CN114010547A - 一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法和应用。所述制备方法包括：一级应力刺激：将酵母菌的一级种子液添加至培养基，一次培养，随后接种至添加有表面活性剂和多糖的培养基，二次培养，得到二级种子液；二级应力刺激：将二级种子液接种至添加有无机盐和/或有机醇的培养基，发酵，得到二级应力刺激产物；三级应力刺激：添加无机物至含有二级应力刺激产物的培养基，发酵，离心，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液；对酵母菌菌体进行破碎，加入蛋白酶消化，得到酵母菌溶胞物；将酵母菌滤液和酵母菌溶胞物混合，得到所述皮肤呼吸因子组合物。所述皮肤呼吸因子组合物理化性质稳定，抗氧化活性物质丰富，能够用于制备化妆品。

Description

一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤呼吸因子（Dermal Respiratory Factor，DRF）是一类酵母菌发酵产物滤液、溶胞物或其混合物的统称。由于酵母菌在生长与代谢过程中往往会产生包括蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、维生素等多种生物活性分子，将发酵后的酵母菌体及滤液进行裂解回收往往能够获得含有多种营养物质的混合体系，该混合物作为化妆品原料不仅具有一定的补水及屏障作用，其中的小分子物质更能直接被皮肤吸收起到营养、抗氧化、调节皮肤角质细胞代谢作用。因此，以酵母菌为原料制备化妆品成为学者们研究的重点与热点。

CN109381352A公开了一种化妆品组合物及其制备方法和应用。所述化妆品组合物包括：水、1,3-丁二醇、德敏舒、小分子透明质酸钠、明串球菌/萝卜根发酵产物滤液、酵母菌溶胞物提取物、复方敏剂、芍药花提取物和精氨酸。该化妆品组合物制备的舒敏保湿喷雾，止痒效果良好，稳定性高、对皮肤温和无刺激，更加安全有效。

CN108785242A公开了一种化妆品组合物，所述化妆品组合物包括：水、尿囊素、1,3-丙二醇、大分子透明质酸钠、紫球藻提取物、甜菜碱、藻提取物、酵母菌溶胞物提取物、黄龙胆根提取物、薰衣草花水以及明串球菌/萝卜根发酵产物滤液。该化妆品组合物制备的面膜稳定性好，对皮肤温和无刺激，大大降低了过敏的概率，孕妇或敏感肌肤均可长期使用。

基于以上研究，可以看到酵母菌的发酵产物可以作为化妆品的制备原料，具有良好的护肤效果。但目前酵母菌直接发酵后裂解菌体制备发酵产物的工艺，使得产物的蛋白质和氨基酸含量受到酵母菌代谢水平的影响，有营养及抗氧化作用的小分子物质含量有限，且作为护肤品原料来看，传统发酵罐发酵酵母菌往往存在发酵水平不可控或过量的问题，使得最终产物的理化性质不适于直接作为护肤品原料。因此在酵母菌产物的发酵与制备中，往往要进行一些复杂的调控或菌种筛选，从而使得酵母细胞分泌有效活性化合物。

目前，皮肤呼吸因子大多采用应力发酵技术，即使用特定波长的紫外线照射酵母细胞，使酵母菌处于紫外刺激的应激状态，从而增加分泌抗氧化、抗紫外所必须的一些活性分子。但该方法一方面影响了酵母菌的正常代谢，使得部分菌体突变为营养缺陷型菌株，降低了产率；另一方面紫外线的刺激往往引起菌体DNA诱变、膜结构通透性异常，使得最终产物的安全性存在更高的风险，且并未从根本上解决可吸收小分子产量较低的问题。

因此，找到一种高效的酵母菌发酵技术，增加酵母菌发酵产物中活性分子的含量，对化妆品技术领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法和应用。所述皮肤呼吸因子组合物具有稳定的理化性质，且抗氧化活性物质含量丰富，能够用于制备化妆品。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种皮肤呼吸因子组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）一级应力刺激：将酵母菌的一级种子液添加至培养基中，一次培养，随后接种至添加有表面活性剂和多糖的培养基中，二次培养，得到二级种子液；

（2）二级应力刺激：将二级种子液接种至添加有无机盐和/或有机醇的培养基中，发酵，得到二级应力刺激产物；

（3）三级应力刺激：添加无机物至含有二级应力刺激产物的培养基中，继续发酵，离心，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液；

