KR101104179B1 - 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 함유한 식품 첨가제 조성물 - Google Patents
비피더스균 유래의 세포질 추출물을 함유한 식품 첨가제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 함유한 식품 첨가제 조성물 에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)의 세포질 추출물을 포함하는 식품 첨가제 조성물 및 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2)의 생산을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 식품 첨가제 조성물은 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2) 생산 및 생물막 생성을 억제시킴으로서 병원성 미생물의 생장을 막아 식중독 등을 예방할 수 있다.
자가유도물질, 생물막, 비피더스균, 세포질 추출물, 병원성 미생물
Description
본 발명은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 함유한 식품 첨가 조성물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 비피도박테리움 롱검 또는 비피도박테리움 아돌레센티스 유래의 세포질 추출물을 포함하는 비피더스균을 이용한 식품 첨가제 조성물 및 세포질 추출물을 병원성 미생물에 가하는 것을 포함하는 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제방법에 관한 것이다.
최근들어 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)을 포함한 병원균 미생물들은 일정 세포농도에 도달했을 때 자신이 생산하는 화학적 언어를 이용한 세포간의 신호전달을 통해 특정 유전자 발현을 조절한다. 이와 같이 유전자의 발현이 세포밀도에 의존하는 적정밀도 인식(quorum sensing : QS)기작은 그람음성 및 그람양성세균들에 널리 존재한다(Fuqua et al., 1994; Salmond et al., 1995). QS의 주된 신호물질로 그람음성세균은 N-아실호모세린 락톤(N-acylhomoserine lactone; AHL) 계열의 화합물을 생산하고(Holden, 1999; Pesci et al., 1999), 그람양성세균은 신호 물질로 올리고 펩타이드를 주로 사용한다. 또 다른 종류의 신호물질로는 두 종류의 세균에 공통적으로 존재하여 ‘신호물질(universal signal)'로서 알려진 자가유도물질(autoinducer-2; AI-2)이 있다.
이러한 자가유도물질(AI-2)은 이를 암호화하는 유전자가 세균들 사이에 널리 분포되어 있으므로 자가유도물질(AI-2)이 종의 장벽을 넘어서 폭넓게 작용할 수 있는 물질임을 시사하는 것이며, 다양한 유전자의 발현에 영향을 미치므로 보편적인 신호 물질이다(Swift et al., 1994).
최근 많은 연구결과에서 세균들이 QS를 통해서 병원성(de Kievit et al., 2000), 생체발광(Hanzelka et al., 1977; Nealson et al., 1979), 생물막(biofilm) 형성(Davies et al., 1998 ), DNA 수용능(Magnuson et al., 1994), 항생제 생산(Bainton et al., 1992) 및 접합에 의한 Ti 플라스미드(plasmid)의 전달(Fuqua et al., 1994)등과 같은 다양한 생리현상을 조절한다고 보고되어졌다.
특히 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)을 포함한 식품 유래의 병원성 미생물은 식품공장의 기계기구, 작업대의 표면(abiotic surface) 및 장내 점액층(mucus층; biotic surface)과 같은 표면에 부착하여 생존하는 것이 가능하며 다층구조의 다당류(extracellular polymeric substances)를 형성함으로써 외부의 환경적인 스트레스로부터 자신을 보호하는 기작을 가지고 있다고 알려져 있는데 이러한 다층구조의 다당류 구조를 생물막(biofilm)이라 명명하고 최근 들어 많은 연구가 활발하게 이루어지고 있다(Tremoulet et al., 2002; Schembri et al., 2003; Reisner et al., 2003; Ryu and Beuchat, 2005).
이러한 생물막이 식품공장에서 공정라인이나 작업대 표면에 형성되면 일반적인 공장에서 사용되는 세척 및 소독제에 의해서도 완전하게 제거되지 않고 생존이 가능하여 인간에게 질병을 유발할 수 있는 2차 오염원이 될 수 있는 가능성을 내포하고 있으며 장내에서 초기 부착 후 생물막을 형성하게 되면 이를 조절하기 매우 어렵다는 보고가 있다(Costerton et al., 1999).
또한 세균성 생물막은 낭포성 섬유종 이나 치아의 플라그와 같은 만성 세균성 질병의 원인이 되기 때문에 인체의 건강에는 상당히 염려스러운 현상이다. 세균이 생물막을 형성하면 항생제에 대해서 저항을 가지므로 인간의 건강이나 식품 안전성 측면에서 볼 때 주목해야 할 현상이다(McLean et al., 1997).
