62.7	-
	펩티도글라이칸	27.3	-
	세포질 분획	64.2	71.0
락토코커스 락티스 에스에스피 락티스	열처리한 전체 세포	65.6	-
	펩티도글라이칸	67.2	-
	세포질 분획	93.5	75.2
비피도박테리움 브레베	열처리한 전체 세포	61.6	-
	펩티도글라이칸	60.1	-
	세포질 분획	87.2	4.0
비피도박테리움 론검	열처리한 전체 세포	31.0	-
	펩티도글라이칸	39.9	-
	세포질 분획	96.3	72.9

*. - : 세포 증식 억제 효과가 없는 경우

상기표 1에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주 SNU-C2A는 실시예 3-1, 실시예 6 내지 11에서 사용한 모든 젖산균의 세포 분획, 즉, 열처리한 전체 세포, 펩티도글라이칸 및 세포질 분획에 의해 생장이 억제되었다. 특히, 세포질 분획의 첨가에 의해 가장 높은 억제 효과가 나타났으며, 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이는 75% 이상, 비피도박테리움 브레베는 87%, 락토바실러스 플란타룸 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스는 93% 이상 및 비피도박테리움 론검은 96% 이상의 세포 생장 저해 효과를 나타냈다.

또한, 위암 세포주 SNU-1는 실시예 3-1, 실시예 6 내지 11에서 사용한 젖산균의 세포 분획인 열처리한 전체 세포 및 펩티도글라이칸 첨가에 의해서는 세포 생장이 전혀 억제되지 않았다. 그러나, 젖산균의 세포질 분획의 첨가에 의해서는 세포 생장이 억제되었으며, 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이는 68% 이상, 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스는 71% 이상, 비피도박테리움 론검은 72% 이상 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스는 75% 이상의 세포 생장 저해 효과를 나타냈다.

이로부터 상기 본 실시예에서 사용한 젖산균의 세포질 분획은 암세포 생장을 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있다.

	SNU-1(㎍/㎖)	SNU-C2A(㎍/㎖)
락토바실러스애시도필러스	100	100
락토바실러스 에스에스피 카제이	100	53
락토바실러스플랜타럼	100	36
락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스	54	75
락토코커스 락티스 에스에스피 락티스	11	23
비피도박테리움브레베	43	43
비피도박테리움론검	17	33

상기표 2에 나타낸 바와 같이, IC₅₀값은 비피도박테리움 브레베가 43 ㎍/㎖, 락토바실러스 플란타룸이 36 ㎍/㎖, 비피도박테리움 론검이 33 ㎍/㎖ 및 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스가 23 ㎍/㎖으로 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획이 가장 적은 양으로로도 대장암 세포주 SNU-C2A의 생장을 억제하는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에 따른 유산균의 위암 세포주 SNU-1에 대한 IC₅₀값은 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스가 11 ㎍/㎖, 비피도박테리움 브레베가 43 ㎍/㎖ 및 비피도박테리움 론검이 17 ㎍/㎖으로, 역시 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스의 세포질 분획이 가장 적은 양으로로도 위암 세포주 SNU-1의 생장을 억제하는 것으로 나타났다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 사용한 젖산균을 포함하는 유산균주의 세포질 분획은 암 세포주 특히, 위암 세포주 또는 대장암 세포주에 대해 증식 억제 효과가 우수하였다. 본 발명에 따른 유산균주의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 사용하면, 위암 또는 대장암의 증식을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 유산균주의 세포질 분획만을 분리하여 제제화하면 되므로, 기존의 항생제를 포함하는 여러 종류의 항암제들에 비하여 생산 원가를 낮출 수 있다. 아울러, 식품 등급으로 사용되는 유산균주를 사용하므로, 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 안전하게 섭취할 수 있다.따라서, 상기 젖산균의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 가공식품을 생산할 수 있으며, 이러한 가공식품의 섭취에 의해 암을 예방하는 효과를 기대할 수 있다.

Claims

암 세포주 증식 억제 활성을 갖는, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스(Lactococcus lactis ssp. cremoris), 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 및 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium, longum)의 세포질 분획으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암이 위암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 세포주가 위암 세포주 SNU-1(KCLB00001)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 세포주가 대장암 세포주 SNU-C2A(KCLB0000C2A)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
암 세포주 증식 억제 활성을 갖는, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카제이 에스에스피 카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토코커스 락티스 에스에스피 크레모리스, 락토코커스 락티스 에스에스피 락티스, 비피도박테리움 브레베 및 비피도박테리움 론검의 세포질 분획으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 세포질 분획 또는 이들의 혼합물을 첨가한 가공식품.