（4）制备酵母菌溶胞物：对步骤（3）得到的酵母菌菌体进行破碎，然后加入蛋白酶消化，得到酵母菌溶胞物；

（5）将步骤（3）得到的酵母菌滤液和步骤（4）得到的酵母菌溶胞物混合，得到所述皮肤呼吸因子组合物。

本发明所涉及的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，通过在酵母菌发酵的过程中进行三级化学应力刺激，温和地调控菌体代谢水平和通透性，保证了酵母菌发酵过程的稳定进行，增大了皮肤呼吸因子组合物中抗氧化活性物质的产量，同时保证皮肤呼吸因子组合物具有稳定的理化性质。另外，在酵母菌溶胞物的后处理过程中，加入蛋白酶消化体系，使得皮肤呼吸因子组合物含有更多的小分子氨基酸和多肽，提高了皮肤呼吸因子组合物的品质，降低了酵母菌活性多肽的制备成本。

本发明中，所述一级、二级、三级应力刺激中添加刺激剂中的各组分，分别可以一次性加入或分批次加入。

本发明涉及的表面活性剂包括吐温-80、吐温-40或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是吐温-80与吐温-40的组合或吐温-80与二甲基亚砜的组合，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为吐温-80。

本发明优选吐温-80，能够一定程度上优化酵母菌生长的微环境，影响细胞膜的通透性，同时兼具一定的抑制杂菌生长、增溶脂溶性代谢产物及小分子的作用。

优选地，所述表面活性剂在培养基中的终浓度为0.1-0.5 g/L，例如可以是0.1g/L、0.15 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L、0.4 g/L、0.45 g/L或0.5 g/L等。

本发明涉及的多糖包括海藻糖、乳糖或甘露糖中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如可以是海藻糖与乳糖的组合或乳糖与甘露糖的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为海藻糖。

本发明优选海藻糖，能够提供相较其他多糖更优的水合作用、抗潮湿作用和更高的玻璃化相转变温度（120℃），使得发酵液中的蛋白质、多肽组分不易受到低温等极端环境因素影响，从而出现变性失活等问题。

优选地，所述多糖的质量占培养基质量的1-4%，例如可以是1%、1.5%、1.8%、2%、2.5%、3%、3.5%、3.8%或4%等。

本发明中，所述一次培养的温度为20-30℃，所述一次培养的时间为16-48 h。

所述20-30℃可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

所述16-48 h可以是16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36h、38 h、40 h、42 h、44 h、46 h或48 h等。

本发明中，所述二次培养的温度为20-30℃，所述二次培养的时间为8-20 h。

所述20-30℃可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

所述8-20 h可以是8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h或20 h等。

本发明涉及的无机盐包括乳酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠或柠檬酸镁中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如可以是乳酸钠与硫酸镁的组合或硫酸镁与柠檬酸钠的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为乳酸钠。

本发明优选乳酸钠，能够作为一种相对温和的膜通透性改良试剂刺激菌体，创造易于合成谷胱甘肽等小分子活性物质的应激环境，且不同于紫外等物理刺激会产生不可逆的诱变损伤。

本发明涉及的有机醇包括山梨糖醇。

优选地，所述无机盐和/或有机醇在培养基中的终浓度为0.5-5 g/L，例如可以是0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L或5 g/L等。

本发明中，所述二级种子液的接种条件为二级种子液在600 nm的吸光值为0.1-0.2。

所述0.1-0.2可以是0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19或0.2等。

优选地，步骤（2）所述发酵的温度为20-30℃，所述发酵的溶氧量为30-40%，所述发酵的pH为4-6，所述发酵的时间为2-4 h。

所述20-30℃可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

所述30-40%可以是30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%等。

所述4-6可以是4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8或6等。

所述2-4 h可以是2 h、2.2 h、2.4 h、2.6 h、2.8 h、3 h、3.2 h、3.4 h、3.6 h、3.8h或4 h等。

本发明中，所述无机物包括过氧化氢、氢氧化钠或磷酸二氢钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为过氧化氢。

本发明优选过氧化氢，能够增加酵母菌细胞的氧应力，使菌体倾向于合成抗氧化的多肽和其他小分子物质，且作为氧应力刺激剂，过氧化氢结构简单、易于加热降解，不易对菌体造成毒性。

优选地，所述无机物在培养基中的终浓度为0.5-5 mM，例如可以是0.5 mM、0.6mM、0.8 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM或5 mM等。