따라서 이러한 생물막을 제어하기 위한 새로운 기술의 개발이 필요한 시점이다. 최근 들어 이들 병원성 미생물이 생성하는 생물막도 QS 시스템에 의해 조절되는 특성으로 보고되고 있다. 따라서 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)을 포함한 다양한 병원균에서 QS 시스템은 병원성 세균에서 병원성과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 QS 신호전달의 차단 (Anti-QS)을 통한 QS의 교란은 새로운 항생제 개발의 실마리가 될 수 있다(Park and Lee, 2004).
QS의 저감화 방안에 대한 연구는 현재까지 그리 많지 않은 실정이며 해양식물인 갯솜붉은털(Delisea pulchra)에서 분리한 퓨라논(furanone)(Ren et al., 2001)이 효과적으로 QS 신호를 분해 또는 활성억제 할 수 있다고 보고되었으나 퓨라논의 주요성분이 할로겐(halogen)으로 구성되어 있어서 식품의 적용시 안전성상의 문제로 인해 식품 소재로서의 가능성은 불가능한 실정이다. 또한, 인체의 장 관에서 상당수 존재하여 병원성 미생물과 경합할 수 있는 유산균의 QS의 저감화 물질에 대한 탐색은 아직 보고되지 않았다.
국내의 경우, 학술적 기반의 미비로 QS의 억제 방안에 대한 연구 보고는 거의 부재한 실정이나 최근 QS에 관련된 리뷰논문이 발표되는 등(Park and Lee, 2004) QS와 관련된 관심과 함께 이를 이용한 병원성 인자의 조절에 대한 관심이 증대되고 있다.
유산균 중에도 박테리오신(bacteriocin)은 합성과 관련된 QS 현상이 일어난다.
유산균에 의한 병원성 미생물의 부착 억제 효과는 주로 장관 내 pH의 저하와 병원성 미생물에 항균성을 나타내는 박테리오신과 같은 물질의 생산에 의한 것으로 보고되었다(Matter et al., 2002). 하지만 최근 들어 병원성 미생물과 장 상피세포의 수용체 경합(Mack et al., 1999) 또는 병원성 미생물의 병원성 관련 특정 단백질의 발현을 변화시킨다는 보고(Bergonzelli et al., 2006)가 이루어지면서 이와 관련된 다양한 신기능성 물질 탐색에 대한 연구가 계속되고 있다. 하지만 식품 유래의 신규물질을 대상으로 병원균의 저감화와 관련된 단백질의 탐색에 관한 연구는 아직까지 그리 많지 않은 실정이다.
따라서 병원성 미생물의 자가유도물질 생산 및 생물막 생성억제 작용을 할 수 있고 식품소재로 사용할 수 있는 QS 저해제를 선발하는 연구가 필요한 상황이다.
본 발명의 목적은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함하여 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2) 생산 및 생물막 생성억제 작용을 할 수 있는 식품 참가 조성물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 병원성 미생물에 접종하여 자가유도물질(Autoinducer-2)의 생산을 억제할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 식품 첨가제 조성물은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함하며, 비피더스균은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)이고, 바람직하게는 비피도박테리움 아돌레센티스(ATCC 15706) 또는 비피도박테리움 롱검(ATCC 15707)이다. 이때 세포질 추출물은 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득된다.
또한 본 발명의 자가유도물질의 생산 억제 방법은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 병원성 미생물에 가하는 것을 포함한다. 세포질 추출물은 유전자 nifU, 유전자 FlgI, 유전자 dsbA 또는 유전자 hybe에 작용한다.
이때 병원성 미생물은 장출혈성대장균, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타 이피뮤리움, 예르니시아 엔테로콜리티카, 슈도모나스 에어루기노사, 리스테리아 모노사이토젠, 비브리오 하베이 및 바실러스 세레어스로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 식품 첨가제 조성물에 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함함으로써 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2) 생산 및 생물막 생성억제를 시켜 인간에게 식중독 등의 질병을 유발할 수 있는 오염원을 차단한다. 또한 본 발명에 따른 비피더스 유래의 세포질 추출물은 신호전달의 차단을 통하여 QS저해제로서도 사용할 수 있다.
본 발명은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함하는 조성물로 병원성 미생물을 처리함으로써 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2; AI-2) 생산 및 생물막(Biofilm)의 생성을 억제하는 식품 첨가제 조성물 및 자가유도물질(Autoinducer-2; AI-2) 생산을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 식품 첨가제 조성물은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함한다. 이때 상기 세포질 추출물로 병원성 미생물을 처리하여 자가유도물질(AI-2)의 생산 및 생물막(biofilm)의 생성을 억제한다.
