CN103773696A - 拟微绿球藻突变株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种保藏号为CGMCC NO.6009的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2，具有以下用途：在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用；在生产或制备食品方面的应用；在生产饵料或动物饲料方面的应用；在生产生物燃料尤其是生物柴油中的应用；在处理含氮磷污水方面的应用；在二氧化碳减排方面的应用；在生产长链不饱和脂肪酸尤其是EPA方面的应用。与野生株相比，本发明提供了一种生长速度提高10％，EPA含量提高约10％，性能较稳定、环境适应性好，抗病虫害能力高，并已推广至室外验证的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2。

Description

拟微绿球藻突变株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)及其应用。
背景技术
化石能源的大量使用，极大地加剧了大气环境污染和气候变化以及酸雨区面积的增大，寻找新的可持续的环境安全的生物资源来生产生物燃料以替代化石燃料势在必行。生物柴油(Biodiesel)又是用未加工过的或者使用过的植物油以及动物脂肪通过不同的化学反应制备出来的一种被认为是环保的生物燃料。这种生物燃料可以像柴油一样使用。生物柴油是已得到证明的燃料，其在能源性质方面可以部分替代化石柴油，是最具发展潜力的液体生物燃料之一。
微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是有阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出O2。微藻是光合效率最高的微生物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等生物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可利用工业废气中的CO2。因此，微藻生物柴油成为了潜在的能源研究热点。
拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)细胞个体较小，生长速度快，可进行超高密度培养。在诱导的条件下，拟微绿球藻细胞中会大量积累三脂酰甘油(TAG)，它是生物柴油生产的最好原料。其营养价值丰富，含有较高不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，特别是二十碳五烯酸(EPA)和独特的堇菜黄素，EPA含量占细胞含量的4％左右，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择。此外，拟微绿球藻被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料。同时，拟微绿球藻可用作商业应用的色素、二十碳五烯酸(EPA)和维生素E的生产藻株。
专利申请CN102492626公开了一种拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)藻株ENN1003A，该藻株具有生长速度快、培养密度高、油脂含量高、富含EPA等长链不饱和脂肪酸和蛋白质的优势，适合生物柴油的生产和保健品、医药品、食品的开发，但是，该藻株的性能还有改进的余地。
发明内容
为了改善拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)野生株ENN1003A的性能，本发明以该野生株为研究对象，经过EMS化学诱变，光合作用抑制剂DCMU作为筛选压力，最终筛选得到性能改善的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2，该突变株已于2012年4月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6009。
本发明还提供了拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2的以下用途：在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用；在生产或制备食品方面的应用；在生产饵料或动物饲料方面的应用；在生产生物燃料尤其是生物柴油中的应用；在处理含氮磷污水方面的应用；在二氧化碳减排方面的应用；在生产不饱和脂肪酸尤其是EPA方面的应用。
本发明提供的突变株ENN11-2的油脂含量为48.0％，其中约79.0％为C16-C18脂肪酸，69.0％为C16脂肪酸，10.0％为C18脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的40.1％，具有油脂含量高的特性，特别适合生物柴油的生产。
本发明提供的突变株ENN11-2与野生株相比，EPA含量提高约10％，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择，因此本发明提供的突变株可以用于开发用于预防和治疗心脑血管疾病的药物、保健品和食品。
本发明提供的突变株ENN11-2中的蛋白质含量为10～30％，脂肪含量为10～60％，其中不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的35％-60％，是做营养品、饲料、饵料的最佳原料来源。
本发明提供的突变株ENN11-2养殖状况良好，使用化工厂废气养殖共35天，没有出现原生动物污染等情况，性能稳定、环境适应性好，抗病虫害能力较野生株有所提高。在31天(4-35天)连续培养中，产量平均可达11.3g/m2/d。