优选地，所述添加无机物至含有二级应力刺激产物的培养基时还包括补充添加剂。

优选地，所述添加剂按重量份计包括葡萄糖10-20份，尿素0-2份，甘氨酸0-0.2份，硫酸铵0-0.2份。

所述10-20份可以是10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份等。

所述0-2份不包含0份，可以是0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份、1.2份、1.4份、1.6份、1.8份或2份等。

所述0-0.2份不包含0份，可以是0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份、0.12份、0.14份、0.16份、0.18份或0.2份等。

优选地，步骤（3）所述发酵至二级应力刺激产物在600 nm的吸光值为3-6时升温并保温。

所述3-6可以是3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8或6等。

优选地，所述升温至温度为30-50℃，所述保温持续3-5 h。

所述30-50℃可以是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等。

所述3-5 h可以是3 h、3.2 h、3.4 h、3.6 h、3.8 h、4 h、4.2 h、4.4 h、4.6 h、4.8h或5 h等。

本发明中，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶或甘露聚糖酶中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如可以是木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶的组合或菠萝蛋白酶与β-葡聚糖酶的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的组合。

本发明优选木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的组合，这一组合能有效地催化水解包括酵母菌膜蛋白在内的大分子蛋白质，将其充分消化分解为短肽、氨基酸等易于吸收的生物活性物质。

优选地，所述蛋白酶按重量份计包括：木瓜蛋白酶0.05-0.1份，菠萝蛋白酶0.01-0.05份，β-葡聚糖酶0.01-0.04份，甘露聚糖酶0.03-0.06份。

所述0.05-0.1份可以是0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份或0.1份等。

所述0.01-0.05份可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份或0.05份等。

所述0.01-0.04份可以是0.01份、0.02份、0.03份或0.04份等。

所述0.03-0.06份可以是0.03份、0.04份、0.05份或0.06份等。

本发明中，所述酵母菌溶胞物与酵母菌滤液的体积比为(1-2):1，例如可以是1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1等。

优选地，所述将酵母菌滤液和酵母菌溶胞物混合后，还包括加入防腐剂和保护剂。

优选地，所述防腐剂的添加质量为所述皮肤呼吸因子组合物质量的1-5%，例如可以是1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%等。

优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、苯甲醇或苯甲酸中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如可以是苯氧乙醇与苯甲醇的组合或苯甲醇与苯甲酸的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保护剂的添加质量为所述皮肤呼吸因子组合物质量的1-5%，例如可以是1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%等。

优选地，所述保护剂包括甘氨酸、甘露醇、甘油或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如可以是甘氨酸与甘露醇的组合或甘露醇与甘油的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述。

上述数值范围内未列举的点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第二方面，本发明提供一种皮肤呼吸因子组合物，所述皮肤呼吸因子组合物包括酵母菌溶胞物和酵母菌滤液，所述酵母菌溶胞物和酵母菌滤液采用如第一方面所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的皮肤呼吸因子组合物在制备化妆品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所涉及的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，通过在酵母菌发酵的过程中进行三级化学应力刺激，温和地调控菌体代谢水平和通透性，保证了酵母菌发酵过程的稳定进行，增大了皮肤呼吸因子组合物中抗氧化活性物质的产量，同时保证皮肤呼吸因子组合物具有稳定的理化性质。另外，在酵母菌溶胞物的后处理过程中，加入蛋白酶消化体系，使得皮肤呼吸因子组合物具有更多的小分子氨基酸和多肽，提高了皮肤呼吸因子组合物的品质，降低了酵母菌活性多肽的制备成本。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中相应材料和原料的购买来源如下：

其中，酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 1002；YPD培养基购自生工生物有限公司，型号为B540133；吐温-80购自生工生物有限公司，型号为A600562；木瓜蛋白酶购自生工生物有限公司，型号为A501612；菠萝蛋白酶购自生工生物有限公司，型号为A500243；β-葡聚糖酶购自Solarbio有限公司，型号为G9220；甘露聚糖酶购自Solarbio有限公司，型号为M9280。其余材料和原料无特殊说明，均可从其他商业途径获得。

实施例1

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）制备一级种子液：将50 μL酿酒酵母菌接种于pH为6.5的10 mL无菌YPD培养基中，放入摇床中，摇床速度为150 rpm，35℃培养15 h，得到一级发酵种子液；