상기 비피더스균은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판틴스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 카테눌라튬(Bifidobacterium catenulatum) 및 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 중에서 선택될 수 있다. 이 중에서 바람직하게는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)이며, 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 롱검(ATCC 15707) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(ATCC 15706)이다.
또한 상기 병원성 미생물은 장출혈성대장균(E. Coli), 살모넬라 엔테리티디스(salmonella Enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(salmonella typhimurium), 예르니시아 엔테로콜리티카(yersinia enterocolitica), 슈도모나스 에어루기노사(pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노사이토젠(listeria monocytogen), 비브리오 하베이(vibrio harveyi) 및 바실러스 세레어스(bacillus cereus) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 식품 첨가제 조성물은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 전체 식품 중량의 0.02 내지 10 중량%로 가할 수 있다. 상기 식품 첨가제 조성물은 비피더스균 유래의 세포질 추출물 외에 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화 제, 방부제, 글리세린, 알콜로 중에서 선택된 하나 또는 2종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
자가유도물질 생산 및 생물막 생성을 억제하는 방법은 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 병원성 미생물에 접종하는 방법을 통하여 얻어진다.
예컨대, 병원성 미생물의 배양 상등액을 비피더스균 유래의 세포질 추출물 또는 배양 상등액 15 내지 40 ㎎/㎖에 첨가한 후 혼합하여 3 내지 6 시간동안 30 내지 38℃에서 170 내지 180 rpm에 교반하면서 진탕배양한다. 이때 세포질 추출물은 비피더스균을 배양하여 원심분리한 후 균체를 파쇄하고 다시 원심분리하여 회수한 상등액을 pH 7.0 내지 7.5로 조정한 후 0.1 내지 0.3 ㎛의 필터로 여과하고 동결건조 하여 얻는다. 또한 배양 상등액은 상기 비피더스균 배양액을 원심분리한 후 균체를 제거하고 회수된 상등액을 0.1 내지 0.3 ㎛의 필터로 여과하고 동결건조하여 얻는다.
도 1은 비피더스균을 이용하여 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 표 1에 기재된 13종의 비피더스균의 세포질 추출물을 병원성 미생물 중에서 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 가한 후 자가유도물질 생산억제능력을 평가하였다.
대조군은 자가유도물질 비생성균주로 알려진(Surrete and Bassler, 1998) 음 성 대조군인 대장균 DH5 대비 308배로 나타났다.
비피도박테리움 롱검 DSM 20097과 비피도박테리움 브레브 ATCC 15700 균주는 각각 대조군 대비 약 9배, 29배 만큼의 자가유도물질 생산억제가 관찰되었고 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706과 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 경우에는 각각 대조군 대비 약 67배, 92배 정도의 자가유도물질 생산이 억제 되는 것으로 나타났다.
도 2는 비피더스균을 이용하여 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 표 1에 기재된 비피더스균 중에서 8종의 비피더스균의 세포질 추출물을 병원성 미생물 중에서 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 가한 후 생물막 생성억제능력을 평가하였다.
그 결과, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주 및 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706균주는 대조군에 비하여 각각 약 36%, 32% 정도 생물막 생성억제능력이 관찰되었다. 자가유도물질 생산억제 효과가 높게 나타난 균주들이 생물막 생성억제 작용이 나타나는 것을 확인하였다.
도 3은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 이용하여 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 도 1에서 자가유도물질 생산억제 효과가 우수한 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 배양 상등액과 세포질 추출물을 시료로 하여 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 가한 후 자가유도물질 생산억제능력을 평가하였다.
대조군은 대장균 DH5 대비 자가유도물질 활성이 310배(fold)로 나타났으나, 배양 상등액을 첨가한 경우에는 자가유도물질 활성이 230배로 관찰되어 약 80배의 자가유도물질 생산억제능력이 나타났고, 세포질 추출물을 첨가한 경우 자가유도물질 활성이 215배로 나타나 대조군에 비하여 95배 생산억제능력을 보였다. 이것으로 배양 상등액과 세포질 추출물 시료 모두는 대조군에 비해 자가유도물질 생산억제능력이 관찰되는 것을 확인하였다.
도 4는 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 첨가농도에 따른 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물의 단백질 함량을 기준으로 2, 10, 20, 50 및 100 ㎎/㎖를 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 첨가한 후 자가유도물질 생산억제능력을 평가하였다.
