TW201903141A - 綠球藻 (chlorella lewinii)藻株及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種新穎的經分離綠球藻 (Chlorella lewinii )藻株及其在食用油脂與生質燃料合成及二氧化碳固定之應用。

Description

綠球藻 (CHLORELLA LEWINII)藻株及其用途

本發明係關於新穎綠球藻 (Chlorella lewinii )之分離藻株，該分離藻株可產生高量適合用作食用油及生質柴油的三酸甘油酯及脂肪酸，且具有高效的固碳作用，故該分離株可做為生產健康油脂及生質柴油的原料，亦可應用於二氧化碳的減量。

微藻這類細小的生物通常生活在淡水和海洋生態系統，生長形式包括單獨生長、鏈狀或是團狀生長(Thurman HV, Burton EA. Introductory oceanography: Prentice Hall New Jersey; 1997)。微藻生物多樣性複雜，估計微藻大約有20-80 萬種，其中已發現並記錄的僅有5 萬種(Borowitzka MA. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. Journal of biotechnology 1999;70:313)，微藻幾乎是為一個幾乎未積極開發的資源。 脂質為微藻之次級代謝產物，具保持細胞膜通透性及因應環境變化作為細胞信號傳導途徑之功能。微藻生產之油脂量與組成會隨周遭環境產生變化(Borowitzka MA. (1999) 及Thompson PA, Harrison PJ, Whyte JN. Influence of irradiance on the fatty acid composition of phytoplanktonl. Journal of Phycology 1990;26:278。因此隨著培養環境的條件包括光強度、生長階段、光週期、溫度、鹽度、CO₂ 濃度、氮和磷濃度等，油脂之含量、組成和各種脂肪酸比例亦會隨之改變(Dunstan G, Volkman J, Barrett S, Garland C. Changes in the lipid composition and maximisation of the polyunsaturated fatty acid content of three microalgae grown in mass culture. Journal of Applied Phycology 1993;5:71 及Wu H, Volponi JV, Oliver AE, Parikh AN, Simmons BA, Singh S. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences 2011;108:3809)。微藻富含三酸甘油脂、雙酸甘油脂、磷脂和醣脂、碳氫化合物和其他脂類，含油總量可佔乾重的1至90％，取決於藻種和培養條件(Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering 2006;101:87 及Chisti Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances 2007;25:294 )。 微藻作為一個可持續發展的綠色能源之一，相較於其他油脂植物像是棕梠、油菜、大豆及甘蔗作為生物燃料生產者時，其操作性更高，在短時間內生產生物柴油、生物乙醇、生物氫及生物質的產量更大。又微藻可使用非耕地、苦鹹水及民生廢水等進行生產，減少使用農耕土地與淡水資源，進而減少與糧食和經濟作物的競爭。因此各國已投入微藻及其衍生物包括生物燃料、化學品及高價商品的商業化。 微藻可用來生成一系列的可再生燃料，包括生質柴油(Tran D-T, Chen C-L, Chang J-S. Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oil-bearing microalgal biomass ofChlorella vulgaris ESP-31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst. Bioresource Technology 2013;135:213；Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E, Ghirardi M, Posewitz M, Seibert M,et al . Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal 2008;54:621 及Cheng H-H, Whang L-M, Chan K-C, Chung M-C, Wu S-H, Liu C-P,et al . Biological butanol production from microalgae-based biodiesel residues byClostridium acetobutylicum . Bioresource Technology 2015;184:379 )、生物乙醇(Ho S-H, Li P-J, Liu C-C, Chang J-S. Bioprocess development on microalgae-based CO₂ fixation and bioethanol production usingScenedesmus obliquus CNW-N. Bioresource Technology 2013;145:142；Ho S-H, Huang S-W, Chen C-Y, Hasunuma T, Kondo A, Chang J-S. Bioethanol production using carbohydrate-rich microalgae biomass as feedstock. Bioresource Technology 2013;135:191 及Harun R, Danquah MK. Influence of acid pre-treatment on microalgal biomass for bioethanol production. Process Biochemistry 2011;46:304)、生物氫(Sambusiti C, Bellucci M, Zabaniotou A, Beneduce L, Monlau F. Algae as promising feedstocks for fermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach: A comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2015;44:20；Oncel S, Kose A, Faraloni C, Imamoglu E, Elibol M, Torzillo G,et al . Biohydrogen production from model microalgaeChlamydomonas reinhardtii : A simulation of environmental conditions for outdoor experiments. International Journal of Hydrogen Energy 2015;40:7502 及Batista AP, Ambrosano L, Graça S, Sousa C, Marques PA, Ribeiro B,et al . Combining urban