（2）一级应力刺激：将100 μL一级发酵种子液接种至120 mL YPD培养基中，25℃活化25 h后，使用接种环接种于180 mL添加了吐温-80（终浓度0.25 g/L）和海藻糖（质量为培养基质量的3%）的YPD培养基中，放入摇床，200 rpm，25℃培养15 h后，提取菌群并重悬为二级发酵种子液；

（3）二级应力刺激：将二级种子液按6%比例转接至含有YPD培养基的培养瓶内进行发酵，待初始600 nm吸光度为0.15时，添加终浓度为2.5 g/L的乳酸钠至培养基中进行刺激，调整温度为25℃，溶氧量为35%，pH为5，放入摇床，250 rpm，发酵3 h；

（4）三级应力刺激：向培养基中补加15%葡萄糖，1%尿素，0.1%甘氨酸，0.1%硫酸铵，同时添加过氧化氢至终浓度为2 mM，继续发酵至600 nm的吸光值为4时，升温至40℃发酵4h；

（5）菌液分离：8℃下，10000 rpm离心2 min，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液，洗涤酵母菌菌体，随后加入5倍酵母菌菌体质量的沸水，煮沸5 min，加入75倍酵母菌菌体质量的冰水重悬酵母菌菌体；

（6）制备酵母菌溶胞物：使用机械破碎法破碎酵母菌菌体45 min，8℃下，10000rpm离心3 min，取上清液，15℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到粗提液。加入蛋白酶体系（蛋白酶体系按质量百分比计包括：3 wU木瓜蛋白酶0.08%、3 wU菠萝蛋白酶0.03%、3 wU β-葡聚糖酶0.02%、3 wU甘露聚糖酶0.05%）至粗提液中，50℃恒温水浴18 h，8℃下，10000 rpm离心3 min，取上清液，15℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到酵母菌溶胞物；

（7）制备皮肤呼吸因子组合物：将酵母菌溶胞物和酵母菌滤液等体积混合，并加入0.8%的苯氧乙醇、0.3%的苯甲醇、2%的甘氨酸、1%的甘油和1%的吐温-80，混合均匀，得到所述皮肤呼吸因子组合物。

实施例2

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）制备一级种子液：将50 μL酿酒酵母菌接种于pH为6的无菌YPD培养基10 mL中，放入摇床中，摇床速度为120 rpm，30℃培养20 h，得到一级发酵种子液；

（2）一级应力刺激：将一级发酵种子液100μL接种至200mL YPD培养基中，20℃活化48 h后，使用接种环接种于50 mL添加了吐温-80（终浓度0.1 g/L）和海藻糖（质量为培养基质量的1%）的YPD培养基中，放入摇床，180 rpm，20℃培养20 h后，提取菌群并重悬为二级发酵种子液；

（3）二级应力刺激：将二级种子液按2%比例转接至含有YPD培养基的培养瓶内进行发酵，待600 nm吸光度为0.1时，添加终浓度为0.5 g/L的乳酸钠至培养体系中进行刺激，调整温度为20℃，溶氧量为30%，pH为4，放入摇床，100 rpm，发酵4 h；

（4）三级应力刺激：向培养基中补加10%葡萄糖，同时添加过氧化氢至终浓度为0.5mM，继续发酵至600 nm的吸光值为3时，升温至30℃发酵5 h；

（5）菌液分离：4℃下，8000 rpm离心，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液，洗涤酵母菌菌体，随后加入等质量的沸水，煮沸10 min，加入50倍酵母菌菌体质量的冰水重悬酵母菌菌体；

（6）制备酵母菌溶胞物：使用机械破碎法破碎酵母菌菌体30 min，4℃下，8000 rpm离心，取上清液，4℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到粗提液。加入蛋白酶体系（蛋白酶体系按粗提液质量的百分比计算包括：2 wU木瓜蛋白酶0.08%、2 wU菠萝蛋白酶0.03%、3 wU β-葡聚糖酶0.02%、2.5 wU甘露聚糖酶0.05%）至粗提液中，40℃恒温水浴24 h，4℃下，8000rpm离心，取上清液，15℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到酵母菌溶胞物；

（7）制备皮肤呼吸因子组合物：将酵母菌溶胞物和酵母菌滤液按1.5:1的体积比，并加入0.4%的苯氧乙醇、0.7%的苯甲醇、1.5%的甘氨酸、1%的甘油和1%的吐温-80，混合均匀，得到所述皮肤呼吸因子组合物。