그 결과, 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 20 ㎎/㎖의 상기 세포질 추출물을 첨가한 경우에 우수한 자가유도물질 생산억제능력을 관찰하였다. 반면, 50 ㎎/㎖와 100 ㎎/㎖의 상기 세포질 추출물을 첨가한 경우에는 오히려 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 자가유도물질 생산억제능력이 감소되었다.
도 5는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물 첨가에 따른 병원성 미생물의 성장을 나타낸 도면이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 밤새(overnight) 배양한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894를 LB 배양액에 0.1% 접종한 후 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물을 10 ㎎/㎖첨가하여 37℃에서 배양하면서 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 성장을 평가하였다.
그 결과, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 자가유도물질 생산억제능력에 관련된 물질은 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 성장에는 영향을 주지 않고, 자가유도물질 생산만 억제하는 것을 확인하였다.
도 6은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주에 프로테아제 K를 첨가에 따른 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성 변화를 나타낸 도면이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 자가유도물질 생산억제활성 물질의 특성을 파악하고자 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물에 프로테아제(protease)K (10 ㎍/㎖)를 첨가한 후 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 자가유도물질 생산억제활성의 변화를 평가하였다.
대조군은 대장균 DH5 대비 자가유도물질 활성이 283배(fold)로 나타났으나, 프로테아제 K를 처리하지 않은 경우는 자가유도물질 활성이 196배로 관찰되어 약 87배의 자가유도물질 생산억제능력이 나타났다. 10 ㎍/㎖의 프로테아제 K를 첨가할 경우 자가유도물질 활성이 283배로 나타나 억제 능력이 관찰되지 않았다.
따라서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 자가유도물질 생산억제능력에 관련된 물질은 단백질성 물질이다.
도 7은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 이용하여 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이다.
도 7에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707를 대상으로 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 생물막 생성억제능력을 재평가 한 결과, 세포를 제거한 배양상등액과 세포질 추출물에서 첨가하지 않은 경우보다 약 10%의 억제능력이 관찰되었다.
도 8은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 첨가농도에 따른 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물의 단백질 함량을 기준으로 2, 10, 20, 50 및 100 ㎎/㎖를 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 첨가한 후 생물막 생성억제능력을 평가하였다.
생물막 생성억제능력은 20 ㎎/㎖의 세포질 추출물을 첨가한 경우 가장 높게 평가 되었다. 반면, 50 ㎎/㎖ 와 100 ㎎/㎖의 세포질 추출물 첨가 시 오히려 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 생물막 생성억제능력이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 자가유도물질 생성억제능력에서 나타난 경향과 일치하는 것으로서 세포질 추출물을 고농도로 가한 경우 낮은 생물막 생성억제와 자가유도물질 생산억제작용의 낮은 억제활성은 생물막 형성이 자가유도물질과 직접적으로 관계가 있음을 나타낸다.
도 9는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주에 프로테아제 K를 첨가에 따른 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성 변화를 나타낸 도면이다.
도 9에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물에 프로테아제(protease) K (10 ㎍/㎖)를 첨가한 후 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 생물막 생성억제활성의 변화를 평가하였다.
장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 생물막 생성억제작용은 프로테아제(protease) K (10 ㎍/㎖)를 처리한 경우 억제작용이 소실되는 것으로 보아 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물은 단백질성 물질임을 확인 할 수 있었다. 이는 자가유도물질 생산억제작용을 나타내는 물질과 유사성이 높다.
도 10은 이차원 전기영동을 이용한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 프로테옴 분석한 도면이다.
도 10에 도시된 바와 같이, 단백질은 등전점 전기영동(pH 3-10)으로 처리되고, 12.5% SDS-PAGE에서 이차원 분석된다. 단백질은 블루-은 염색법(blue silver staining)으로 분리된다. 전형적인 얼룩이진 젤(gel)은 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에서 비롯되었으며, 와일드 타입 세포는 (a)에서 보여진다.
(b) 및 (c)는 각각 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707(b)와 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706(c)의 20 ㎎/㎖ 세포질 추출물을 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894 처리시 세포내 단백질의 이차원 전기영동 패턴을 비교한다.
MALDI-TOF/MS(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석법과 연계한 이차원 전기영동을 이용하여 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주와 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706균주의 세포질 추출물을 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 처리시 자가유도물질 생산억제효과를 단백질 발현변화로 확인하였다.
