CN101124317A - 气体处理生长培养基改变冻干微生物的生存力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备冻干微生物(例如冻干的细菌)的一类方法，其中该类方法的步骤之一中用一种或多种微生物菌株接种培养基。本发明特征在于，在接种步骤之前，用包含惰性气体或还原气体，或此类惰性和还原气体混合物的处理气体处理培养基，从而得到培养基的确定氧化还原电位值Eh，该值小于用空气平衡的培养基时得到的值。

Description

气体处理生长培养基改变冻干微生物的生存力的方法
本发明涉及生产冷冻干燥的微生物(特别是冷冻干燥的细菌)的领域，本发明特别涉及冷冻干燥的乳酸细菌，本发明提出了新的操作条件用于增加冷冻干燥微生物在其随后贮藏期间的生存力。
应当理解，根据经验，所有类型的微生物(细菌、酵母、霉菌等)可被冷冻干燥；冷冻干燥特别用于在微生物收集中保藏菌株。例如冷冻干燥用于乳酸细菌、益生菌菌株和酵母，并且用于非常广泛的工业应用。
还应当理解，在下述情况下微生物可特别用于对起始材料的生物转化：
-制备成品(奶酪、酸牛乳、葡萄酒、啤酒、面包等)，
-制备用于人类或动物营养的生物质(酵母、益生菌等的提取物或粉末)，
-生产目的特定分子(酶、抗生素、氨基酸、调味料等)，
-纯化工业污水、处理有机废料等，等等。
就下文中关于乳酸细菌的实例而言，将乳酸细菌作为发酵剂和益生菌培养物的工业开发高度依赖于所用的防腐技术，以确保稳定的培养物，即培养物可长期存活并具有活性。为此目的通常使用冷冻和冷冻干燥，但是这些技术引入了不想要的副作用，它们是蛋白质变性和降低的细胞生存力。在干燥和贮藏期间对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus(Lb.bulgaricus))上进行的研究已鉴定出影响存活的关键参数的因素，例如温度和经干燥粉末的水活化(具体见Castro等人的工作，发表于1995年Applied Microbiology and Biotechnology.44：172-176上)。粉末生存力的丢失是细胞损伤(偏好的靶标是细胞壁、细胞膜和DNA)以及对脂膜氧化的结果(见Carvelho等人的文章，发表于2004年，在International Dairy Journal.14：835-847中)。
因此，对冷冻或冷冻干燥的乳酸细菌培养物存活及其长期贮藏的优化显然在技术和经济重要性方面都很重要。
应当理解，制备冷冻干燥的菌株从亲本菌株进行，其通常包括4个步骤：接种、在罐中培养、浓缩、贮藏。可以参考例如下述文献：“Freeze Dryingand Advanced Food Technology”，Goldblith等人，Academic Press，1975或“Traitéde Lyophilisation”[Dissertation on freeze-drying]，Louis Rey，由Hermann于1960年发表。
使用经浓缩且处于最优生理状态的培养物来进行接种。可以使用若干技术，其包括：
-使用罐式起始物(tank starter)，
-连续传代的方法，
-直接接种，
-继续接种。
培养的步骤本身在罐中(可以有或没有摇动)，在其组成适合每种微生物的特定需要的培养基中进行。例如可从上文引用的文献中看出，培养基的组成可以有很大的变化，但是通常都存在多糖、甘油、乳、葡萄糖等中的一种或多种元素。
类似地，可调节参数，例如，pH、温度或溶解氧压力。
存在多种类型的培养：
-不连续或分批培养，特别用于制备乳酸酵素(ferment)或面包制作用酵母，
-半连续或“补料分批”培养，例如用于制备对发酵产物敏感的酵素或用于制备对发酵底物的抑制敏感的生物质，
-有或没有再循环的连续培养，没有再循环的连续培养特别用于制备酵素或目的分子，以及用于对废水进行生物纯化。
保藏步骤可以以液体形式，通过冷冻、通过低温保藏、通过冷冻干燥或者通过干燥进行。使用保护剂保护微生物免受保藏处理的有害影响。
如已知的，冷冻干燥是低温、脱水操作，其包括通过升华除去冷冻之后产物中含有的大部分水。
此外，已知氧化还原电位(在文献中通常称作Eh)是由于其性质而存在于所有培养基中的物理化学参数，只要培养基含有至少一种能从氧化状态变为还原状态的分子，及能相反变化的分子。所以，其影响可在所有细胞功能上观察到。其作用已显示于多种类型的微生物上，特别是下述细菌菌株：
-向培养基中加入化学还原剂已使得可以显著改变谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的生长和代谢通量。
-通过气体固定的还原Eh可以改变酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的代谢通量，导致甘油/乙醇比例增加，贮存的糖的积累，以及以液体状态保藏期间酵母存活的增加(参考文献为以本申请人名义的文件FR-2811331)。
在工业培养基中，已通过氧来间接考虑Eh，氧对于乳酸细菌的抑制作用已清楚鉴定。该作用是由于它们不能合成细胞色素和具有血红素核心的酶导致的。
还可以通过作用于Eh来改变益生菌酵素的存活、代谢通量以及调味分子的产量和/或稳定性。所有这些结果已通过由微生物自身、氧化还原分子或热处理进行的对Eh的改变来获得。