wastewater treatment with biohydrogen production–An integrated microalgae-based approach. Bioresource Technology 2015;184:230)、甲烷(Caporgno M, Taleb A, Olkiewicz M, Font J, Pruvost J, Legrand J,et al . Microalgae cultivation in urban wastewater: Nutrient removal and biomass production for biodiesel and methane. Algal Research 2015;10:232；Ajeej A, Thanikal JV, Narayanan C, Kumar RS. An overview of bio augmentation of methane by anaerobic co-digestion of municipal sludge along with microalgae and waste paper. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2015;50:270 及Kim J, Kang C-M. Increased anaerobic production of methane by co-digestion of sludge with microalgal biomass and food waste leachate. Bioresource Technology 2015;189:409)及合成氣(Raheem A, WAKG WA, Yap YT, Danquah MK, Harun R. Optimization of the microalgae Chlorella vulgaris for syngas production using central composite design. RSC Advances 2015;5:71805；Raheem A, Sivasangar S, Azlina WW, Yap YT, Danquah MK, Harun R. Thermogravimetric study ofChlorella vulgaris for syngas production. Algal Research 2015;12:52 及Hu Z, Ma X, Li L. The synergistic effect of co-pyrolysis of oil shale and microalgae to produce syngas. Journal of the Energy Institute 2015 )。然而，在微藻生物燃料的商業化之技術和經濟量產較為困難，需突破之處包括能耐受室外培養、光合效率更好及生長更快之藻種，以及在大規模生產時採收、萃取等油品製造之成本。 預計到2050 年時，世界人口將達到90 億，這將導致全球糧食之供應面臨挑戰(Foley JA, Ramankutty N, Brauman KA, Cassidy ES, Gerber JS, Johnston M,et al . Solutions for a cultivated planet. Nature 2011;478:337 及Tilman D, Balzer C, Hill J, Befort BL. Global food demand and the sustainable intensification of agriculture. Proceedings of the National Academy of Sciences 2011;108:20260)[23, 24]。近年來微藻已成為可持續生產糧食及飼料、燃料和化學品的明星選項。相較於傳統糧食作物，微藻產量是高等植物的6-7倍，是可靠的蛋白質、碳水化合物和脂質來源(Becker E. Micro-algae as a source of protein. Biotechnology advances 2007;25:207)。許多藻種生產脂質是以蓄積三酸甘油酯(triacylglycerol，TAG)形式為主，具有類似於植物油之脂肪酸組成(Draaisma RB, Wijffels RH, Slegers PE, Brentner LB, Roy A, Barbosa MJ. Food commodities from microalgae. Current Opinion in Biotechnology 2013;24:169 及Gunstone F. Vegetable oils in food technology: composition, properties and uses: John Wiley & Sons; 2011)，此外還能生產一些高價脂肪酸例如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)( Guschina IA, Harwood JL. Algal lipids and effect of the environment on their biochemistry. Lipids in aquatic ecosystems: Springer; 2009, p.1 及Mühlroth A, Li K, Røkke G, Winge P, Olsen Y, Hohmann-Marriott MF,et al . Pathways of lipid metabolism in marine algae, co-expression network, bottlenecks and candidate genes for enhanced production of EPA and DHA in species ofChromista . Marine drugs 2013;11:4662 )。又人體必需脂肪酸包括n6系列之亞麻油酸(C18:2)與n3系列之次亞麻油酸(C18:3)，通常藉由飲食攝取，部分微藻能生產這些碳鏈油脂(Lang I, Hodac L, Friedl T, Feussner I. Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae: a comprehensive analysis of more than 2000 strains from the SAG culture collection. BMC plant biology 2011;11:124)。美國Solazyme 於2013 年通過美國FDA 對於其藻油產品GRAS 之認證(FDA U. RE: High LipidChlorella protothecoides S106 Flour GRAS 2013)，說明藻油能夠運用在日常烹調與烘焙。 人類文明發展活動例如燃燒化石燃料、毀林和能源生產，進而造成了強烈的溫室氣體排放。二氧化碳其在大氣中的濃度，這是自工業革命以前到2013年，已從280升至390 ppm (Rahaman MSA, Cheng L-H, Xu X-H, Zhang L, Chen H-L. A review of carbon dioxide capture and utilization by membrane integrated microalgal cultivation processes. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2011;15:4002及Singh UB, Ahluwalia A. Microalgae: a promising tool for carbon sequestration. