WO2009130895A1 - フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類 - Google Patents

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microalga
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泉田仁
沖田裕司
杉本愼一
加藤美砂子
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日本水産株式会社
国立大学法人お茶の水女子大学
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fucoxanthin or a highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin using microalgae, and a microalgae for producing the fucoxanthin. Specifically, a method for producing fucoxanthin or a fucoxanthin containing a highly unsaturated fatty acid using a microalga belonging to the Pingioriophyceae, Golden algae, Diatom, or Haptophyta, and producing the fucoxanthin For microalgae.
  • Fucoxanthin is known for its antitumor effect, and its use as a pharmaceutical and health food is being studied (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 As a method for producing this fucoxanthin, methods of extracting from algae such as kombu and wakame are known (Patent Documents 2 and 3).
  • brown algae belonging to large algae such as kombu and seaweed have a very slow growth rate, and it takes time and cost to obtain a practical amount.
  • macroalgae have a high content of polysaccharides and the like, and the cell wall is sturdy, so there are problems in the method for extracting and producing fucoxanthin.
  • Patent Document 4 a method of cultivating mozuku's discoid body was studied as a method of artificially culturing.
  • the yield of fucoxanthin was as high as 1.1 g per 100 g of dry algae, but the production cost was high because the plate was difficult to handle and the culture rate was slow, so the productivity was low. There was a drawback of becoming.
  • Polyunsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid are used for pharmaceuticals, health foods and the like because of their useful physiological activities, but many are extracted from fish and the like. It is manufactured by a method requiring complicated extraction, purification, etc. (Patent Document 5).
  • the present invention aims at efficient collection of fucoxanthin or highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin, and a method for producing fucoxanthin or highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin using microalgae, and producing the fucoxanthin It is an object to provide microalgae for the purpose. More specifically, a method for producing fucoxanthin or a fucoxanthin containing a highly unsaturated fatty acid using a microalga belonging to the Pingioriophyceae, Golden algae, diatom, or haptophyceae, and producing the fucoxanthin It is an object to provide microalgae for the purpose.
  • microalgae produce fucoxanthin and the culture rate (growth rate), and as a result of earnest search for microalgae with a large amount of fucoxanthin production, Pingioophyceae, Golden algae,
  • the inventors have found that a microalga belonging to the diatom class or the hapto class is capable of producing a large amount of fucoxanthin, and completed the present invention.
  • the gist of the present invention is a method for producing fucoxanthin using microalgae described in (1) to (7) below.
  • a method for producing fucoxanthin comprising culturing a microalgae having fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more in a medium, and extracting and separating fucoxanthin from the cultured algal bodies.
  • microalga belonging to haptoglobulin Motsuna is microalga belonging to Pureurokurishisu genus (Pleurochrysis) or Pavlova sp (Pavlova), fucosyltransferase method for producing xanthine according to (3).
  • this invention makes a summary the manufacturing method of the polyunsaturated fatty acid containing fucoxanthin by a micro algae as described in following (8) thru
  • (8) In the method for producing fucoxanthin according to any one of (1) to (7), highly unsaturated fatty acid is collected simultaneously with collecting fucoxanthin from the culture. Method for producing fatty acid-containing fucoxanthin.
  • (9) The method for producing highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin according to (8), wherein the highly unsaturated fatty acid is a highly unsaturated fatty acid having 20 or more carbon atoms.
  • this invention makes a summary the micro algae as described in following (11).
  • (11) A microalgae having fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more for use in the production method according to any one of (1) to (7) above.
  • a method for producing fucoxanthin or a highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin using microalgae, and a microalgae having a fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more for producing the fucoxanthin Is provided. More specifically, a method for producing fucoxanthin or a fucoxanthin containing a highly unsaturated fatty acid using a microalga belonging to the Pingioriophyceae, Golden algae, diatom, or haptophyceae, and producing the fucoxanthin Therefore, a microalgae having a fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more is provided.
  • an efficient method for producing fucoxanthin, and the productivity of fucoxanthin used therefor is 0.5 mg / L / day or more, preferably 1.0 mg / L / day or more, more preferably 2.0 mg / L. Microalgae more than / day are provided, enabling mass production of fucoxanthin.
  • the microalgae is a general term for very small phytoplankton that can be observed only with a microscope among organisms that perform oxygen-generating photosynthesis except moss plants, fern plants, and seed plants that mainly live on the ground.