冷冻干燥之后以及保藏期间微生物的存活取决于多种因素，包括微生物的初始浓度、生长条件、生长培养基、干燥培养基以及再水化条件。
因此，在冷冻或冷冻干燥类型的保藏方法中，生长培养基是待控制的重要参数；培养基的每种组分可提供保护，特别是通过允许溶质的聚集、外泌多糖的生产以及对膜脂分布的改变来进行，特别是通过增加不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸之比来进行。
之前的研究已显示，在冷冻干燥方法中出现细胞损伤，加入到冷冻干燥培养基中的抗氧化剂可以保护膜脂抵御这种损伤，还显示这种优点，即在冷冻干燥或在贮藏期间，向乳酸细菌的浓缩物中加入(培养之后，即向冷冻干燥或冷冻培养基中加入)化学抗氧化剂分子，可以保护膜脂抵御氧化(参考文献例如文献WO 03/018778或者Fonseca等人2003年发表于International Dairy Journal.13：917-926上的研究)。
由此可见，确实需要能够提供一种生产冷冻干燥的微生物，特别是冷冻干燥的细菌的新方法，该方法使得可以提高冷冻干燥菌株的生存力。
此外，考虑到营养药物应用以及兽医应用，Eh的变化应当涉及不改变产物特征以及保持产物无害的化合物。
如下文中将更详细地描述的，根据本发明，我们提出，在接种之前，使用包含惰性气体和/或还原气体的处理气体，来改变菌株培养基的氧化还原电位。
因此，根据本发明，在接种培养基步骤之前，用包含惰性气体(例如氮气、氩气、氦气或二氧化碳)或惰性气体混合物，或还原气体(例如氢气)，或此类惰性气体和还原气体的混合物的处理气体来处理培养基，以获得比用空气平衡的混合物获得的值小的氧化还原电位值Eh。
处理，即气/液接触可根据本领域技术人员公知的方法之一来进行，例如使用烧结玻璃板漏斗、膜或者多孔物质进行培养基通气，或者通过中空轴涡轮机进行搅动，使用水注射器(hydroinjector)等。
因此，本发明涉及冷冻干燥的微生物(特别是冷冻干燥的细菌，特别是冷冻干燥的乳酸细菌)的一类制备方法，其中该类制备方法的一个或多个步骤中用一种或多种微生物菌株接种培养基，所述方法特征在于，在接种步骤之前，用包含惰性气体或还原气体，或此类气体混合物的处理气体处理培养基，以获得比用空气平衡的培养基获得的值小的培养基氧化还原电位值Eh。
在本发明的优选实施方案中，任选地，还使用一种和/或其他下述安排：
-所述期望获得的氧化还原电位值比用空气平衡的培养基获得的值要小至少100mV；
-所述期望获得的氧化还原电位值是负值；
-接种通过下述方式间接进行：之前进行预培养，随后用该预培养物进行所述接种，并且，在接种预培养物之前，用包含惰性气体或还原气体，或此类气体的混合物的预处理气体处理预培养基，以获得比用空气平衡的预培养基获得的值小的预培养基氧化还原电位Eh值；
-所述处理气体或预处理气体是氢气或者包含氢气；
-所述处理气体或预处理气体是氮气或者包含氮气；
-所述处理气体或预处理气体是氢气和氮气的混合物；
-所述处理气体或预处理气体是氩气或者包含氩气；
-所述处理气体或预处理气体包含氢气和/或氮气以及其他气体，其中所述其他气体从由此产生的冷冻干燥微生物之后使用的角度而言是可接受的；
-所述处理气体或预处理气体还包含其他气体，其选自惰性气体(特别是氦气)以及氧气、二氧化碳和一氧化二氮，以及它们任何比例的混合物，优选地，选自二氧化碳和氧气及其混合物；
-所述处理气体或预处理气体是氢气和二氧化碳的混合物。
此外，还可从下文的详述中看到，由此获得的冷冻干燥的微生物具有改进的性质，特别是在菌株对于冷冻干燥的抗性以及所述菌株随后的保藏期间的抗性方面。
本发明的其他特征和优点将从下文详细描述的实施例中看到，所述实施例涉及乳酸细菌领域。
在改良的5升的Schott瓶中，对灭菌脱脂乳(4.5升)用两种不同气体以150ml/分钟的流速通气处理1小时；还进行不通气处理的对照条件：
-对照(参照)；
-氮气(根据本发明)；
-氮气/氢气混合物，体积比96/4(根据本发明)。
对每种条件进行三次测试。
根据所用的气体，用Mettler Toledo探针测得的由此得到的通过关联回到pH7的氧化还原电位的值(related back to pH7)(通过本领域技术人员公知的方程，例如Leistner和Mirna等式，其可将pH＝x时的培养基的Eh与其在pH 7的值关联起来)如下所示：
  对照   氮气   氮气/氢气
  +300mV   +200mV   -305mV
然后用益生菌干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌株接种培养基(灭菌脱脂乳)，然后置于37℃培养箱中72小时。
72小时的生长之后，回收培养物，加入冷冻干燥填料(传统类型的，如本说明书上文提到的)。使用氢氧化钙溶液对混合物进行中和。将由此获得的制品放置在盘中以进行冷冻干燥。
因此在生长72小时后对培养基中的细菌进行计数，并加入冷冻干燥填料。获得的结果示于下表1中。
统计学处理三种处理获得的计数。“ns”表示观察到的差异不显著(5％时的Newman-Keuls检验)。
由此推断，研究的两种处理气体混合物对生物质的生产之间无显著差异。
表1：在对培养基的3种处理下，72小时生长以及加入填料之后，在液体培养基中获得的干酪乳杆菌的生物质，其被表示为CFU/ml(每种情况中均为3次测试的均值)：