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change 2013;18:73)。二氧化碳能在大氣中存在50-200 年，造成全球變暖有52％是歸咎於二氧化碳(Wilbanks TJ, Fernandez S, Backus G, Garcia P, Jonietz KK. Climate Change and Infrastructure, Urban Systems, and Vulnerabilities: Technical Report for the US Department of Energy in Support of the National Climate Assessment: Island Press; 2014)。微藻固定二氧化碳的效率是陸生植物的10-50倍(Cheng J, Huang Y, Feng J, Sun J, Zhou J, Cen K. Improving CO2 fixation efficiency by optimizingChlorella PY-ZU1 culture conditions in sequential bioreactors. Bioresource technology 2013;144:321及Lam MK, Lee KT, Mohamed AR. Current status and challenges on microalgae-based carbon capture. International Journal of Greenhouse Gas Control 2012;10:456)。陸生植物預計只能削減約3-6％全球二氧化碳排放量(Ho S-H, Chen C-Y, Lee D-J, Chang J-S. Perspectives on microalgal CO2-eission mitigation systems—a review. Biotechnology advances 2011;29:189及Kao C-Y, Chen T-Y, Chang Y-B, Chiu T-W, Lin H-Y, Chen C-D,et al . Utilization of carbon dioxide in industrial flue gases for the cultivation of microalgaChlorella sp. Bioresource Technology 2014;166:485)。微藻每生產1 公斤微藻生物質約可固定1.83 公斤的二氧化碳(Jiang Y, Zhang W, Wang J, Chen Y, Shen S, Liu T. Utilization of simulated flue gas for cultivation ofScenedesmus dimorphus . Bioresource Technology 2013;128:359)。因此微藻已被公認為生產生物燃料最有前途的替代方案。由於微藻光合效率在生物轉化二氧化碳時表現出高生產效率、高量的脂質蓄積，又能降低大氣二氧化碳濃度，可生產有價值的原料，亦可生產可再生能源及有價值的非燃料副產品(Xie Y-P, Ho S-H, Chen C-Y, Chen C-NN, Liu C-C, Ng I-S,et al . Simultaneous enhancement of CO₂ fixation and lutein production with thermo-tolerantDesmodesmus sp. F51 using a repeated fed-batch cultivation strategy. Biochemical Engineering Journal 2014;86:33)。微藻光合過程中除了可使用大氣中的二氧化碳，對於電廠煙道氣中之二氧化碳亦可進行捕捉利用，從而減少排碳量(Doucha J, Straka F, Lívanský K. Utilization of flue gas for cultivation of microalgaeChlorella sp.) in an outdoor open thin-layer photobioreactor. Journal of Applied Phycology 2005;17:403及Maeda K, Owada M, Kimura N, Omata K, Karube I. CO₂ fixation from the flue gas on coal-fired thermal power plant by microalgae. Energy Conversion and Management 1995;36:717)。 以富含胺基酸、有機酸的食品工業廢水而言，結合微藻養殖的廢水處理系統似乎是一個不錯的選擇(Mata TM, Martins AA, Caetano NS. Microalgae for biodiesel production and other applications: a review. Renewable and sustainable energy reviews 2010;14:217)。利用藻類廢水處理具有很多優點，包括廢水中豐富的營養物質，例如氮和磷等，以及適量的重金屬離子，提供藻類生長所需，達到去除化學、有機污染物及部分重金屬的效益。另外可回收藻體之生物質作為肥料，可以抵消部分運轉費用(Munoz R, Guieysse B. Algal–bacterial processes for the treatment of hazardous contaminants: a review. Water research 2006;40:2799)。可應用在廢水養殖之微藻例如Chlorococcum sp. RAP13以異營的方式處理乳製品廠污水，其所生成之油脂含量可達到42% (Ummalyma SB, Sukumaran RK. Cultivation of microalgae in dairy effluent for oil production and removal of organic pollution load. Bioresource technology 2014;165:295)。Scenedesmus sp.處理富含果糖、葡萄糖和乙酸之廢水，其所生成之油脂含量更可達到52.6% (Ummalyma SB, Sukumaran RK. Cultivation of microalgae in dairy effluent for oil production and removal of organic pollution load. Bioresource technology 2014;165:295)。Chlorella pyrenoidosa FACHB-9處理大豆加工廢水，其所生成之油脂含量達到37% (Hongyang S, Yalei Z, Chunmin Z, Xuefei Z, Jinpeng L. Cultivation ofChlorella pyrenoidosa in soybean processing wastewater. Bioresource Technology 2011;102:9884)。 根據AlgaeBase資料庫(http://www.algaebase.org/)記載，Chlorella lewinii 之模式生物(type species)為CCAP 221/90，對此藻種目前尚未有太多研究，僅於分類學研究(Bock C, Krienitz L, Proeschold T. Taxonomic reassessment of the genusChlorella (Trebouxiophyceae) using molecular signatures (barcodes), including description of seven new species. Fottea 2011;11:293.)