  • Examples of the microalgae used in the present invention include microalgae belonging to the Pingioriophyceae, Golden Algae, Diatoms, or Haptoalgae.
  • the microalgae belonging to the Pingioeophyceae belong to the genus Pinguiochrysis, the microalgae belonging to the Phaeomonas genus or the polypodochrysis genus, the golden algae Microalgae, such as microalgae belonging to the genus Ochromonas, microalgae belonging to the genus Dinobryon, microalgae belonging to the genus Poterioochromonas or microalgae belonging to the genus Epipyxis (Epipyxis) Microalgae belonging to the genus Phaeoductylum, microalgae belonging to Cyclotella, Skeletonema, Nitzschia, or Chaetoceros
  • the microalgae belonging to the haptophyceae are Pleurochrysis Ik Zante Macri cis genus (Exanthemachrysis), or Pavlova sp (Pavlov
  • the present invention relates to a method for producing fucoxanthin, comprising culturing a microalgae having fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more in a medium, and separating and extracting fucoxanthin from the cultured algal bodies.
  • a method for producing fucoxanthin comprising culturing a microalgae having fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more in a medium, and separating and extracting fucoxanthin from the cultured algal bodies.
  • the productivity is about 0.1 mg / L / day.
  • those having fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more are used.
  • fucoxanthin has a productivity of 0.5 mg / L / day or more, brown algae belonging to the large algae such as conventional kombu and wakame, which have a very slow growth rate, and a mozuku that is difficult to handle and has a slow culture rate.
  • microalgae Compared to a disk-like body, a stable and practical amount can be obtained economically. These microalgae are easier to extract and produce than large algae, and also contain useful highly unsaturated fatty acids. Of microalgae, fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more is economically sufficient, but is preferably 1.0 mg / L / day or more, more preferably 2.0 mg. More than / L / day is good.
  • the present invention also includes culturing a microalgae having a fucoxanthin productivity of 0.5 mg / L / day or more in a medium containing an organic substance containing sugar, and separating and extracting fucoxanthin from the cultured algal cells. It is related with the manufacturing method of the fucoxanthin characterized.
  • the kind of sugar used at this time is not particularly limited as long as it can grow microalgae of the genus Ochromonus.
  • polysaccharides such as starch, cellulose, ⁇ 1,3-glucan, chitin and fructan
  • disaccharides such as sucrose, cellobiose, maltose, trehalose and lactose
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, galactose and lactose
  • examples of other organic substances include glycerin and phenol.
  • starch, maltose, cellobiose, or glucose is used as a carbon source, fucoxanthin can be efficiently produced, and fructose, mannose, phenol, or the like can be used as one having productivity equivalent to these.
  • Pingio microalga belonging to algae rope is Pingiokurishisu pyriformis (Pinguiochrysis pyriformis), Faeomonasu parva (Phaeomonas parva) and Poripodokurishisu Teeishieri (Polypodochrysis teissieri), microalgae belonging golden algae rope is Okuromonasu Danica ( Ochromonas danica ), Ochromonas tuberculata ( Ochromonas villosa ), or Ochromonas minuta ( Ochromonas minuta ), Dinobryon cylindrical moss ( Dinobryon cylindrical ), Poterio spi glabra), such as microalgae belonging to the diatom rope is Faye Oda Cu Chi Lam Torikorunatamu (Phaeodactylum tricornutum), Shikurotera Kuriputika (Cyclotella cryptica), Shikuroter
  • the medium for culturing microalgae is not particularly limited as long as microalgae can be cultured.
  • artificial seawater or seawater to which nutrient salts such as nitrogen and phosphoric acid, vitamins, and trace elements are added can be used.
  • cultivation is performed on light irradiation conditions, and the irradiation method can be performed by continuous irradiation and photoperiod irradiation.
  • Fucoxanthin is extracted from the algae thus cultured according to a conventional method. At this time, after the centrifuged algal bodies are dried, the fucoxanthin can be extracted more easily.
  • the microalgae of the genus Ochromonus can be grown on organic substances such as sugar, the algal bodies can be grown without irradiating light. It is possible to develop microalgae that grow on organic substances such as sugar in microalgae other than Ochromonas. For example, a diatom genus Nitrica can also be used.
  • the present invention also relates to a method for producing fucoxanthin, which obtains 6 g / L or more of dry algae by culturing Ochromonas microalgae in a medium containing an organic substance containing sugar.