实施例3

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）制备一级种子液：将75 μL酿酒酵母菌接种于pH为7的15 mL无菌YPD培养基中，放入摇床中，摇床速度为180 rpm，40℃培养10 h，得到一级发酵种子液；

（2）一级应力刺激：将一级发酵种子液200μL接种至150mL YPD培养基中，30℃活化16 h后，使用接种环接种于300 mL添加了吐温80（终浓度0.5 g/L）和海藻糖（质量为培养基质量的4%）的YPD培养基中，放入摇床，220 rpm，30℃培养8 h后，提取菌群并重悬为二级发酵种子液；

（3）二级应力刺激：将二级种子液按10%比例转接至含有YPD培养基的培养瓶内进行发酵，待初始600 nm吸光度为0.2时，添加终浓度为5 g/L的乳酸钠至培养体系中进行刺激，调整温度为30℃，溶氧量为40%，pH为6，放入摇床，400 rpm，发酵2 h；

（4）三级应力刺激：向培养基中补加20%葡萄糖，2%尿素，0.2%甘氨酸，0.2%硫酸铵，同时添加过氧化氢至终浓度为5 mM，继续发酵至600 nm的吸光值为6时，升温至50℃发酵3h；

（5）菌液分离：8℃下，10000 rpm离心，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液，洗涤酵母菌菌体，随后加入5倍酵母菌菌体质量的沸水，煮沸8 min，加入100倍酵母菌菌体质量的冰水重悬酵母菌菌体；

（6）制备酵母菌溶胞物：使用机械破碎法破碎酵母菌菌体60 min，10℃下，10000rpm离心，取上清液，25℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到粗提液。加入蛋白酶体系（蛋白酶体系按粗提液质量的百分比计算包括：3 wU木瓜蛋白酶0.1%、3 wU菠萝蛋白酶0.05%、3 wUβ-葡聚糖酶0.42%、3 wU甘露聚糖酶0.06%）至粗提液中，60℃恒温水浴12 h，8℃下，12000rpm离心，取上清液，25℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到酵母菌溶胞物；

（7）制备皮肤呼吸因子组合物：将酵母菌溶胞物和酵母菌滤液按2:1的体积比混合，并加入0.3%的苯氧乙醇、1%的苯甲醇、1.5%的甘氨酸、2%的甘油和0.8%的吐温-80，混合均匀，得到所述皮肤呼吸因子组合物。

实施例4

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）所述吐温-80等量替换为二甲基亚砜，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

实施例5

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）所述海藻糖等量替换为乳糖，其余参数及步骤与实施例1保持一致。

实施例6

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（3）所述乳酸钠等量替换为硫酸镁，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

实施例7

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（4）所述过氧化氢等量替换为氢氧化钠，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

实施例8

本实施例提供一种皮肤呼吸因子组合物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，所述蛋白酶体系不包括木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，将其减少的质量由β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶补足，所述β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的质量比保持不变，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

对比例1

本对比例提供一种普通发酵方法得到酵母菌发酵产物，具体包括以下步骤：

（1）将50 μL酿酒酵母菌接种于pH为6.5的10 mL无菌YPD培养基中，放入摇床中，摇床速度为150 rpm，35℃培养15 h，得到发酵种子液；

（2）将种子液按6%比例转接至含有YPD培养基的培养瓶内进行发酵，待初始600 nm吸光度为0.15时，调整温度为25℃，溶氧量为35%，pH为5，放入摇床，250 rpm，发酵3 h；

（3）向培养基中补加15%葡萄糖，1%尿素，0.1%甘氨酸，0.1%硫酸铵，同时添加过氧化氢至终浓度为2 mM，继续发酵至600 nm的吸光值为4时，升温至40℃发酵4 h；

（4）8℃下，10000 rpm离心2 min，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液，洗涤酵母菌菌体，加入75倍酵母菌菌体质量的冰水重悬酵母菌菌体；

（5）使用机械破碎法破碎酵母菌菌体45 min，8℃下，10000 rpm离心3 min，取上清液，15℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到粗提溶胞物；

（6）将酵母菌溶胞物和酵母菌滤液按1:1的体积比混合，得到普通发酵法制备的皮肤呼吸因子组合物。

对比例2

本对比例提供一种紫外应力发酵方法得到酵母菌发酵产物，具体包括以下步骤：

（1）将50 μL酿酒酵母菌接种于pH为6.5的10 mL无菌YPD培养基中，放入摇床中，摇床速度为150 rpm，35℃培养15 h，得到发酵种子液；

（2）将种子液按6%比例转接至含有YPD培养基的培养瓶内进行发酵，待初始600 nm吸光度为0.15时，调整温度为25℃，溶氧量为35%，pH为5，放入摇床，250 rpm，同时使用紫外光每隔10 min照射1 min，发酵3 h；