及產氫研究(Pongpadung P, Liu J, Yokthongwattana K, Techapinyawat S, Juntawong N. Screening for hydrogen-producing strains of green microalgae in phosphorus or sulphur deprived medium under nitrogen limitation. ScienceAsia 2015;41:97)中，作為比對之用。關於油脂生產、固碳效率及異營生長特性等，目前尚未有學術文獻或專利發表。 無論是經濟發展或民生所需，對於乾淨的空氣與水源的需求日益重要。為減緩溫室效益與對環境的破壞，對於CO₂ 及工業所產生的廢水，兩者的排放標準越來越嚴格，儼然成為各國政府與企業巨大的挑戰。因此，新的概念或工程系統日趨重要，例如混合廢水與廢棄的微藻處理系統可以是一個有效的污染物去除的方法，廢水中含有可生物降解的有機物，在處理廢水的同時又可生產能源，此混合系統之發展已成為一種趨勢。期待未來能夠發展出適合的技術來因應環保與能源問題。

本發明係於台灣桃園有機稻田區採集到含微藻的土壤與水樣樣品後，以C培養基進行微藻的培養與分離，選取出具高油脂含量之C40藻株，經鑑定該藻株屬於綠球藻(Chlorella lewinii )之微藻。經藻油脂含量、組成及生長條件等分析，發現C40藻株不僅可生產高量的油脂，且C40藻株可在極廣的溫度、鹽度與pH範圍下，行自營性、異營性或混營性生長，故C40藻株具有作為生質燃料及食用油之原料的潛力，亦可運用於二氧化碳減量及廢水處理之應用。 因此，本發明之一目的係提供一種經分離之綠球藻株，該綠球藻分離株包含SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的18S rDNA序列及SEQ ID NO: 2所示之核苷酸序列的ITS區域序列。 本發明之另一目的係提供一種培養該經分離之綠球藻株以獲得綠球藻培養產物的方法。 本發明之另一目的係提供一種由上述方法所獲得的綠球藻培養產物，其中該微芒藻屬培養產物可作為生產生質燃料及食用油的料源。 本發明之另一目的係提供一種由上述綠球藻培養產物中獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法。 本發明之另一目的係提供一種由上述綠球藻培養產物來製備生質燃料之方法。 本發明在以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點可易見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。

本發明可藉由下述實施方式中所揭示之各種發明態樣、實施例及表列之相關敘述所瞭解。除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用之術語(包含技術及科學術語)應具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解之含義。且當可瞭解，除非本文中提供之定義另作說明，在任何潛在歧義之情況，術語之定義應與該等普遍使用之術語(如詞典中所定義)一致。可進一步瞭解者，本案所使用的術語僅係用作描述特定實施態樣之目的，而非用於限定。 必須注意的是，除非有清楚的相反指示，於說明書或申請專利範圍使用之單數格式「一」、「一種」及「該」亦包含複數表示。因此，除非上下文另有需要，單數術語應包含複數，而複數術語亦包含單數。 本發明的範圍以「自一『約』特定數值及/或至另一『約』特定數值」表示。當範圍藉上述方式表示時，其包含自一特定數值及/或至另一特定數值之範圍。同樣地，當數值可藉由術語「約」以表示近似值，將可了解其為一特定值的另一個態樣。可進一步了解，當提及有關其它端點及其他端點本身而言，每一範圍的兩端點皆為有意義的。根據本發明，「約」可表示±20%，較佳為±10%，更佳為±5%。 於本發明中，術語「經分離」或「分離」意謂使物質自其原始環境(若天然存在則為天然環境)中移出。術語"經分離"或"分離"並不一定指物質係經純化者。 本發明之一目的係提供一種綠球藻 (Chlorella lewinii )分離藻株，其中該綠球藻分離藻株包含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的18S rDNA序列及SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的ITS區域序列。於本發明較佳實施態樣中，該綠球藻分離藻株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980043之藻株，或為與寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980043之藻株具有實質上完全相同識別特徵之變異株。 上述術語「變異株」意謂涵蓋全體細胞遺傳組成已藉由如化學突變誘發、自發突變、遺傳工程、轉化或轉染而改變，以致影響其物理或生物化學特性之任何綠球藻株。然而，該變異株應具有寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980043之綠球藻分離藻株的所有分類學識別特徵。 本發明之一目的係在於提供一種製備綠球藻培養產物之方法。於本發明之實施態樣中，該方法包含將本發明之綠球藻分離藻株接種於培養基中，及進行培養以獲得該培養產物。 於本發明中，術語「培養產物」意謂將微藻置於培養基中培養後，所獲得富含該微藻細胞的產物。於本發明中，該培養產物中之微藻細胞可不必與培養基分離，且該培養產物可呈液態、固態或黏稠狀。 於本發明中，用於培養綠球藻分離藻株之「培養基」可為任何容許綠球藻生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸之培養基，例如C培養基[每100 mL中包含15 mg Ca(NO₃ )₂ •4H₂ O、10 mg KNO₃ 、5 mg β-甘油磷酸二鈉•5H₂ O、4 mg MgSO₄ •7H₂ O、0.01 μg 維生素B12、0.01 μg 生物素 (Biotin)、1 μg 噻胺(Thiamine) HCl、0.3 mL PIV微量元素溶液(每100 mL中包含100 mg Na₂ EDTA•2H₂ O、19.6 mg FeCl₃ •6H₂ O、3.6 mg MnCl₂ •4H₂ O、1.04 mg ZnCl₂ 、0.4 μg CoCl₂ •6H₂ O、0.25 μg Na₂ MoO₄ •2H₂ O及水)、50 mg Tris (hydroxymethyl) aminomethane及水]、胰蛋白酶大豆培養液(Tryptic Soy Broth；TSA)、馬鈴薯葡萄糖培養液(Potato Dextrose Broth；PDA)及營養培養液(Nutrient Broth；NA)。若要製備洋菜固體培養基，可於液態培養基中加入1.5% (w/v) 的洋菜膠，經滅菌冷卻後即可獲得洋菜固體培養基。本技術領域之人士可根據既有知識針對培養基的成分作調整。於本發明之一較佳實施態樣中，該培養基為液態培養基。 本發明中用於培養綠球藻分離藻株之條件意指如培養基之pH值、鹽度、培養溫度、照光、通氣條件及培養時間等條件，其可容許該綠球藻分離藻株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技術領域之人士可根據既有知識針對培養條件作調整。 