  • microalgae are cultured without organic substances such as glucose
  • the light transmittance is deteriorated due to the algal body density when the culture density of microalgae is 3 g / L or more. Therefore, it is necessary to increase the light intensity. Further, there is a problem that increasing the light intensity makes it difficult to control the water temperature.
  • the organic matter grows as a nutrient, so that dry algae of 6 g / L or more can be easily obtained without light irradiation.
  • the solvent for extracting fucoxanthin from microalgae is not particularly limited as long as fucoxanthin can be extracted, but methyl acetate, ethyl acetate, acetone, chloroform, toluene and the like can be used.
  • alcohols such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, n-butanol, ketones such as methyl ethyl ketone and acetone, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, organochlorine hydrocarbons such as chloroform, and aliphatic carbonization such as hexane
  • Organic solvents such as hydrogen, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene can be used alone or in combination of two or more.
  • the organic solvent can be used in a ratio of 1: 100 to 100: 1, preferably 1:50 to 50: 1, with respect to the dried microalgae.
  • the extraction using the organic solvent can be performed by a conventional method.
  • the temperature is 0 ° C. to 60 ° C., preferably 5 ° C. to 40 ° C. for 0.5 hours to Extraction may be performed for 100 hours, preferably 12 to 72 hours.
  • stirring may be performed with an ultrasonic wave, a stirrer, or the like. Fucoxanthin can be separated and purified by using the organic solvent extract thus obtained as it is or after removing the residue, followed by ion exchange chromatography or reverse phase chromatography using a liquid high performance chromatograph.
  • a mixture of a highly unsaturated fatty acid and fucoxanthin can be obtained by using the organic solvent extract without subjecting it to chromatography such as HPLC.
  • the highly unsaturated fatty acid referred to here is preferably a highly unsaturated fatty acid having 20 or more carbon atoms, and particularly contains eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, or a mixture thereof.
  • Pinguiochrysis pyriformis MBIC10782 strain obtained from Marine Biotechnology Research Laboratories belonging to the Pingiophyceae class was cultured in IMK medium (Table 2).
  • IMK medium 100 ml of IMK medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and silicocene (manufactured by Shin-Etsu Polymer Co., Ltd.) was used.
  • a 1 ml glass pipette was pierced into the silicocene and aerated and stirred from the bottom of the test tube.
  • This culture was carried out in a thermostatic water bath at 25 ° C., 300 ⁇ mol m ⁇ 2 S ⁇ 1 (continuous irradiation) for 7 days while controlling the pH under aeration conditions.
  • the time course of the culture is shown in FIG.
  • the production amount of fucoxanthin of Ochromonas danica CS-4 strain of Culture Example 1 was 0.538 mg per 0.1 g of dry alga bodies, and the productivity was 2.03 mg / L / day.
  • the Fucoxanthin production amount of the Pinguiochrysis pyriformis MBIC10782 strain of Culture Example 2 was 0.640 mg per 0.1 g of dry alga bodies, and the productivity was 3.90 mg / L / day.
  • the production amount of fucoxanthin of Phaeodactylum tricornutum CCAP 1052 / 1A in Culture Example 3 was 0.583 mg per 0.1 g of dry algae, and the productivity was 1.55 mg / L / day.
  • the production amount of fucoxanthin of Pavlova pinguis AC19 in Culture Example 4 was 0.792 mg per 0.1 g of dry algal cells, and the productivity was 1.28 mg / L / day.
  • the amount of fucoxanthin produced by the Ochromonas danica CS-4 strain of Culture Example 5 was 0.428 mg per 0.1 g of dry alga, and the productivity was 4.29 mg / L / day.
  • the amount of fucoxanthin produced by the Ochromonas danica CS-4 strain in Example 6 of culture was 0.409 mg per 0.1 g of dry algae, and the productivity was 3.98 mg / L / day.
  • methanolysis was performed by adding 5% hydrogen chloride methanol to the extract of Pinguiochrysis pyriformis MBIC10782 strain and reacting at 90 ° C. for 2 hours.
  • the fatty acid methyl ester was extracted with hexane, concentrated with nitrogen gas, and analyzed by gas chromatography (GC17A; manufactured by Shimadzu Corporation).
  • GC17A gas chromatography
  • an efficient method for producing fucoxanthin, and the productivity of fucoxanthin used therefor is 0.5 mg / L / day or more, preferably 1.0 mg / L / day or more, more preferably 2.0 mg / L.
