CN112358970A

CN112358970A - 拟微绿球藻及其应用

Info

Publication number: CN112358970A
Application number: CN202011328881.1A
Authority: CN
Inventors: 李林; 乔瓦尼科利卡; 吴玉双; 胡桑; 秦捷; 王敬; 李文香; 俞威
Original assignee: Guangxi Xiaozao Agricultural Technology Co ltd
Current assignee: Guangxi Xiaozao Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112358970B

Abstract

本发明提供拟微绿球藻及其应用。该拟微绿球藻的分类命名为Nannochloropsis salina，于2020年10月30日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61177。本发明实施例的拟微绿球藻至少具有如下有益效果：相比于拟微绿球藻的野生株，本实施例所筛选出的拟微绿球藻的脂肪酸产量、特别是二十碳五烯酸的产量有了较为明显的提升，可以作为大规模工业化生产的、稳定的优良藻种使用。

Description

拟微绿球藻及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及拟微绿球藻及其应用。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)是ω-3型不饱和脂肪酸，在营养学和药理学上有重要的作用，它不仅可以促进大脑发育、改善大脑功能等，还对类风湿性关节炎等炎症、高血压、糖尿病等疾病的预防和治疗有明显的积极作用。海洋微藻是EPA的初级生产者，可利用有机碳源进行异养生长。研究人员发现，如金藻门的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)，红藻门的紫球藻(Porphyridium cruentum)，硅藻门的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、蒜头藻(Monodus subterraneus)、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)等都是EPA的较好来源。通过培养条件的优化、代谢过程控制和基因工程手段可以进一步提高海洋微藻的EPA产量。

拟微绿球藻是一类个体较小、生长速度较快的海洋微藻。拟微绿球藻细胞内的EPA含量一般在3％～5％，但株系、分离地的不同会使不同的拟微绿球藻藻株之间的EPA含量产生较为明显的差别。虽然相比其他种属的海洋微藻，拟微绿球藻的总EPA含量已在一个较高水平，但距离实现可大规模工业化生产的、稳定的优良藻种还有一定差距。因此，有必要提供一种能够高产EPA的拟微绿球藻。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够高产EPA的拟微绿球藻及其应用。

第一方面，本发明的一个实施例提供一种高产EPA的拟微绿球藻，该拟微绿球藻的分类命名为Nannochloropsis salina，于2020年10月30日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61177。

本发明实施例的拟微绿球藻至少具有如下有益效果：

相比于拟微绿球藻的野生株，本实施例所筛选出的拟微绿球藻的脂肪酸产量、特别是二十碳五烯酸的产量有了较为明显的提升，可以作为大规模工业化生产的、稳定的优良藻种使用。

第二方面，本发明的一个实施例提供上述拟微绿球藻在生产脂肪酸中的应用。上述拟微绿球藻中脂肪酸含量特别是二十碳五烯酸含量较高、遗传性状稳定，可以用于生产脂肪酸、特别是作为工业化大规模生产脂肪酸的藻株使用，从而提高生产效率，快速获得大量脂肪酸产物。

根据本发明的一些实施例的应用，上述脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。上述拟微绿球藻中多不饱和脂肪酸、特别是二十碳五烯酸、二十碳四烯酸的含量较一般的野生型拟微绿球藻有较大提升，因而能够高效生产上述两类脂肪酸。

第三方面，本发明的一个实施例提供上述拟微绿球藻在制备生物制剂中的应用。

根据本发明的一些实施例的应用，上述生物制剂包含多不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。二十碳五烯酸、二十碳四烯酸等多不饱和脂肪酸在营养学和药理学上有重要的作用，因此，通过上述拟微绿球藻制备含有上述多不饱和脂肪酸的制剂，从而用于营养学和药理学上的生物制剂使用。

根据本发明的一些实施例的应用，上述生物制剂用于预防和/或治疗以下疾病中的至少一种：类风湿性关节炎、高血压、糖尿病、冠心病、炎症。二十碳五烯酸是人体常用的几种ω-3脂肪酸之一。增加EPA的吸收对类风湿性关节炎、高血压、糖尿病、冠心病和炎症(例如风湿性关节炎)具有一定的预防和治疗作用。

第四方面，本发明的一个实施例提供一种生物制剂，该生物制剂包含上述的拟微绿球藻，或，该生物制剂的制备原料包含上述的拟微绿球藻。二十碳五烯酸是人体常用的几种ω-3脂肪酸之一。增加EPA的吸收对类风湿性关节炎、高血压、糖尿病、冠心病和炎症(例如风湿性关节炎)具有一定的预防和治疗作用，现已有相关实验证据证明，例如：柳泽深,姜悦,陈峰.花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸在炎症中的作用概述[J]食品安全质量检测学报,2016,7(10):3890-3899；康黎,邹勇,李宏增,刘军,张莹.二十碳五烯酸在糖尿病心肌病损伤中的作用及机制[J].心脏杂志,2019,31(05):521-525。而二十碳四烯酸对人体组织、大脑和神经系统发育有重要作用，可以通过上述拟微绿球藻用于相应制剂的生产，例如乳制品的添加剂。