（3）向培养基中补加15%葡萄糖，1%尿素，0.1%甘氨酸，0.1%硫酸铵，同时添加过氧化氢至终浓度为2 mM，同时使用紫外光1 min/日光9 min间隔照射5轮后继续发酵至600 nm的吸光值为4时，升温至40℃发酵4 h；

（4）8℃下，10000 rpm离心2 min，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液，洗涤酵母菌菌体，加入75倍酵母菌菌体质量的冰水重悬酵母菌菌体；

（5）使用机械破碎法破碎酵母菌菌体45 min，8℃下，10000 rpm离心3 min，取上清液，15℃，用0.22 μm滤膜抽滤除杂，得到粗提溶胞物；

（6）将酵母菌溶胞物和酵母菌滤液按1:1的体积比混合，得到紫外应力发酵方法制备的皮肤呼吸因子组合物。

对比例3

本对比例提供一种酵母菌发酵产物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）所述25℃活化25 h后，不添加吐温-80和海藻糖至YPD培养基中，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

对比例4

本对比例提供一种酵母菌发酵产物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（3）所述600 nm吸光度为0.1时，不添加乳酸钠至YPD培养基中，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

对比例5

本对比例提供一种酵母菌发酵产物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（4）不添加过氧化氢至YPD培养基中，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

对比例6

本对比例提供一种酵母菌发酵产物及其制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（6）所述得到粗提液后不添加蛋白酶体系，其余参数与步骤与实施例1保持一致。

测试例1

本测试例对实施例1-8和对比例1-6制备的酵母菌溶胞物与酵母菌滤液的混合物（酵母菌溶胞物与酵母菌滤液的体积比为1:1）进行谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量测试，GSH是一种重要的抗氧化活性三肽，其含量是酵母菌发酵产物抗氧化水平的一种常见检测标准。酵母菌溶胞物和酵母菌滤液的混合物的GSH含量越高，表明其作为化妆品的制备原料，更能提高化妆品的抗氧化功效。检测方法如下：

采用亚硝基铁氰化钠法：分别取1 mL的14种酵母菌溶胞物与酵母菌滤液的混合物置于3 mL硫酸铵饱和溶液中，并加入0.5 mL质量浓度1%的亚硝基铁氰化钠试剂和1.5 mL4M氨水，混合均匀后，测定525 nm吸光度，得到GSH含量。

根据配制的谷胱甘肽标准品（Sigma-Aldrich，编号Sigma-G4251）500 mg/L、250mg/L、125 mg/L、100 mg/L、50 mg/L在亚硝基铁氰化钠法中525 nm吸光度，得标准曲线y=3.982x+0.005（其中，y为525 nm的光密度值，x为对应谷胱甘肽浓度，mg/L）。

故GSH含量计算公式如下：

GSH含量 =(样品在525 nm的吸光度-0.005)/3.982。

结果统计如下表1所示（其中，每组实验平行做3次，表中数据为3次结果的平均值）：

表1

由上表数据可知，与对比例1-2相比，采用本发明的制备方法，通过三级应力刺激得到的皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量更高。与对比例3-5相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量更高，表明应力刺激的次数会影响皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量。与对比例6和实施例8相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量更高，说明蛋白酶体系会对皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量造成影响。与实施例4-7相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量更高，表明应力刺激中刺激剂的选择会影响皮肤呼吸因子组合物中GSH的含量。

测试例2

本测试例对实施例1制备的皮肤呼吸因子组合物和对比例1-2制备的酵母菌发酵产物进行pH、电导率、还原糖含量以及固含量等四项指标的检测。其中pH反映皮肤呼吸因子组合物的酸性，呈弱酸性时贴合人体皮肤表面的pH，电导率反映皮肤呼吸因子组合物中无机盐的含量，还原糖含量反映皮肤呼吸因子组合物中糖代谢的程度，固含量反映皮肤呼吸因子组合物中多肽、生长因子等活性物质的含量。当皮肤呼吸因子组合物的pH为6-7，电导率为3-4 mS，还原糖含量为3-5 mg/mL，固含量为2-4%时，所述皮肤呼吸因子组合物用于制备化妆品，能够提高化妆品的保湿和抗氧化的功效。