  • Microalgae more than / day can be provided, mass production of fucoxanthin is possible, and highly unsaturated fatty acid-containing fucoxanthin can be obtained without requiring complicated purification means.

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Abstract

課題：フコキサンチンの大量生産を可能とする、効率的なフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、およびそれに用いる微細藻類を提供すること。 解決手段：微細藻類、より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を培養し、その培養藻体から、フコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンを抽出、分離することを特徴とする製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類。

Description

フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類
　本発明は、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類に関する。具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類に関する。
　フコキサンチンは、抗腫瘍効果などが知られており、医薬，健康食品としての利用が検討されている（特許文献１）。このフコキサンチンの製造方法として、大型藻類であるコンブ、ワカメなどから抽出する方法が知られている（特許文献２および３）。しかながら、コンブ、ワカメなどの大型藻類に属する褐藻類は、成長速度が非常に遅いため、実用的な量を得るためには、時間とコストがかかることが問題になっている。また、実際には海洋で栽培する必要があるため安定な供給にも問題がある。さらに、大型藻類は多糖などの含有量が多くまた、細胞壁が頑丈なためフコキサンチンの抽出・生産方法に問題があった。
　そこで、人工的に培養する方法としてモズクの盤状体を培養する方法が検討された（特許文献４）。この方法は、フコキサンチンの収量が乾燥藻体１００ｇあたり１．１ｇと非常に高くなったが、盤状体の取り扱いが難しいことおよび培養速度が遅いため、生産性が低いため、製造コストが高くなるという欠点あった。
　また、エイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸は、その有用な生理活性から、医薬、健康食品などのに利用されているものであるが、多くは、魚類等から抽出されているものであって、複雑な抽出、精製等を要する方法で製造されている（特許文献５）。
特開平１０－１５８１５６号公報 特許第２６３９６３０号公報 特許第２６７３６８４号公報 特開２００４－３５５２８号公報 特公平４－１６５１９号公報
　本発明は、効率的な、フコキサンチンあるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの採取を目的とし、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類を提供することを課題とする。より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類を提供することを課題とする。
　本発明者らは微細藻類がフコキサンチンを生産すること及びその培養速度（成長速度）に着目し、フコキサンチン生産量の多い微細藻類を求め鋭意探索の結果、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類にフコキサンチンを多く生産するものを見出し、本発明を完成させるに至った。　　　
　本発明は、下記（１）ないし（７）に記載の、微細藻類によるフコキサンチンの製造方法を要旨とする。
（１）フコキサンチンの生産性が０．５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを抽出、分離することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法。
（２）培地が糖を含む有機物を含有する培地である（１）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（３）微細藻類がピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類である、（１）または（２）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（４）ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（５）黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（６）珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（７）ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）またはパブロバ属（Pavlova）に属する微細藻である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
　また本発明は、下記（８）ないし（１０）に記載の、微細藻類による高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法を要旨とする。
（８）（１）ないし（７）のいずれか一項に記載のフコキサンチンの製造方法において、培養物からフコキサンチンを採取すると同時に高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（９）高度不飽和脂肪酸が炭素数２０以上の高度不飽和脂肪酸である、（８）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（１０）高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種である、（９）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
　さらに本発明は、下記（１１）に記載の、微細藻類を要旨とする。
（１１）上記（１）ないし（７）のいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類。
　本発明により、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供される。より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供される。本発明により、効率的なフコキサンチンの製造方法、およびそれに用いるフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供され、フコキサンチンの大量生産が可能となる。
培養例２における、ピンギオ藻の培養の経時変化を示す。