第五方面，本发明的一个实施例提供一种脂肪酸的生产方法，该生产方法包括以下步骤：培养上述的拟微绿球藻，从培养产物中提取脂肪酸。该拟微绿球藻中脂肪酸含量特别是多不饱和脂肪酸(例如二十碳五烯酸)的含量较高、遗传性状稳定，可以用于生产脂肪酸、特别是作为工业化大规模生产脂肪酸的藻株使用，能够高效快速获得大量脂肪酸产物、特别是不饱和脂肪酸。从培养产物中提取多不饱和脂肪酸的方法具体可以采用诸如分子真空蒸馏法、超临界流体CO₂萃取法、层析分离法、尿素包合法等现有的常规方法，或者其它全新的提取方法，或者在现有的常规方法基础上改进来的其它方法。

根据本发明的一些实施例的脂肪酸的生产方法，脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的拟微绿球藻细胞密度与细胞光密度之间的关系曲线。

图2是本发明的一个实施例的拟微绿球藻的生长曲线。

图3是本发明的一个实施例的不同浓度精喹禾灵对拟微绿球藻生长的光密度的检测结果。

图4是本发明的一个实施例的不同浓度精喹禾灵对拟微绿球藻生长的相对抑制率和比生长速率的检测结果。

图5是本发明的一个实施例的空白对照组的原始藻株涂布平板培养30天后的照片。

图6是本发明的一个实施例的Q5藻株涂布平板培养30天后的照片。

图7是本发明的一个实施例的Q5藻株不同代际的生长曲线。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

1.藻种培养

本实验所用藻细胞为拟微绿球藻(Nannochloropsis salina)，编号为XZN200406，来源于深圳市前海小藻科技有限公司的微藻藻种室。

本实验中所用精喹禾灵来源于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本实验中所用液体培养基为MASM改良液体培养基，具体组分如表1所示：

表1.MASM改良液体培养基的组分

培养基的具体制备和藻种培养的步骤如下：

(1)将NaCl溶于去离子水中，121℃，30min灭菌后冷却备用，得到2.2wt％的氯化钠盐溶液。

(2)灭菌冷却后的盐溶液温度降至室温，在生物安全柜中操作，加入MgSO₄·7H₂O、KCl、NaNO₃、CaCl₂·2H₂O、KH₂PO₄、NH₄Cl制成MASM改良液体培养基。

(3)按MASM改良液体培养基2％的体积量将保存的拟微绿球藻XZN200406藻液接种到液体培养基上。

(4)接种后的培养瓶放入光照培养架上，设定培养温度为23±1℃，光照强度为3000～6000lux，光照周期为14h光：10h暗，通入空气与1％～2％二氧化碳的混合气体。

(5)每隔4天取一次无菌藻液，测量其细胞密度(OD₆₈₂)，定期观察培养瓶内生长情况，并及时调节光源。

2.细胞计数

(1)将每隔4天所取的无菌藻液充分振荡后，取1mL于1.5mLEP管中。

(2)使用生理盐水，将无菌藻液稀释至OD₆₈₂值在0.1～0.2范围内。

(3)血球计数板加盖玻片，用20μL移液枪取出10μL稀释后的藻液于血球计数板计数区两侧凹陷处，均匀地打出藻液，使其自然充满整个计数区。

(4)将血球计数板置于光学显微镜下进行计数。计数时，先用10倍物镜找到计数区，再转换40倍物镜进行计数。

本实施例中采用25×16规格得血球计数板，依照“数上不数下、数左不数右”原则分别计算计数区域“左上角、右上角、左下角、右下角、中间”格的细胞数目A。

每毫升液体中细胞数目(A_总)计算公式：A_总＝A×5×2×10⁴。

3.细胞计数与细胞光密度值(OD₆₈₂值)关系的确定

取指数生长末期的藻液，加入MASM改良液体培养基进行梯度稀释，直至细胞密度约为30万/mL。使用酶标仪测量每个稀释浓度下对应的藻液细胞的吸光度值，每组做2个平行。绘制细胞密度与细胞光密度之间的关系曲线，结果如图1所示，从图1可以看出，在细胞密度为90万/mL～4600万/mL的范围内，细胞密度与光密度值(OD₆₈₂值)呈良好的线性对应关系，相关系数R²＝0.9986。因此，培养拟微绿球藻N.salina时，可以用细胞的光密度值来反映细胞的密度。