於本發明之實施態樣中，綠球藻分離藻株可在不照光下(即24小時黑暗)下進行異營性生長、12小時光照12小時黑暗之光週期下進行混營性生長或持續光照下進行自營性生長。照光量可為約100 lux至約4,000 lux，較佳為約2,000 lux之亮度 於本發明之實施態樣中，綠球藻分離藻株之培養溫度可為約10℃至約60℃ (例如約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃或約60℃)，較佳為約20℃至約40℃，更佳為約30℃。 於本發明之實施態樣中，用於培養綠球藻分離藻株之培養基的pH值可為約pH1至約pH14 (例如約pH1、約pH1.5、約pH2、約pH2.5、約pH3、約pH3.5、約pH4、約pH4.5、約pH5、約pH5.5、約pH6、約pH6.5、約pH7、約pH7.5、約pH8、約pH8.5、約pH9、約pH9.5、約pH10、約pH10.5、約pH11、約pH11.5、約pH12、約pH12.5、約pH13、約pH13.5或約pH14)，較佳為約pH4至約pH10，更佳為約pH5至約pH7。 於本發明之實施態樣中，可視需要調整培養綠球藻分離藻株之培養基的鹽度。本文中所謂「鹽度」意旨溶解於培養基中之鹽類含量。本發明中培養基之鹽度可為0% (w/w)至約6% (w/w) (例如0% (w/w)、約0.5% (w/w)、約1% (w/w)、約1.5% (w/w)、約2% (w/w)、約2.5% (w/w)、約3% (w/w)、約3.5% (w/w)、約4% (w/w)、約4.5% (w/w)、約5% (w/w)、約5.5% (w/w)或約6.0% (w/w))，較佳為0% (w/w)至約3% (w/w)，更佳為1.5% (w/w)。 本發明製備綠球藻分離藻株培養產物之方法中，可視需要包含分離該培養產物的步驟，而該分離步驟可為如離心及/或過濾等習知的方法步驟。 本發明亦提供由上述方法所獲得之培養產物。本發明之培養產物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，故可用作獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸的原料，進而分別用於製作健康油脂及/或生質燃料。 本文中之「三酸甘油酯」意旨具有1個甘油分子及3個脂肪酸分子之酯類化合物，其中該3個脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相異之碳數及不飽和鍵。 本文中之「脂肪酸」意旨具有8至30個碳原子及0至6個不飽和鍵的羧酸化合物，其較佳為具有12至20個碳原子及0至5個不飽和鍵的羧酸化合物，更佳為具有16至18個碳原子及0至3個不飽和鍵的羧酸化合物。 三酸甘油酯及脂肪酸之獲得可使用本技術領域所熟知的任何萃取及分離方法，例如Folch等人(Folch, J.et al ., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. The Journal of Biological Chemistry 1957; 23:497-509)、Balasubramanian等人(Balasubramanian S.et al. , Oil extraction fromScenedesmus obliquus using a continuous microwave system – design, optimization, and quality characterization., Bioresource Technology, 2011; 102:3396-3403)及Sajilata等人(Sajilata M. G.et al. , Supercritical CO₂ extraction of γ-linolenic acid (GLA) fromSpirulina platensis ARM 740 using response surface methodology. Journal of Food Engineering 2008; 84: 321–326)所述的方法。簡而言之，該方法可包含將綠球藻細胞以如研磨法或超音波法等方式擊碎，藉由適當的溶劑萃取綠球藻細胞中之三酸甘油酯及/或脂肪酸，再藉由如HPLC及/或離子交換樹脂的技術獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸。 本發明之綠球藻培養產物可經化學轉化(如氫化、轉酯化、水熱碳化(hydrothermal carbonisation)、發酵或裂解等)或萃取而成固態、液態或氣態之生質燃料，其包括(但不限於)生質柴油、生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇、生物甲烷、生物氫或生質煤炭。 上述生質燃料之獲得可使用本技術領域所熟知的任何方法，諸如Tran D. T.等人(Tran D. T.et al. , Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oil-bearing microalgal biomass ofChlorella vulgaris ESP-31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst. Bioresource Technology 2013; 135:213-221)、Cheng H. H.等人(Cheng H. H.,et al ., Biological butanol production from microalgae-based biodiesel residues byClostridium acetobutylicum . Bioresource Technology 2015; 184:379-385)、Sambusiti C.等人(Sambusiti C.,et al. , Algae as promising feedstocks for fermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach: A comprehensive review. Renewable & Sustainable Energy Reviews2015; 44:20-36)及Heilmann S. M.等人(Heilmann S. M.et al. , Hydrothermal carbonization of microalgae. Biomass & Bioenergy 2010; 34(6):875–882及Heilmann S.M.et al. , Hydrothermal carbonization of microalgae II. Fatty acid, char, and algal nutrient products. Applied Energy 2011; 88(10):3286–3290)所述之方法。 本文所述之所有公開案、專利及專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。 提供以下實例以輔助熟習此項技術者實施本發明。即使如此，不應將該等實例視為本發明之限制，因為本發明所屬技術領域中具有通常知識者在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行的修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。實施例 材料與方法 1. 