对培养基的处理   生物质   获得的生物质相对对照的百分比
  CFU/ml   ％
对照   6,67.108(ns)
N2   8,33.108(ns) +25％
N2/H2   8,67.108(ns) +30％
下面将检查在D+1天时冷冻干燥的粉末上获得的计数，这就是说，在获得其之后保存了1天的，即，在获得粉末的后一天进行计数。
上述结果示于下表2中。
统计学处理3种处理获得的计数。其显示，首先N2/H2处理和对照处理之间，以及其次，N2处理和对照处理之间观察到的差异是显著的(5％时的Newman-Keuls检验)。
因此观察到，在用氮气-氢气处理的培养基上进行的培养获得的粉末的计数比在对照或N2处理的培养基上进行的那些培养获得的粉末的计数要高。应当注意到，用氮气获得的结果已经显示了相对对照而言的实质性增加。
因此，对用N2/H2处理培养的细胞观察到了菌株对冷冻干燥的抗性的增加，这表明对培养基的处理在菌株对冷冻干燥的抗性方面具有正面作用。
表2：1天之后干酪乳杆菌的生物质(其被表示为CFU/g粉末)是对生长培养基的初始处理的函数(每种情况中均为3次测试的均值)：
  对培养基的处理   生物质   获得的生物质相对对照的百分比
  CFU/g粉末   ％
  对照   6,88.108
  N2   8,41.108   +25％
  N2/H2   1,04.109   +52％
随后的测试中将检查在D+60天(即，在获得其之后保存了60天)对粉末获得的计数结果。它们示于下表3中。
表3：在环境温度保藏60天之后干酪乳杆菌的生物质，其被表示为CFU/g粉末，这作为对生长培养基的初始处理的函数(每种情况中均为3次测试的均值)：
  对培养基的处理   生物质   获得的生物质相对对照的百分比
  CFU/g粉末   ％
  对照   1,24.107
  N2   2,17.107   +75％
  N2/H2   4,02.107   +223％
再次统计学处理3种处理获得的计数。在三种不同处理之间显示了显著差异(5％时的Newman-Keuls检验)。
这些结果表明较之用N2处理的培养基上培养的细胞的那些计数，用N2/H2处理的培养基上培养的细胞计数更高，用N2处理的计数还显著高于用对照获得的计数。
可以明显推断出：用N2和N2/H2对菌株生长培养基的初始处理对于其对冷冻干燥的抗性的正面作用得以证实，其甚至在保藏期间扩增。这显示了在接种步骤之前使用气体改变生长培养基的Eh对于菌株对冷冻干燥的抗性以及对其保藏期间的抗性有益处。

Claims (11)

1.冷冻干燥的微生物，特别是冷冻干燥的细菌的制备方法，所述方法是这样的类型，其中在所述制备方法步骤之一中用一种或多种微生物菌株接种培养基，且特征在于，在接种步骤之前，用包含惰性气体或还原气体，或者此类气体的混合物的处理气体处理培养基，以获得比用空气平衡培养基时获得的值小的培养基氧化还原电位值Eh。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述目的氧化还原电位值比用空气平衡培养基时获得的值小至少100mV。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述目的氧化还原电位值为负值。
4.如前述任意一项权利要求所述的制备方法，其特征在于通过下述方式间接进行接种：提前进行预培养，随后用预培养物进行所述接种，并且在接种所述预培养物之前，用包含惰性气体或还原气体，或此类气体的混合物的预处理气体处理所述预培养基，以获得比用空气平衡预培养基时获得的值小的预培养基氧化还原电位值Eh。
5.如前述任意一项权利要求所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体是氢气或者包含氢气。
6.权利要求1至4中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体是氮气或者包含氮气。
7.权利要求1至4中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体是氢气和氮气的混合物。
8.权利要求1至4中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体是氩气或者包含氩气。
9.如前述任意一项权利要求所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体包含氢气和/或氮气以及其他气体，所述其他气体从由此产生的冷冻干燥微生物之后使用的角度而言是可接受的。
10.权利要求1至8中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体还包含其他气体，所述其他气体选自惰性气体以及氧气、二氧化碳和一氧化二氮及其任何比例的混合物，所述惰性气体特别是氦气，所述其他气体优选选自二氧化碳和氧气及其混合物。
11.权利要求1至4中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述处理气体或预处理气体是氢气和二氧化碳的混合物。
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