4.比生长速率(specific growth rate)的测定

将藻株以相同起始密度接种，自接种藻细胞开始，定期取样并用酶标仪测定682nm下的吸光值，同时绘制该藻株生长曲线。

比生长速率计算公式v＝(lnN_t-lnN₀)/t；

其中，N₀表示测量起始光密度，Nt表示测量结束时光密度。

如图2所示，藻株培养至5～10天时生长速率最快，因此选择培养8天的藻株(对数生长期，OD₆₈₂约为0.42)进行筛选，确保该藻株生长活力最旺盛。

实施例1

精喹禾灵筛选拟微绿球藻

1.精喹禾灵对拟微绿球藻的生长抑制

(1)称取10mg精喹禾灵粉末溶于1mL DMSO中，即得26.8μmol/mL的诱导剂母液。

(2)向MASM改良液体培养基中添加诱导剂母液，制备出精喹禾灵终浓度为0、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L、10mmol/L和12.5mmol/L的液体培养基，依次分别记为Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5组，其中，不添加精喹禾灵的培养基Q0作为对照。

(3)按照100mL液体培养基中添加2mL的藻种量的比例，向配制出的6个梯度浓度的三角瓶培养液中接种藻液，透气膜封口，摇瓶记为F₁代。将接种后的三角瓶置于光照摇床上，设定转速为100r/min，23±1℃，3000～6000Lux，开始恒温光照培养；每隔4天左右取样后统计细胞数，培养14天。

根据公式w％＝1-实验组光密度/对照出现光密度×100％，计算精喹禾灵对拟微绿球藻生长的抑制率。结果见表2、图3和图4。图3是不同浓度精喹禾灵对拟微绿球藻生长的光密度检测结果。图4是不同浓度精喹禾灵对拟微绿球藻生长的相对抑制率和比生长速率的检测结果，其中，折线表示比生长速率，柱状图表示相对抑制率。

表2.三角瓶中不同浓度精喹禾灵对拟微绿球藻生长的影响

从表2和图3看出，精喹禾灵的浓度越高，对于拟微绿球藻(N.salina)的生长的抑制作用就越明显，相对抑制率增加，摇瓶细胞数目减少，比生长速率逐渐降低，当精喹禾灵浓度为12.5mmol/L时，相对抑制率最高达到28.36％。

2.拟微绿球藻藻株涂布平板

(1)按前述MASM改良液体培养基配方，配制200mL液体培养基，并添加0.8％含量的琼脂制成MASM固体培养基，121℃，高压灭菌30min。

(2)待固体培养基降温至50℃时，添加诱导剂母液，制备终浓度为12.5mmol/L的固体培养基，倒入90mm平皿中，制成相应浓度的固体筛选培养基。将藻液稀释至5000个细胞/mL后，取100μL稀释藻液涂布于平板上。均匀涂板后，将平板用封口膜封口，置光照培养箱中倒置培养，培养条件为23±1℃，3000～6000lux光照培养；培养一个月左右的时间，挑选出在含精喹禾灵试剂的平板生长较大的藻落。

结果参考图5和图6，其中，图5是空白对照组的原始藻株涂布平板培养30天后的照片，图6是Q5藻株涂布平板培养30天后的照片。比较图5和图6可以看出，筛选的藻株Q5生长在含有精喹禾灵试剂平板，整体藻落比原始藻株偏小。

本实施例中筛选出的Q5藻株已于2020年10月30日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61177。

实施例2

生长性能测试

配制6个1000mL瓶培养液，121℃灭菌30min后，冷却备用；在生物安全柜内按前述MASM改良液体培养基配方添加各营养盐母液，制成液体培养基；培养液配制完成后，按其体积5％量(约50mL)分别接入Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5组藻液，各两个平行，混匀后放入光照培养架，23±1℃培养，光照强度为3000～6000lux，通入空气与1％～2％二氧化碳的混合气体，培养瓶记为F₂代。定期取无菌样，测定其光密度变化，并绘制出生长曲线变化图。培养14天后，取出培养瓶收集藻液，测定其比生长速率。将藻液离心收集，纯水清洗3次无机盐后，将样品冷冻干燥，参照《GB5009.168—2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》测量EPA、ARA、PUFAS、总脂肪酸含量等参数。

将生长最快的Q5组藻株的F₂代培养瓶，培养至10～14天，取出部分藻液转接至下一代培养瓶中，记为F₃代，培养条件同上；定期取无菌样，测定其光密度变化，并绘制出生长曲线变化图。将F₃代藻株，培养至10～14天，取出部分藻液转接至下一代培养瓶中，记为F₄代，培养条件同上；定期取无菌样，测定其光密度变化，并绘制出生长曲线变化图。参照《GB5009.168—2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》测量EPA、ARA(二十碳四烯酸)、PUFAs(多不饱和脂肪酸)、总脂肪酸含量等参数。