培養基配方 1.1 C培養基 將Ca(NO₃ )₂ •4H₂ O 15 mg、KNO₃ 10 mg、β-甘油磷酸二鈉•5H₂ O 5 mg、MgSO₄ •7H₂ O 4 mg、維生素B12 0.01 μg、生物素 (Biotin) 0.01 μg、噻胺(Thiamine) HCl 1 μg、PIV微量金屬溶液0.3 mL與Tris 50 mg混合後將其體積補水至100 mL，調整pH至7.5後進行高壓滅菌。若為1.5% (w/v)洋菜固體培養基則需加入15 g的洋菜膠一同滅菌。 PIV微量金屬溶液的配製為依序加入Na₂ EDTA•2H₂ O 100 mg、FeCl₃ •6H₂ O 19.6 mg、MnCl₂ •4H₂ O 3.6 mg、ZnCl₂ 1.04 mg、CoCl₂ • 6H₂ O 0.4 μg與Na₂ MoO₄ •2H₂ O 0.25 μg，隨後將其體積補水至100 mL後進行高壓滅菌。 測試不同鹽度生長特性時，使用C培養基組成，另外加入NaCl調整鹽度，並使用鹽度計測量鹽度使達到所需的鹽度。測試不同pH 生長特性時，使用C 培養基組成，另外加入HCl 或NaOH 調整pH 值，並使用酸鹼量測計測量使達到所需的pH值。 1.2 TSB 培養基(胰蛋白酶大豆培養液(Tryptic Soy Broth)) 依序加入15.0 g的胰水解蛋白(Tryptone)、5.0 g的大豆水解蛋白(Soytone)及5.0 g的NaCl水中，隨後將其體積補水至1 L，調pH至7.3後進行高壓滅菌。 1.3 PDB培養基(馬鈴薯葡萄糖培養液；Potato Dextrose Broth) 依序加入200.0 g的切丁馬鈴薯及20.0 g的葡萄糖，隨後將其體積補水至1 L，調pH至7.3後進行高壓滅菌。 1.4 NB 培養基(營養培養液；Nutrient Broth) 依序加入3.0 g的牛肉萃取物及5.0 g的蛋白腖(Peptone)，隨後將其體積補水至1 L，調pH至7.0後進行高壓滅菌。 2. 藻樣採集、分離及培養 取台灣桃園的有機稻田之水樣與土樣均勻混合後取出約10 mL置於50 mL的離心管中，加入約30 mL的C培養基，於25℃照光培養。培養期間以顯微鏡觀察是否有藻體生長，之後取出適量含藻體的培養液，將其轉至平板培養基，於25℃照光培養。待藻體生長後取單一藻種將其於平板培養基中塗開，以上步驟需重覆至篩選獲得單一藻體為止。平板培養則取單一藻落塗至C平板培養基，於25℃照光培養。 3. 油脂染色分析 將培養好的藻體取20 μL與1 μL Nile Red (於二甲基亞碸中0.1 mg/mL)混合以進行油滴染色，染色後於室溫靜置5分鐘，再利用螢光顯微鏡進行觀察(Chen, W.et al. , A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods 2009; 77:41-47及Huang, G. H.,et al ., Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass & Bioenergy 2009; 33:1386-1392)。 4. 藻種之分子鑑定 4.1 藻體基因體(genomic) DNA的抽取 自平板培養基上刮取適量之新鮮培養的藻體，將其收集在2 mL微量離心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™ kit說明書操作取得基因體DNA，並以NanoDrop (ND-1000分光光度計)檢測DNA濃度。 4.2 PCR增幅、定序及親源分析 將藻體基因體DNA作為PCR模板，以18S rRNA與ITS區域(包含18S核糖體RNA的後端、內轉錄間隔區(internal transcribed spacer) 1、5.8S 核糖體RNA、內轉錄間隔區2與28S核糖體RNA的前端等序列)的相關引子組(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)來擴增其基因片段。PCR反應溶液如下：適量的基因體DNA溶液作為PCR模板，於含10 mM dNTP 8 µL、10X PCR緩衝液10 µL、10 pmole的5¢端引子與3¢端引子與Taq DNA 聚合酶5U。PCR反應條件為96℃/30秒、50℃/30 秒、72℃/150 秒；補齊增殖段共1 循環72℃/10 分鐘；最後保持在4℃。取5 μL 產物進行電泳跑膠分析。 將PCR產物純化後以適當引子(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)進行定序，將定序結果以Vector NTI Suite 10軟體(VNTI)與NCBI/Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列重組與序列相似性比對分析。另，分別將定序所得的C40序列經NCBI/Blastn後所得相近的藻株與數個藻種中心較接近的藻株及藻屬列為比較範圍，進行演化樹分析，以MEGA 6.0軟體做比對，接著利用最大概似法(Maximum Likelihood)以GTR+G+I的方式繪製演化樹，Bootstrap則為100次，分析之結果可作為分類地位上之鑑別參考。 5. 藻體分析 5.1 藻體含油量分析 C40以800 mL C培養基，培養於1L血清瓶中，並通入無菌空氣，於30℃照光培養一個月。收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法參考Folch等人的方法(Folch, J.et al ., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. The Journal of Biological Chemistry 1957; 23:497-509)並經修飾來進行，其過程為將30 mg冷凍乾燥的藻粉(A值)置入2 mL微量離心管，加入約2.0 mL氯仿/甲醇(v:v=2:1)與適量大顆玻璃珠，以撞擊式細胞破碎儀(Retsch® MM400)振盪約5分鐘，重複兩次。以10,000 rpm離心5分鐘後，取出上清液並將其加入拋棄式15 mL離心管中，隨即於2 mL微量離心管內加入約2.0 mL氯仿/甲醇(v:v=2:1)，再以超音波振盪與離心處理，取出上清液並將其加入另一拋棄式15 mL離心管中，重複上述萃取離心步驟直到萃取液無色為止。於裝有萃取液的15 mL離心管中加入等體積的145 mM NaCl溶液後，以試管旋轉混合器混和均勻後，經離心管在4,500 rpm下離心10分鐘。以玻璃吸管取下層液體到已秤重的玻璃瓶(B值)中。將此玻璃瓶內液體隔夜風乾再秤重(C值)，計算藻乾含油量的百分比(D值)。藻乾含油量計算公式:5.2 脂肪酸圖譜分析 將抽取的藻油樣品以HPLC分析其油脂組成，HPLC分析條件：分離管柱為德國Merck公司製造之Silica gel (4.6 mm id × 250 mm, 5 μm particle size)；沖提溶劑A：hexane；沖提溶劑B：hexane/ethyl acetate/iso-propanol = 80：10：10 (v/v)，在0分鐘溶劑A/B =98：2 (v/v)，在8分鐘線性增加至溶劑A/B =50：50 (v/v)，在8.5分鐘線性增加至溶劑A/B =2：98 (v/v)，15分鐘維持相同梯度，20分鐘線性減少至溶劑A/B =98：2 (v/v)；流速：1.2 mL/min；蒸發光散射檢測器(ELSD；Evaporative Light Scattering Detector)條件；氣體流量2.6 L/min; 蒸發器溫度：40℃ (詹國靖, 黃啟紋, 范少怡, 朱燕華. 以甘油與植物油利用脂解酶之轉酯化反應生產 1, 3-雙醯甘油. 臺灣農業化學與食品科學 2010;48:19)。 