　微細藻類とは、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除く酸素発生型光合成を行う生物、即ち藻類のうち、顕微鏡でしか観察できない非常に小さな植物プランクトンの総称である。
　本発明で用いる微細藻類としては、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類が挙げられる。より具体的には、ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類、ファエオモナス属（Phaeomonas）に属する微細藻類またはポリポドクリシス属（Polypodochrysis）に属する微細藻類、黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類、サヤツナギ属(Dinobryon)に属する微細藻類、ポテリオオクロモナス属(Poterioochromonas)に属する微細藻類またはエピピクシス属(Epipyxis)に属する微細藻類など、珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類、シクロテラ属(Cyclotella)に属する微細藻類、スケルトネマ属(Skeletonema)、ニッチア属(Nitzschia)、またはキートセラス属(Chaetoceros)に属する微細藻など、ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）、イクザンテマクリシス属 (Exanthemachrysis)、またはパブロバ属（Pavlova）、またはイソクリシス属(Isochrysis属)に属する微細藻類などが挙げられる。
　本発明は、フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離・抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法に関する。
［生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であることの意義］
　微細藻類には、フコキサンチンを生産することは、すでに知られていたが、このフコキサンチンは、光合成のための集光作用を持つ補助色素として知られていた。しかしながら、微細藻類中のフコキサンチン量を詳細に検討した研究例がなかったため、どの程度のフコキサンチンを含むのかまったく知られていなかった（高市真一編「カロテノイド」２００６年４月、ｐ.１０－４８）
　海藻からフコキサンチンをとる場合、食品との競合、回収の難しさ、安定生産、抽出の難しさ(多糖の存在)などがある。微細藻と同じ単位で生産性を比較するのは難しいが、ワカメの場合を例にとると、０．０１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。いずれにせよ海藻からとる場合、０．０１ｍｇ/Ｌ/日以上は困難と考えられる。まず、盤状体を作成するのに、２０日～３０日かかる。その後、7日間培養する。この盤状体を作るのが律速になる。盤状体作成から生産するまで３０日程度かかるとすると、その生産性は、０．１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。
　本発明においては、上記の微細藻類のうちフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であるものを用いる。フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものを用いると、従来の成長速度が非常に遅いコンブ、ワカメなどの大型藻類に属する褐藻類や、取り扱いが難しく、培養速度が遅いモズクの盤状体などに比し、安定で、実用的な量を経済的に得ることができる。またこれら微細藻類は、大型藻類に比し抽出・生産方法が容易であり、さらに、有用な高度不飽和脂肪酸も含有するものである。
　微細藻類のうち、フコキサンチンの生産性として０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものであれば、経済的に充分であるが、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上ものが良い。
　また、本発明はフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を、糖を含む有機物を含有する培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離、抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法に関する。この時用いる糖の種類としては、オクロモナス属の微細藻類が生育できるものであれば特に限定されない。例えば、でんぷん，セルロース，β1，3-グルカン，キチン，フルクタンなどの多糖類、ショ糖，セロビオース，マルトース，トレハロース，乳糖などの２糖類、グルコース，フルクトース，マンノース，ガラクトース，ラクトースなどの単糖類を用いることができる。その他の有機物としては、グリセリン，フェノールなどが用いられる。特にでんぷん，マルトース，セロビオース，グルコースを炭素源として用いると効率よくフコキサンチンを生産でき、これらと同等の生産性を持つものとしてフルクトース，マンノース，フェノールなどを用いることもできる。
　微細藻類のさらに具体的なものとしては、ピンギオ藻綱に属する微細藻がピンギオクリシス　ピリフォルミス(Pinguiochrysis pyriformis)、ファエオモナス　パルバ(Phaeomonas parva)およびポリポドクリシス　テエイシエリ(Polypodochrysis teissieri)、黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス　ダニカ(Ochromonas danica)、オクロモナス　ツベルクラタ(Ochromonas tuberculata)およびオクロモナス　ビロサ(Ochromonas villosa)、または、オクロモナス　ミヌタ(Ochromonas minuta)、ディノビオン　シリンドリカ(Dinobryon cylindrical)、ポテリオオクロモナス　マルハメンシス(Poterioochromonas malhamensis) 、エピピクシス　グラブラ(Epipyxis glabra)など、珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム　トリコルナタム(Phaeodactylum tricornutum)、シクロテラ　クリプティカ(Cyclotella cryptica)、シクロテラ　メネギニアナ (Cyclotella meneghiniana)、スケルトネマ　コスタツム(Skeletonema costatum)、ニッチア　ラエビス(Nitzschia laevis)、キートセラス グラシス(Chaetoceros gacilis)など、ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス　ハプトネモフェラ(Pleurochrysis haptonemofera)、イクザンテマクリシス　ガイラリエ(Exanthemachrysis gayraliae)、パプロバ　ピングイス（Pavlova pinguis）　および　パブロバ　ルセリ（Pavlova lutheri）、イソクリシス　ガルバナ(Isochrysis galbana)などが挙げられる。