结果见表3，反映了精喹禾灵筛出的藻株在液体培养基中的生长变化情况。

表3.精喹禾灵筛选藻株的生长变化情况

由表2中可以看出，在1000mL培养瓶中培养拟微绿球藻(N.salina)时，和对照组Q0相比，经过2.5mmol/L以上的精喹禾灵筛选(Q2～Q5)、特别是经过5mmol/L以上的精喹禾灵筛选(Q3～Q5)、尤其是经过10～12.5mmol/L的精喹禾灵筛选(Q4～Q5)的藻株的生长速率有了较为明显的提升，拟微绿球藻经精喹禾灵试剂筛选后，最快比生长速率相对提升了13.66％。

总体的脂肪酸含量变化情况见表4。

表4.精喹禾灵筛选藻株的脂肪酸含量检测结果

从表中可以看出，相比于对照组，经精喹禾灵诱导筛选出的藻株的总脂肪酸含量、EPA含量、ARA含量、总脂肪酸中EPA的比重、总脂肪酸中ARA的比重、总脂肪酸中PUFAs的比重都有一定程度的上升。其中Q2～Q5提升较为明显，而在这之中，又以Q4和Q5的提升最为明显。

Q5藻株不同代际的生长变化情况见表5和图7，脂肪酸含量变化情况见表6。结合表5和表6可以看出，筛选藻株Q5经数代传代培养后，遗传性状稳定，比生长速率快，环境适应性强，生长曲线稳定，能在较短时间内(14天)培养至0.8以上，细胞数可达5×10⁷个/mL，生长性能稳定，符合工业化生产藻株需求。同时，检测结果显示，不同代际的藻粉中总脂肪酸含量均在25％左右，但随着传代次数的增加，EPA在总脂肪酸含量中的占比提升，而且EPA含量(干重)提升到7％以上，相比于原始藻株提高了36％，具有良好的应用前景。

表5.Q5藻株不同代际的生长变化情况

天数	F<sub>0</sub>	F<sub>1</sub>	F<sub>2</sub>	F<sub>3</sub>	F<sub>4</sub>
						0	0.07	0.06	0.08	0.07	0.07
3	0.11	0.08	0.29	0.27	0.21
						7	0.39	0.14	0.58	0.48	0.49
9	0.48	0.19	0.69	0.63	0.62
						12	0.64	0.26	0.83	0.76	0.74
14	0.67	0.31	0.94	0.82	0.86

表6Q5藻株不同代际的脂肪酸含量

	F<sub>0</sub>	F<sub>2</sub>	F<sub>3</sub>	F<sub>4</sub>
					总脂肪酸含量(g/100g)	24.54	26.27	25.58	25.52
EPA占总脂肪酸含量/％	21.36	28.23	28.42	27.87
					ARA占总脂肪酸含量/％	3.91	4.72	4.77	5.67
PUFAS占总脂肪酸含量/％	27.71	36.09	36.38	33.55
					ARA占干重/％	0.96	1.24	1.22	1.45
EPA占干重/％	5.24	7.42	7.27	7.11

实施例3

本实施例提供一种脂肪酸的制备方法，通过光催化反应器接种实施例2中的Q5藻株进行规模化培养，培养产物经氯仿/甲醇提取油脂后通过色谱分离出对应的ARA和EPA。该拟微绿球藻中的脂肪酸含量较高、遗传性状稳定，能够高效快速获得大量脂肪酸产物。

实施例4

本实施例提供一种生物制剂，包括实施例2中的Q5藻株原料。该生物制剂所含的拟微绿球藻中脂肪酸特别是二十碳五烯酸和二十碳四烯酸的含量较高，对类风湿性关节炎、高血压、糖尿病、冠心病和炎症(例如风湿性关节炎)具有较好的预防和治疗作用。

上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.拟微绿球藻，分类命名为Nannochloropsis salina，于2020年10月30日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61177。

2.权利要求1所述的拟微绿球藻在生产脂肪酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。

4.权利要求1所述的拟微绿球藻在制备生物制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物制剂包含二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物制剂用于预防和/或治疗以下疾病中的至少一种：高血压、糖尿病、冠心病、炎症。

7.生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的拟微绿球藻，或，所述生物制剂的制备原料包含权利要求1所述的拟微绿球藻。

8.脂肪酸的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求1所述的拟微绿球藻，从培养产物中提取所述脂肪酸。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十碳四烯酸中的至少一种。