5.3 脂肪酸圖譜分析方法 刮取適量乾燥藻體置於玻璃試管中，加入1 mL solution 1 (NaOH 45g, methanol 150 mL, ddH2O 150 mL)，震散藻體。於100℃加熱5分鐘，再將所有藻體震散，續加熱25分鐘。加入2 mL solution 2 (6N HCl 325 mL, methanol 200 mL)，於80℃加熱10 分鐘，完成後迅速冷卻。加入1.25 mL solution 3 (hexane 200 mL, tert-butyl methyl ether 200 mL)，緩慢混合10分鐘，以玻璃吸管尖吸取下層液體並丟棄。將上層液體加入3 mL solution 4 (NaOH 10.8 g, ddH₂ O 900 mL)，混合5分鐘後，吸取上層液體以GC/MS (HP 5973 GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法參考2007年Valencia, I.等人的方法(Valencia I, Ansorena D, Astiasarán I. Development of dry fermented sausages rich in docosahexaenoic acid with oil from the microalgaeSchizochytrium sp.: Influence on nutritional properties, sensorial quality and oxidation stability. Food Chemistry 2007;104:1087)，GC/Mass分析條件為：毛細管管柱：SP-2560, 75 m x 0.18 mm I.D., 0.14 μm。注入口温度：Inj, 250℃。離子源温度：FID, 250℃。管柱烘箱溫度：起始溫度140°C，保持5分鐘後以4℃/min 之昇温速率昇温至240℃，保持2分鐘。Carrier gas：He。Column流量：40 cm/sec@175℃。Injection: 1 μL。split ratio：1/100。脂肪酸標準品：37-Component FAME Mix (Cat. 18919-1AMP, Sigma-Aldrich)。設定好條件後，先分析標準品確認圖譜正確後再進行樣品分析。樣品層析數據利用質譜數據與標準品位置進行比對，以確認脂肪酸組成與比例。 6. 藻種培養特性分析 6.1 不同培養溫度測試 放入含20%二氧化碳之密封袋中，以不同溫度20℃、30℃與40℃進行照光培養，光照週期為12小時照光：12小時黑暗(12L:12D)。於培養第0小時、24小時及96小時觀察生長情形。 6.2 同鹽度培養基測試 以C培養基作為基礎，以此製作0％、1.5％及3％鹽度之培養基平板。藻種均勻塗佈於培養基平板上，放入含20%二氧化碳之密封袋中，以30℃進行照光培養，光照週期12L:12D。於培養第0小時、24小時及96小時觀察生長情形。 6.3 不同pH值培養基測試 以C培養液作為基礎，以此製作pH 3-10之培養基。因酸性固體培養基製作較困難，洋菜不易凝固，故使用液體方式進行培養。作法為添加酸液或鹼液並充分溶解後，以pH測定儀測量pH值，培養液以高溫高壓進行滅菌。將藻種均勻接種於各pH值之培養液中，做三重複。以30℃進行照光培養，於培養第0天、第4天及第19天觀察生長情形。 6.4 固碳效率測定 C40藻株於二氧化碳固碳篩選平台，以體積為1公升之C培養基(含氮量為原培養基之2倍：添加20 mg KNO₃ )，在30℃全日照光條件下進行監測。固碳篩選平台以通氣量為0.1 vvm持續通入5%二氧化碳至潛力藻株藻液，再利用二氧化碳自動監測系統持續監測進流及出流之二氧化碳濃度（濃度單位為%，1% = 10,000 ppm），經由氣體濃度轉換公式之計算將二氧化碳濃度單位轉換為毫克/立方米，計算每日固定二氧化碳毫克數(Ya-jun H. Brief Discussion on conversion coeficient between the concentration units ppm and mg/m3 of nitrogen oxides (NO_X ). Sichuan Environment 2010;1:006)： 二氧化碳氣體濃度轉換之計算公式：分子量(二氧化碳)：44.01 t：測定溫度(30℃) 固碳效率計算公式：R：每日固定毫克數(mg) V：微藻培養體積(m³ ) Q：氣體通氣量(vvm，volume per volume per minute) T：每日通氣時間(min) C_in ：二氧化碳進流濃度(mg/m³ ) C_out ：二氧化碳出流濃度(mg/m³ ) 6.5 有機培養基培養測試 測試之有機培養基包括TSA、PDA及NA共三種。C40藻體均勻塗佈於有機培養基平板上，各有機培養基塗佈兩片，一片置於30°C光照培養箱，光照條件12L：12D。另一片置於30°C黑暗培養箱，於培養第0小時、第24小時及第96小時觀察生長情形。實例一、藻株鑑定 於台灣桃園有機稻田土壤與水樣樣品，分離純化得到藻株C40。以1,000X 顯微鏡觀察，此藻以單一藻體存在，细胞為圓球狀，直徑約為5~10 μm，經Nile Red染色後，以螢光顯微鏡觀察到藻體內部有大量明顯且呈現黃色之油滴分佈，顯示其藻體內可以蓄積油滴(圖1A及B)。 18S序列分析：分析C40藻株之18S rDNA序列(SEQ ID NO: 1)和NCBI的nr 資料庫比對後，發現與小球藻 (Chlorella sorokiniana ) UTEX 2714 (LK021940.1)及綠球藻(Chlorella lewinii ) CCAP 211/90 (FM205861.1)，覆蓋率為100％，相似度99％。以親源分析結果得知，C40 與Chlorella lewinii CCAP 211/90關係最近，結果如圖2A所示，但由於18S序列鑑別度不高，故再進行ITS序列比對。 ITS 序列分析：將C40 的ITS序列(SEQ ID NO: 2)和NCBI 的nr 資料庫比對後，發現與藻株Chlorella lewinii KU220 (KM061464.1)、Chlorella lewinii KU201 (KM061450.1)及Chlorella lewinii KU213 (KM061460.1)之ITS序列相近，故以KU220、KU201、KU213及上述CCAP 211/90之ITS序列與C40之ITS序列進行比對。以親源分析結果各藻種ITS序列得知，C40與Chlorella lewinii CCAP 211/90關係最近，結果如圖2B所示。利用VNTI AlignX軟體比對，結果發現比對覆蓋率100％時，相似度為分別為99.3%、99.1%、98.8%及98.8%，比對結果如圖3所示，分析發現C40 之ITS 序列與上述各藻株之序列至少有5個核酸序列位置不同。 綜合上述序列分析結果得知C40 應為Chlorella lewinii ，且與目前被發表之最相近藻種仍有差異。Chlorella lewinii C40已於2016年12月2日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 980043。實例二、 C40 之組成分析 油脂分析 C40以800 mL C培養基，培養於1L血清瓶中，並通入無菌空氣，於30℃照光培養一個月。收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉萃取其油脂，發現其含油量為40.2%的藻體乾重。分析其油脂成分，三酸甘油酯(TAG)含量為99.3% (表1)。脂肪酸組成則為C16:0佔22.3％、C18:1佔42.5％、C18:2佔20.3％、C18:3佔14.9％。飽和脂肪酸比例為22.3％，單元不飽和脂肪酸比例為42.5％，多元不飽和脂肪酸比例為35.2％。