本发明提供的突变株ENN11-2在培养时培养基中没有添加C源，藻体生长固定的CO2来自培养过程中通入来源于化工厂的一定比例的CO2的情况下，以每吨藻约可固定2吨CO2计，本实施例中突变株ENN 11-2可实现CO2减排22.6g/m2/d。
本发明提供的突变株ENN11-2对工厂废水中的氮的去除率达到96.8％，对磷的去除率达到100％。
综上，与野生株相比，本发明提供了一种生长速度提高10％，EPA含量提高约10％，性能较稳定、环境适应性好，抗病虫害能力高，并已推广至室外验证的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2。
附图说明
图1示出室内柱式反应器评价干重变化曲线。
图2示出室内柱式反应器评价脂肪酸含量(占藻粉)变化曲线。
图3示出室内板式反应器评价干重变化曲线。
图4示出室内板式反应器评价脂肪酸含量(占藻粉)变化曲线。
图5示出室内板式反应器半连续养殖OD750变化曲线。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1突变株ENN11-2的诱变筛选、室内培养及油脂积累
取对数期的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)野生株ENN1003A的新鲜无菌藻液进行EMS诱变处理，诱变处理的初始浓度为6.3×106/ml，加入1％(以体积计)的EMS于藻液中，置于37℃避光震荡孵育60min。以10％(以质量计)的无菌NaS2O3溶液终止，用海水培养基洗涤3次，暗培养33h后，取出光照培养至致死率稳定，将藻液以300/板铺平板于DCMU浓度为1.5uM的f/2固体平板上，挑取个体较大的单藻落共30株进入三角瓶筛选，选择生长速度快的ENN11-2进行评价。
将处在对数生长期的ENN11-2绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD750为0.2-0.8之间(见图1)。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％(以体积计)的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间，温度调控在15-35℃范围内。培养所使用的反应器为内径40mm、长度600mm的柱式反应器。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图1。如图1所示，培养过程中，突变株ENN11-2的生物量一直略高于野生株ENN11，培养12天突变株ENN11-2的生物量高出野生株ENN11的10.5％。
培养进行到第12天，藻液颜色变黄时，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在真空进行冷冻干燥。
表1海水培养基
Figure BDA00002294558600041
干燥完成后，测定其油脂组分含量如下表2，分析方法如下：
1)脂肪酸提取：
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml 10％(以体积计)DMSO-Methanol溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚、正己烷4-8ml 4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)体积比例为1∶1∶1∶1，振荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。
2)脂肪酸分析：
照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱仪进行气相色谱分析(色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，分流比：4∶1。分析方法：内标法(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)。
表2气相色谱测定的ENN11-2第12天收集样品的总脂组分
Figure BDA00002294558600051
Figure BDA00002294558600061
脂肪酸组分分析显示，其油脂含量高达48.0％(质量百分比)，其中约79.0％为C16-C18脂肪酸，69.0％为C16脂肪酸，10.0％为C18脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的40.1％，可以作为生物柴油的生产原料。由此可见，本发明的突变株ENN11-2可用于生物燃料生产。
突变株ENN11-2的不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的40.1％，长链不饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的18.3％，其中EPA含量占脂肪酸总量的4.3％，不饱和脂肪酸含量丰富，可用于长链不饱和脂肪酸的生产。
如图2所示，突变株ENN11-2的脂肪酸含量和EPA含量相比野生株ENN11都有一定程度的提高，虽然在油脂积累的最高点12天时突变株ENN11-2相比野生株ENN11只是略高出1.2％，但在较早时期ENN11-2的油脂含量高出野生株21.1％(第3天)，说明ENN11-2的油脂积累的速度早于野生株ENN11。
实施例2突变株ENN11-2的室外培养及油脂积累
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖，置于室外自然条件进行生长培养，培养期间自然条件如下：培养周期为11天，9:00-17:00的温度变化范围主要在25-37℃之间，偶有最高温度达到40℃。9:00-17:00的光照变化范围阳面主要在200-700umol/m2/s之间，偶有光照强度达到800umol/m2/s。白天通入一定比例的CO2(纯度95％以上)，控制pH值在7-9之间。培养过程中间断取样测定干重(结果见图3)。培养结束后将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥，取适量藻粉进行气相色谱分析，方法同实施例1，脂肪酸在藻粉中含量见图4。