프로테옴 분석에서는 몇 개의 단백질 스팟(spot)들이 20 ㎎/㎖의 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포 추출물에 의해 발현이 증가 또는 억제 되었다. 각 처리제에서 추출된 단백질은 비변형성 IPG 스트립(pH 3~10)을 이용하여 등전점 전기영동 후 SDS-PAGE에서 전개하고 블루-은 염색법(Blue silver staining)을 이용하여 스팟을 관찰하였다. 각 겔(gel)의 이미지에서 평균적으로 250개의 스팟을 관찰할 수 있었으며 PDQuest 이미지 분석 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 최소 2.5배 이상의 발현 차이를 보이는 7개의 스팟을 선발하였다. 5개의 스팟(A, B, C, D 및 E)은 발현이 억제 되었고 2개의 스팟(F, G)은 발현이 증가하였다(표 2).
7개의 스팟을 대상으로 MALDI-TOF/MS와 프로테옴 데이터베이스를 이용하여 단백질 규명 및 관련 기능을 확인한 결과 스팟 A, C 및 F는 동정이 되지 않았다. 스팟 B(nifU)는 철의 대사 또는 생합성과 관련된 물질대사를 조절하는 단백질을 코딩(coding)하는 유전자이다.
NifU는 20 ㎎/㎖의 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물을 처리시 발현이 대조군에 비해 억제 되었다. 그러므로 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 자가유도물질 생산능력은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물의 물질에 의해서 발현이 억제되어 nifU의 발현도 억제된 것이다.
스팟 D(dsbA)는 산화를 촉진 시키거나 독성요소들이 발현될 때 필요로 하는 유전자 이다. 본 발명에서 20 ㎎/㎖의 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물을 처리시 dsbA의 발현이 대조군에 비해서 억제되었다. 그러므로 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 자가유도물질 생성능력은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물의 물질에 의해서 발현이 저해되어 dsbA의 발현도 억제되었다.
스팟 E(flgI)는 운동성과 세포막 단백질과 관계있는 유전자이다. 본 발명에서 20 ㎎/㎖의 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물을 처리시 flgI의 발현이 대조군에 비해서 억제 되었다. 그러므로 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 자가유도물질 생산능력은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물의 물질에 의해서 발현이 억제되어 flgI의 발현도 억제되었다.
스팟 G(hybe)는 종래 장출혈성 대장균의 특성과 관련된 보고가 없었으나, 본 발명에서 20 ㎎/㎖의 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물 처리시 대조군에 비하여 발현이 증가됨을 확인하였다.
결론적으로 본 발명에서는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포 추출물을 첨가시 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)의 자가유도물질 생산과 생물막 생성이 억제 되었다. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707의 세포질 추출물에 존재하는 물질에 의하여 자가유도물질 생산을 억제하거나 생물막 생성을 억제할 수 있다. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물에 존재하는 물질을 동정한 결과 주로 대사과정(metabolic process), 세포 운동성(cell motility), 분비(secretion) 및 기낭 생물발생(envelope biogenesis)에 관련된 중요 단백질이 관찰되었다.
새로운 단백질유전자원은 새로운 항생제 및 항균물질의 타겟으로 이용이 가능할 것으로 판단된다.
주로 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 이용한 결과에 대해서만 설명하였으나, 이에 한정하는 것은 아니고 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706균주를 사용한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 세포배양
장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894, 비브리오 하베이 BB170은 이화여자대학교 나노 과학부(Seoul, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 자가유도물질 생산능 실험에서는 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894와 자가유도물질 비생성균주로 알려진(Surrete and Bassler, 1998) 음성 대조군인 대장균 DH5균주를 사용하였다. 모든 대장균 균종은 Luria-Bertani(LB) 액체배지(broth)(Difco, Sparks, MD, USA)에서 배양 하였고, 최종적으로 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 액체배지에서 37℃, 호기적 조건에서 배양하였다. 생물막 생성능 실험의 경우 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894는 M9(표 3) 액체배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 비브리오 하베이 BB170은 자기유도물질 생물검정(autoinducer bioassay; AB, 표 4) 액체배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다(Surette and Bassler, 1998). 비피도박테리움 속 균주는 표 1에 기재된 13종의 균주를 사용하였으며, 모든 비피도박테리움 속 균주는 blood liver(BL, 표 5) 액체배지에서 18시간 동안 37℃ 에서 혐기적 조건에서 배양하였다.