歐盟生質柴油標準之DU值經計算為112.9，優於標準值(表2)。又其C18:1為ω-9形式、C18:2為ω-6形式，C18:3為ω-3形式，皆是食用油脂中對人體較好的油脂，在此藻體中含量豐富，因此本藻種亦可作為食用油。根據上述結果顯示，C40之油脂可作為食用油及生質柴油。 表1 註:TAG : 三酸甘油酯(triacylglycerol)FA : 脂肪酸(fatty acid)1,3-DAG : 1,3-雙醯基甘油酯(1,3-diacylglycerol)1,2-DAG : 1,2-雙醯基甘油酯(1,2-diacylglycerol)MAG : 單醯基甘油酯 (monoacylglycerol) - : 低於檢測極限 表2 - DU：不飽和度 (Degree of Unsaturation) = (單不飽和, w% + 2 (多不飽和, w%) (Ramos, M. J.,et al ., Influence of fatty acid composition of raw materials on biodiesel properties. Bioresource Technology2009; 100:261-268)實例三、 C40 的培養特性分析 1. 不同溫度培養測試 將藻體均勻接種於C 培養基中，各平板放入含20%二氧化碳之密封袋中，以不同溫度20℃、30℃與40℃進行照光培養。結果顯示C40 可生長在20-40℃，以30℃培養生長最好，20℃及40℃亦生長良好(圖4)。 2. 不同鹽度培養基測試 比較C40於不同鹽度培養基之生長狀況，結果顯示在0-3％鹽度之環境皆可生長(圖5)，以1.5％鹽度生長最好，故此藻種能夠以淡水與海水進行培養。 3. 不同pH值培養基測試 比較C40 於不同pH 值培養液中之生長狀況，結果顯示C40 在pH4-10之C培養液中均可生長(圖6)，以pH5-7之間生長最好。故此藻種可生長於pH4-10之範圍。 4. 有機培養基培養測試結果 C40以TSA、PDA及NA培養之結果分述如下： TSA 培養：混營條件下，於30°C 且給予12 小時光照12小時黑暗之光週期條件下，觀察C40呈現快速的生長，且約在24 小時後即可觀察到明顯的藻體生長狀態。異營條件下，於30°C 之黑暗條件下，於24小時後也可觀察到明顯的藻體生長狀態(圖7)。故C40以TSA培養時，可行混營與異營生長。 以PDA 培養：混營條件下，於30°C 且給予12 小時光照12 小時黑暗之光週期條件下，於24 小時及96小時觀察C40有生長。異營條件下，於30°C之黑暗條件下，於24小時及96小時觀察C40有生長(圖7)。故C40以PDA培養時，也可以混營與異營方式生長。 NA培養：混營條件下，於30°C且給予12小時光照12 小時黑暗之光週期條件下，於24 小時及96 小時觀察C40有生長。異營條件下，於30°C之黑暗條件下，於24小時及96小時觀察C40也有生長(圖7)。故C40以NA培養時，可以混營與異營方式生長。 由上述結果得知C40 在混營與異營條件下，分別以TSA、PDA 及NA 培養，皆可快速生長，其中以TSA 混營條件下生長最快。TSA 培養基中含有胰水解蛋白(Tryptone)及大豆水解蛋白(Soytone)兩種成分，C40可以利用此兩種氮源生長，故C40可能具有處理乳清或是大豆廢水，降低廢水中含氮量之潛力。 5. 藻株固碳效率測試 C40藻株以1公升之體積利用5%之二氧化碳氣體，以0.1vvm之通氣量培養10天後，共固定6.3克之二氧化碳生成微藻之藻體。利用第6~10天固碳穩定期進行評估，C40藻株之固碳效率為595.78 ± 37.79 mg/L/day (圖8)。 根據以上測試結果發現，C40 可生長在20-40℃，以30℃培養生長最好，20℃及40℃生長良好。又其可生長在0-3％鹽度之環境，以1.5％鹽度生長最好。又其可生長在pH4-10 之環境，以pH5-7 之間生長最好。C40 亦可行自營、混營與異營性生長。以C培養基通入空氣培養一個月後其油量佔微藻體乾重的40.2％，其脂肪酸組成適合作為生質柴油與食用油。又其固碳效率為595.78 ± 37.79 mg/L/d，可作為固碳之用。結論 由台灣分離一株產油微藻C40，經由鑑定為Chlorella lewinii 。本藻種可生長於溫度20-40°C、鹽度0-3％及pH4-10。又本藻株可行混營及異營培養。C40 藻株的培養條件測試結果得知，本藻株在高低溫、淡水海水、各種pH (pH4~10)及自營、異營與混營皆可生長，是一個在任何環境下皆可生長的優良藻株。此藻株的乾燥藻體之含油量在40.2%。油脂的脂肪酸組成以C16~C18的脂肪酸為主，佔總組成100％，其中C18:1 佔42.5％，可作為食用油脂。其固碳效率為595.78 ± 37.79 mg/L/d。由以上的結果顯示Chlorella lewinii C40藻株可以做為生產食用油脂及生質柴油的原料，也可做為二氧化碳及廢水減廢之用。

圖1為C40藻株的顯微鏡檢圖。圖1A為明視野觀察，藻細胞為圓球狀，直徑約為4~7 µm，顯微倍率1,000X；圖1B為以Nile Red染色，以螢光顯微鏡觀察，藻體內部有橘黃色之油滴分佈，顯微倍率1,000X。 圖2為C40與相似藻種序列比對之親源圖。圖2A為以各藻種18S-ITS序列進行資料分析之結果；圖2B為以各藻種ITS序列進行資料分析之結果。 圖3為C40與相近藻株之ITS序列AlginX比對結果。 圖4為C40藻株於不同培養溫度之生長情形。 圖5為C40藻株在不同培養鹽度下之生長情形。 圖6為C40藻株在不同pH值下之生長情形。 圖7為C40藻株在不同有機培養基中異營及混營生長測試結果。 圖8為C40藻株每日固炭量曲線。

國內寄存資訊 財團法人食品工業發展研究所，2016年12月2日，BCRC 980043。 國外寄存資訊 中國，中國典型培養物保藏中心，2016年12月12日，CCTCC M 2016742。

Claims (13)

1. 一種綠球藻(Chlorella lewinii )分離藻株，其包含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列之18S rDNA序列及SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列之ITS區域序列。
2. 如請求項1之綠球藻分離藻株，其中該綠球藻分離株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980043之藻株，或為與寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980043之藻株具有實質上完全相同特徵之變異株。
3. 一種製備綠球藻培養產物之方法，其包含將如請求項1或2之綠球藻分離藻株接種於培養基中，及進行培養以獲得該培養產物。
4. 如請求項3之方法，其中該培養基為液態培養基。
5. 如請求項3之方法，其中該培養係在不照光下、12 小時光照12 小時黑暗之光週期下或持續光照下進行。
6. 如請求項3之方法，其中該培養係在約10℃至約60℃下進行。
7. 如請求項3之方法，其中該培養基之pH值為約pH1至約pH14。
8. 如請求項3之方法，其中該培養基之鹽度為約0%至約6％。
9. 如請求項3至8中任一項之方法，其進一步包含分離該培養產物的步驟。
10. 一種綠球藻培養產物，其可由請求項3至9中任一項之方法來獲得。
11. 如請求項10之綠球藻培養產物，其包含三酸甘油酯及脂肪酸。
12. 一種製備三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法，其包含自如請求項10或11之綠球藻培養產物中分離出三酸甘油酯及/或脂肪酸。
13. 一種製備生質燃料之方法，其包含使用如請求項10或11之綠球藻培養產物作為原料。