检测方法如下：

其中，pH及电导率采用pH电导测定仪进行检测；

还原糖含量采用二硝基水杨酸比色法测定：

将6.3 g DNS和262 mL 2mol/L氢氧化钠，加到500 mL含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5 g重苯酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000 mL，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。

分别取葡萄糖标准液(1 mg/mL)0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL试管中，分别准确加入3,5-二硝基水杨酸试剂2 mL，沸水浴加热2 min，流水冷却，用水补足到15 mL,在540 nm波长下测定吸光度。可由此得出标准曲线：y=1.1142x+0.0107（其中，y为525 nm的光密度值、x为对应还原糖含量，mg/L）。

样品液稀释，使糖浓度为0.1-1 mg/mL，取稀释后的样品液1.0 mL于15 mL刻度试管中，加3,5-二硝基水杨酸试剂2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷却后用水补足到15 mL，在540nm波长下测定吸光度，从标准曲线查出还原糖含量。

还原糖含量计算公式如下：

还原糖含量=(样品在540 nm的吸光度-0.0107)×样品稀释倍数/1.1142。

固含量检测方法为：分别取1 mL的实施例1制备的皮肤呼吸因子组合物和对比例1-2制备的酵母菌发酵产物为样品，于105℃的烘箱中烘干3 h，取出残余固体，称重。固含量计算公式为：

固含量（%）=残余固体质量/样品质量×100%。

结果统计如下表2所示（其中，每组实验平行做3次，表中数据为3次结果的平均值）：

表2

由上表数据可知，与对比例1-2相比，本发明得到的皮肤呼吸因子组合物的pH、电导率、还原糖和固含量与普通酵母菌发酵产物相差不大，但比紫外照射应力酵母菌发酵产物的固含量更高，表明本发明提供的皮肤呼吸因子组合物产物具有稳定的理化性质，且比紫外照射应力酵母菌发酵产物具有含量更为丰富的生物活性物质，用于制备化妆品，能够提高化妆品保湿、抗氧化的功效。

测试例3

本测试例对实施例1-8制备的皮肤呼吸因子组合物、对比例1制备的酵母菌发酵产物和对比例3-6制备的酵母菌发酵产物进行总氮含量的测试。总氮含量反映多肽含量，多肽具有抗氧化、修复皮肤的功效。因此，以总氮含量高的皮肤呼吸因子组合物为原料制得的化妆品具有更好的抗氧化、修复皮肤的功效。

测试方法如下：

使用凯氏定氮法分析产物总氮含量：以实施例1-8制备的皮肤呼吸因子组合物、对比例1制备的酵母菌发酵产物和对比例3-6制备的酵母菌发酵产物为样品，稀释10倍后吸取20 mL添加到50 mL干燥的凯氏烧瓶内。加入300 mg硫酸钾-硫酸铜混合粉末，再加入3 mL浓硫酸。加热保持瓶内液体沸腾，直至消化液清澈透明。另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验组，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。

将微量凯氏蒸馏装置洗涤(先用水蒸气洗涤)干净，将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100 mL的容量瓶，用蒸馏水定容。吸取20 mL稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10 mL 30%的氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。取三角瓶，加入10 mL硼酸-田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。

加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子蒸馏，使三角瓶中的混合液由紫红色变为绿色。蒸馏15 min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸2 min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

各样品组和空白试验组均蒸馏完毕后，用0.01 M标准盐酸滴定，至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

样品总氮量(%)=(A-B)×C×14×100×D/20

式中：A为样品滴定时消耗的标准盐酸体积；B为空白滴定时消耗的盐酸体积；C为标准盐酸的当量浓度；D为样品质量。

结果统计如下表3所示（其中，每组实验平行做3次，表中数据为3次结果的平均值）：

表3

由上表数据可知，本发明所提供的皮肤呼吸因子组合物的总氮含量为3.20%，是普通发酵的2.06倍。与对比例3-5相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中总氮含量更高，说明应力刺激的次数会影响皮肤呼吸因子组合物的总氮含量。与对比例6和实施例8相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中总氮含量更高，说明蛋白酶体系会对皮肤呼吸因子组合物的总氮含量造成影响。与实施例4-7相比，实施例1得到的皮肤呼吸因子组合物中总氮含量更高，表明应力刺激中刺激剂的选择会影响皮肤呼吸因子组合物的总氮含量。