실시예 2. 비피더스균의 배양 상등액 및 세포질 추출물 제조
비피더스균을 BL 배지에서 3회 계대 배양하여 활력을 높인 후 최종 BL 배지에서 24시간 배양하였다. 비피더스균의 배양액을 14,000 × g로 30분간 원심분리한 후 PBS 완충액에 3회 세척 하였다. 균체의 파쇄는 소니케이터를 이용하여 1분에 20회 파쇄하고 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액 예컨대 세포질 추출물은 pH를 7.2로 조정한 후 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과하고 동결 건조하여 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
상기 방법에서 이용한 비피더스균의 배양액을 대상으로 원심분리 후 균체를 제거하고 회수된 배양 상등액을 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과하고 동결 건조하여 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
실시예 3. 비브리오 하베이 BB170을 이용한 자가유도물질 분석
슈레이트 및 바슬러(1998)의 방법에 따라 자가유도물질 생물검정을 측정하였다. LB 액체배지에 밤새 성장시킨 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894와 음성 대조군인 대장균 DH5α를 0.5% 글루코스가 포함된 LB 액체배지에 1.0% 접종하고 12시간 동안 37℃에서 배양하면서 시간별로 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.22 ㎛ 필터로 여과한 다음 -80℃에서 보관하면서 가공되지 않은 적정밀도 인식(QS)으로 사용하였다. 자가유도물질의 리포터 변종(reporter strain)으로 비브리오 하베이 BB170을 사용하여 1 : 5000으로 희석한 균액 900 ㎕와 상기에서 제조된 가공되지 않은 자가유도물질 100 ㎕를 혼합한 후 30℃에서 175 rpm으로 교반하면서 진탕배양을 실시하였다. 배양과정 중 시간별로 시너지 HT 리너(BIO-Tek)를 이용하여 발광(luminoscence)을 측정하였다. 자가유도물질 생산성은 음성 대조군으로 사용된 대장균 DH5α의 상등액이 첨가된 처리의 활력을 사용하여 다음과 같은 식을 이용하여 배수(fold)값을 측정하였다.
샘플의 평균 발광
발광 배수(fold) = -------------------------------------
E. coli DH5α의 발광
실시예 4. 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) 자가유도물질 생산억제활성 평가
실시예 4-1. 비피더스균 시료 평가
13종의 비피도박테리움 속 균주들을 대상으로 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)의 자가유도물질 생산억제효과가 뛰어난 활성균주를 선발하기 위해서 실시예 3과 같이 자가유도믈질의 리포터 변종으로 비브리오 하베이 BB170을 사용하여 1 : 5000 희석된 비브리오 하베이 BB170 800 ㎕, 2시간 배양된 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 배양 상등액 100 ㎕을 실시예 2에서 만든 13종의 비피도박테리움 속 균주의 세포질 추출물을 10 ㎎/㎖ 첨가 후 혼합하여 4시간 동안 30℃, 175 rpm에 교반하면서 진탕배양을 실시하였다. 배양과정 중 시너지 HT 리너 (BIO-Tek)를 이용하여 발광을 측정하였다. 자가유도물질 생산성은 음성 대조군로 사용된 대장균 DH5α의 배양 상등액이 첨가된 처리의 활력을 사용하여 역가를 계산하였으며 모든 실험은 3반복 실시하였다. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 배양 상등액과 세포질 추출물중 어느 물질에서 자가유도물질 생산억제효과가 더 뛰어난지 관찰하기 위해서 배양 상등액과 세포질 추출물을 10 ㎎/㎖ 첨가하여 상기방법과 같이 실시하였다.
실시예 4-2. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 평가
LB 액체배지에서 밤새 배양한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894를 0.1% 접종시킨 대조군과 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물 10 ㎎/㎖ 첨가한 처리제(treatment)를 접종 초기부터 3, 6, 9, 12, 24시간까지 37℃에서 배양하면서 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)의 성장을 관찰하였다. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물의 농도별 자가유도물질 생산억제능력을 측정하여 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 최적 활성농도를 관찰하기 위해 추출물의 단백질 함량 기준으로 2, 10, 20, 50 및 100 ㎎/㎖ 세포질 추출물을 처리 후 상기 방법에 의해서 자가유도물질 생산억제능력을 실시하였다.
실시예 4-3. 프로테아제 K에 대한 효과
프로테아제 K의 반응 조건은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물에 10 ㎍/㎖의 프로테아제 K를 첨가하여 37℃에 30분 동안 반응시켜준다. 반응액을 65℃에 10분 동안 처리하여 효소를 불활성화 시켰다.