由图3可以看出，培养过程中突变株ENN11-2的生物量一直在野生株ENN11之上，培养11天最终突变株ENN11-2的生物量高出野生株10.1％。如图4所示，突变株ENN11-2的脂肪酸含量和EPA含量相比野生株都有一定程度的提高，培养8天突变株ENN11-2的EPA含量达到4.07％，相比野生株提高13.70％，且最终脂肪酸含量达到20.86％，相比野生株提高30.67％。
本实施例中没有实施措施诱导脂肪酸的积累，如采取相应措施，脂肪酸含量会达到更高的水平。
实施例3突变株ENN11-2高含CO 2 的废气养殖
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*13cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖(不添加C源)，置于室外自然条件进行生长培养，培养期间自然条件如下：实验过程中，温度达39℃及以上的只有7天。其余时间多在30℃左右，到后期温度下降到20-30℃。实验过程中，8小时双面可见光光照量达8000μmol/m2/s(6.25MJ/m2)及以上有14天，7000-8000μmol/m2/s有4天；6600μmol/m2/s以下有10天，下雨天3天。天气情况一般，光照较好的天数占实验天数58％。白天通入一定比例的CO2(化工厂废气，纯度95％以上)，控制pH值在6.9-8.1之间。培养过程中间断取样测定OD750(结果见图5)。
本实施例中突变株ENN11-2养殖状况良好，使用化工厂废气养殖共35天，没有出现原生动物污染等情况。在31天(4-35天)连续培养中，产量平均可达11.3g/m2/d。本实施例中微藻培养时培养基中没有添加C源，藻体生长固定的CO2来自培养过程中通入的一定比例的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95％以上)，以每吨藻约可固定2吨CO2计，本实施例中突变株ENN11-2可实现CO2减排22.6g/m2/d。
实施例4突变株ENN11-2治理含氮磷的废水
利用工厂废水养殖微藻突变株ENN11-2，处理6d后，N的浓度由0.25g/L变为0.008g/L，去除率为96.8％；P的浓度由0.013g/L变为0g/L，去除率为100％。证明突变株ENN11-2可以用于含氮磷的废水处理。
实施例5突变株ENN11-2用于营养品、饲料、饵料的生产
本发明提供的突变株ENN11-2中的蛋白质含量为10～30％(质量百分比)，脂肪含量为10～60％，其中不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的35％-60％，是做营养品、饲料、饵料的最佳原料来源。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种保藏号为CGMCC NO.6009的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2。
2.权利要求1所述拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用。
3.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在生产或制备食品方面的应用。
4.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在生产饵料或动物饲料方面的应用。
5.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在生产生物燃料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述生物燃料为生物柴油。
7.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在处理含氮磷污水方面的应用。
8.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在二氧化碳减排方面的应用。
9.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)突变株ENN11-2在生产不饱和脂肪酸方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述不饱和脂肪酸为EPA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102492626A (zh) * 2011-12-16 2012-06-13 新奥科技发展有限公司 拟微绿球藻及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RATNESH CHATURVEDI ET AL.: "Isolation of enhanced eicosapentaenoic acid producing mutants of Nannochloropsis oculata ST-6 using ethyl methane sulfonate induced mutagenesis techniques and their characterization at mRNA transcript level", 《PHYCOLOGICAL RESEARCH》, vol. 54, no. 3, 31 December 2006 (2006-12-31) *
李涛 等: "富油能源微藻的筛选及产油性能评价", 《中国生物工程杂志》, vol. 31, no. 4, 31 December 2011 (2011-12-31) *

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