综上所述，采用本发明提供的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，在酵母菌发酵的过程中分别进行三级化学应力刺激，温和地调控菌体代谢水平和通透性，保证了酵母菌发酵过程的稳定进行，增大了皮肤呼吸因子组合物中抗氧化活性物质的产量，同时保证皮肤呼吸因子组合物理化性质的稳定。另外，在酵母菌溶胞物的后处理过程中，加入蛋白酶消化体系，使得皮肤呼吸因子组合物具有更多的小分子氨基酸和多肽，提高了皮肤呼吸因子组合物的品质，降低了酵母菌活性多肽的制备成本。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）一级应力刺激：将酵母菌的一级种子液添加至培养基中，一次培养，随后接种至添加有表面活性剂和多糖的培养基中，二次培养，得到二级种子液；

（2）二级应力刺激：将二级种子液接种至添加有无机盐和/或有机醇的培养基中，发酵，得到二级应力刺激产物；

（3）三级应力刺激：添加无机物至含有二级应力刺激产物的培养基中，继续发酵，离心，得到酵母菌菌体和酵母菌滤液；

（4）制备酵母菌溶胞物：对步骤（3）得到的酵母菌菌体进行破碎，然后加入蛋白酶消化，得到酵母菌溶胞物；

（5）将步骤（3）得到的酵母菌滤液和步骤（4）得到的酵母菌溶胞物混合，得到所述皮肤呼吸因子组合物。

2.根据权利要求1所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂包括吐温-80、吐温-40或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合，优选为吐温-80；

优选地，所述表面活性剂在培养基中的终浓度为0.1-0.5 g/L；

优选地，所述多糖包括海藻糖、乳糖或甘露糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为海藻糖；

优选地，所述多糖的质量占培养基质量的1-4%；

优选地，所述一次培养的温度为20-30℃，所述一次培养的时间为16-48 h；

优选地，所述二次培养的温度为20-30℃，所述二次培养的时间为8-20 h。

3.根据权利要求1或2所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述无机盐包括乳酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠或柠檬酸镁中的任意一种或至少两种的组合，优选为乳酸钠；

优选地，所述有机醇包括山梨糖醇；

优选地，所述无机盐和/或有机醇在培养基中的终浓度为0.5-5 g/L；

优选地，所述二级种子液的接种条件为二级种子液在600 nm的吸光值为0.1-0.2；

优选地，步骤（2）所述发酵的温度为20-30℃，所述发酵的溶氧量为30-40%，所述发酵的pH为4-6，所述发酵的时间为2-4 h。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述无机物包括过氧化氢、氢氧化钠或磷酸二氢钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为过氧化氢；

优选地，所述无机物在培养基中的终浓度为0.5-5 mM；

优选地，所述添加无机物至含有二级应力刺激产物的培养基时还包括补充添加剂；

优选地，所述添加剂按重量份计包括葡萄糖10-20份，尿素0-2份，甘氨酸0-0.2份，硫酸铵0-0.2份；

优选地，步骤（3）所述发酵至二级应力刺激产物在600 nm的吸光值为3-6时升温并保温；

优选地，所述升温至温度为30-50℃，所述保温持续3-5 h。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶或甘露聚糖酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的组合；

优选地，所述蛋白酶按重量份计包括：木瓜蛋白酶0.05-0.1份，菠萝蛋白酶0.01-0.05份，β-葡聚糖酶0.01-0.04份，甘露聚糖酶0.03-0.06份。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述酵母菌溶胞物与酵母菌滤液的体积比为(1-2):1。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述将酵母菌滤液和酵母菌溶胞物混合后，还包括加入防腐剂和保护剂。

8.根据权利要求7所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法，其特征在于，所述防腐剂的添加质量为所述皮肤呼吸因子组合物质量的1-5%；

优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、苯甲醇或苯甲酸中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述保护剂的添加质量为所述皮肤呼吸因子组合物质量的1-5%；

优选地，所述保护剂包括甘氨酸、甘露醇、甘油或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种皮肤呼吸因子组合物，其特征在于，所述皮肤呼吸因子组合物包括酵母菌溶胞物和酵母菌滤液，所述酵母菌溶胞物和酵母菌滤液采用如权利要求1-8中任一项所述的皮肤呼吸因子组合物的制备方法制备得到。

10.如权利要求9所述的皮肤呼吸因子组合物在制备化妆品中的应用。