실시예 5. 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) 생물막 생성억제활성 평가
실시예 5-1. 비피더스균 시료 평가
8종의 비피도박테리움 속 균주들에 대하여 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)의 생물막 생성억제능력이 뛰어난 활성균주를 선발하기 위해서 다음과 같은 순서에 의해서 진행되어졌다(Kim et al., 2006). 밤새 배양한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894 균주를 생물막용 배지 (M9 액체배지)에 균액을 1 : 100으로 희석하여 배양액을 제조 후 균액을 PVC 96 웰(well) 플레이트 표면(BD Science, San Jose, CA)에 200 ㎕씩 분주하고 48시간 동안 30℃에서 배양을 실시하였다. 생물막 억제능력평가 시 선발된 8종의 비피도박테리움 균주의 세포질 추출물을 10 ㎎/㎖ 첨가한 배지를 사용하였다. 배양종료 후 균액을 제거한 후 3차 증류수로 세척을 2회 실시하고 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet; CV)을 30분간 처리하였다. 정치한 다음 CV를 제거 후 3차 증류수로 추가 3회 세척을 실시하고 최종적으로 95% 에탄올 200 ㎕로 녹인 후 ELISA 리더(Molecular Device, USA)를 이용하여 595 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생물막 생성억제능을 평가하였다.
5-2. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 평가
비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 대상으로 배양 상등액과 세포질 추출물로 제조 후 어느 물질에서 생물막 생성억제효과가 더 뛰어난지 탐색하기 위해 배양 상등액과 세포질 추출물을 10 ㎎/㎖ 첨가한 균액을 이용하여 실시예 5-1과 같이 실험을 실시하였다. 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물의 농도별 생물막 생성억제능력을 측정하여 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 최적 활성농도를 관찰하기 위해 추출물의 단백질 함량 기준으로 2, 10, 20, 50, 그리고 100 ㎎/㎖ 세포질 추출물을 첨가한 균액을 이용하여 실시예 5-1과 같이 생물막 생성억제능력 실험을 실시하였다. 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)의 생물막 생성억제능력이 있는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707 세포질 추출물의 물질에 단백질 분해 효소인 프로테아제 K (10 ㎍/㎖)를 첨가 시 상기방법에 의해 생물막 생성억제효과를 관찰하였다.
실시예 6. 이차원 전기영동
이차원 전기영동을 이용하여 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포 추출물과 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706균주의 세포 추출물을 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894에 처리시 단백질 발현을 비교 분석하고자 하였다. 밤새 배양한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894를 1.0% (v/v) 접종한 LB 액체배지에 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707과 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15706의 세포질 추출물을 각각 20 ㎎/㎖ 첨가하여 37℃에서 6시간 배양하였다. 배양이 종료된 후 원심분리(14,000 g, 5 min, 4℃)하여 회수된 균체를 PBS 완충액으로 2회 세척을 실시한 후 최종적으로 라이시스 완충액(40 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5)로 현탁한 후 소니케이터를 이용하여 1분에 20회 파쇄를 실시하여 세포내 단백질을 회수하였다. 얻어진 단백질은 아세톤 침천법을 이용하여 추출하였다(Arevalo Ferro et al., 2003). 최종적으로 얻어진 단백질은 Bradford 시약(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)을 이용하여 정량한 후 이차원 전기영동을 실시하였다(O'Farrel, 1975). 준비된 200 ㎍의 단백질 시료는 최종 부피가 125 ㎕가 되도록 재수화 완충액(8 M 우레아, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0.2% 양성전해질, 0,0001% 브로모페놀 블루)에 혼합한 후 ReadyStrip(7 cm, nonlinear, Bio-Rad)을 이용하여 20℃에서 12시간 동안 재수화(rehydration)를 실시하였다. 이후 등전점 전기영동 장치(Bio-Rad)를 이용하여 250 V에서 20분, 500 V에서 20분, 4000 V에서 2시간, 4000 V에서 10,000분, 500 V에서 10분간 전기영동을 실시하였다. 평형화를 위해 평형 완충액 Ⅰ (6 M 우레아, 2% SDS 글리세롤, 130 mM DTT, 0.375 M Tris-HCl, pH 8,8)와 평형 완충액 Ⅱ(6M 우레아, 2% SDS, 20% 글리세롤, 135 mM 요오드아세트아미드, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8)에 각각 15분간 침지한 후, 12.5% SDS-PAGE에 옮기고 0.5% 아가로스 겔(agarose gel)로 실링하고 겔당 20 mA으로 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 1시간동안 정착(20% 메탄올, 10% 인산)한 후 쿠마시 블루(coomassie blue) G-250으로 구성된 블루-은 용액(Blue silver solution)(0.12% 염료, 10% 황산암모늄, 10% 인산 및 20% 메탄올)으로 염색하였다.
실시예 7. 단백질 스팟의 비교
염색된 겔은 UMAX 스캐너(800*1,600 dpi, UMAX, UTA 2100XL, USA)를 이용하여 스캔하였다. 이차원 전기영동에서 단백질 스팟의 비교는 PDQuest(ver. 7.1, Bio-Rad)를 사용하여 민감성 0.72, 사이즈 스케일 3의 조건으로 가우시안 모델(Gaussian model)을 이용하여 이미지를 비교분석하였다.
실시예 8. MOLDI-TOF
MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionzation time-of-flight; Voyager DE-STR, Applied Biosystems, USA)을 사용하여 새로 발현된 단백질의 질량 측정 및 동정을 실시하였다. 이때 매트릭스(matrix)는 α-시아노-4-하이드로시신나산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 사용하였으며, 분석 피크(peak)의 보정은 외부 표준시료(close external standards; Calibration mixture, Applied Biosystems)의 값을 적용시켰고 트립신을 내부표준(internal standards)으로 사용하였다. 펩타이드 질량값(Peptide mass value)의 분석은 마스코트 소프트웨어(Mascot software; www.matrixscience.com)를 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information, NIH, USA) 데이터베이스로 검색하였다.
도 1은 비피더스균을 이용하여 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이며,
도 2는 비피더스균을 이용하여 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이고,
도 3은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 이용하여 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이며,
도 4는 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 첨가농도에 따른 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성을 나타낸 도면이고,
도 5는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 세포질 추출물 첨가에 따른 병원성 미생물의 성장을 나타낸 도면이며,
도 6은 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주에 프로테아제 K를 첨가에 따른 병원성 미생물의 자가유도물질 생산억제활성 변화를 나타낸 도면이고,
도 7은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주를 이용하여 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이며,
도 8은 비피더스균 중에서 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주의 첨가농도에 따른 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성을 나타낸 도면이고,
도 9는 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707균주에 프로테아제 K를 첨가에 따른 병원성 미생물의 생물막 생성억제활성 변화를 나타낸 도면이며,
도 10은 이차원 전기영동을 이용한 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7) ATCC 43894의 프로테옴 분석한 도면이다.
Claims (10)
- 식중독을 유발하는 병원성 미생물의 자가유도물질(Autoinducer-2)의 생산 억제 활성이 있는, 비피도박테리움 아돌레센티스(ATCC 15706) 및 비피도박테리움 롱검(ATCC 15707)으로 이루어진 군에서 선택된 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 포함하는 식품 첨가제 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포질 추출물은 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득된 것인 식품 첨가제 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제, 착색제, 중진제(치즈 또는 초콜릿), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린 및 알콜로 이루어진 군에서 선택된 것을 추가로 포함하는 식품 첨가제 조성물.
- 비피도박테리움 아돌레센티스(ATCC 15706) 및 비피도박테리움 롱검(ATCC 15707)으로 이루어진 군에서 선택된 비피더스균 유래의 세포질 추출물을 식중독을 유발하는 병원성 미생물에 접종하는 것을 포함하는 자가유도물질(Autoinducer-2)의 생산 억제 방법.
- 삭제
- 청구항 6에 있어서, 상기 세포질 추출물은 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득된 상등액으로서 15-40 ㎎/㎖로 첨가되는 것인 자가유도물질의 생산 억제 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 세포질 추출물은 유전자 nifU, 유전자 FlgI, 유전자 dsbA 또는 유전자 hybe에 작용하는 것인 자가유도물질의 생산 억제 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 병원성 미생물은 장출혈성대장균, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 예르니시아 엔테로콜리티카, 슈도모나스 에어루기노사, 리스테리아 모노사이토젠, 비브리오 하베이 및 바실러스 세레어스로 이루어진 군에서 선택된 것인 자가유도물질의 생산 억제 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR930021097A (ko) * | 1992-04-29 | 1993-11-22 | 성우경 | 비피더스균이 첨가된 김치 및 그의 제조방법 |
| KR20020044046A (ko) * | 2001-07-30 | 2002-06-14 | 비앤아이티(주) | 복합 생균제를 소재로 한 장기능 개선용 건강기능성식품 |
| KR20020072913A (ko) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | 매일유업주식회사 | 암 세포주 증식 억제제 |
| KR20030033950A (ko) * | 2001-10-20 | 2003-05-01 | 주식회사 알엔에이 | 유산균 세포질 분획물 또는 유산균 파쇄물을 유효성분으로포함하는 동맥경화 억제제 |
-
2009
- 2009-07-10 KR KR1020090063004A patent/KR101104179B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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