　微細藻を培養する培地は、微細藻を培養することができれば特に制限されず、例えば人工海水または海水に窒素、リン酸等の栄養塩、ビタミン類、微量元素を添加したものを用いることができる。また培養は、光照射条件下で行い、照射方法は連続照射、光周期照射で行うことができる。このようにして培養した藻類からフコキサンチンを常法に従い抽出する。この時、遠心分離した藻体を乾燥後、フコキサンチンを抽出することでより簡便に抽出を行える。
　また、オクロモナス属の微細藻類は、糖などの有機物で増殖することができるため光を照射しなくても藻体を増殖させることができる。オクロモナス属以外微細藻類で糖などの有機物で生育する微細藻類への展開も可能である。例えば、珪藻綱のニッチア属なども用いることができる。
　また本発明は、オクロモナス属の微細藻類を、糖を含む有機物を含有する培地で培養することにより、６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体の乾燥藻を得るフコキサンチンの製造方法に関する。通常、グルコースなどの有機物なしで微細藻類を培養すると微細藻類の培養密度が３ｇ／Ｌ以上になると藻体密度により光の透過性が悪くなるため、光強度を高める必要がある。また、光強度をあげると水温の制御が困難になるなどの問題がある。有機物で培養すると有機物を栄養として増殖するので光照射をすることなしに６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体を容易に得ることができる。
　微細藻からフコキサンチンを抽出するための溶剤は、フコキサンチンを抽出できるものであれば特に限定されないが、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、等用いることができる。例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等のアルコール類、メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、クロロホルム等の有機塩素系炭化水素、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香属炭化水素類等の有機溶媒を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。この有機溶媒は、微細藻類の乾燥体に対し１:１００～１００：１、好ましくは１:５０～５０：１の割合で用いることができる。上記有機溶媒を用いる抽出は常法により行うことができ、例えば、有機溶媒としてエタノールを用いる場合であれば、０℃～６０℃、好ましくは５℃～４０℃の温度で、０．５時間～１００時間、好ましくは１２時間～７２時間抽出を行えば良い。また、抽出に当たっては、必要により、超音波、撹拌機等により撹拌を行っても良い。このようにして得られた有機溶媒抽出物をそのまま、あるいは残渣を除去後、液体高速クロマトグラフを用いてイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーなどにより、フコキサンチンを分離、精製することができる。
　また、前記有機溶媒抽出物をＨＰＬＣ等のクロマトグラフィーに付さずに用いることにより、高度不飽和脂肪酸とフコキサンチンの混合物を得ることができる。ここで言う高度不飽和脂肪酸とは、好ましくは炭素数が２０以上の高度不飽和脂肪酸であり、特にエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸、あるいはこれらの混合物を含有するものである。
　以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
　［培養例１］
　黄金色藻の培養
　黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＪＭ培地(表1)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［培養例２］
　ピンギオ藻の培養
　ピンギオ藻綱に属するPinguiochrysis pyriformis MBIC10782株（海洋バイオテクノロジー研究所から入手）は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌのＩＭＫ培地を入れシリコセン（信越ポリマー社製）をし、１ｍｌのガラスピペットをシリコセンに突き刺して試験管底部から通気撹拌した。この培養は恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（連続照射）、通気条件下pHをコントロールしながら７日間行った。培養の経時変化を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　［培養例３］
　珪藻の培養
　珪藻綱に属するPhaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1A株 (Culturecollection of algae and protozoa　から購入)は、f/2 + Si培地(表３)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（明期１４時間、暗期１０時間）にて８日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　［培養例４］
　ハプト藻の培養
　ハプト藻綱に属するPavlova pinguis AC19株 ( Microalgal Culture Collection University of Caen Basse-Normandieから購入)は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのJM培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（明期１４時間、暗期１０時間）にて１０日間培養した。
　[培養例５]
可溶性でんぷんを基質とした黄金色藻の培養
　黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｓ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｓ培地を入れて、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　[培養例６]
グルコースを基質とした黄金色藻の培養
　黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｇ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｇ培地を入れて振盪培養機（高崎科学）で２５℃，１００ｒｐｍで３日間、暗状態で培養後、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ－２ Ｓ－１（明期１４時間、暗期１０時間）にて４日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［抽出例］
フコキサンチンの抽出および定量
　培養例１、２、３、及び４の培養液１００ｍｌをそれぞれ遠心分離し上清を除去した後、沈降した藻体を取り出して凍結乾燥機（富士医科産業社製）にて凍結乾燥した。この結果、乾燥藻体を０．２６４ｇ（培養例１）および０．４２７ｇ（培養例２）、０．２１３ｇ（培養例３）、０．１６２ｇ（培養例４）、０．７０２ｇ（培養例５）、０.６８１ｇ(培養６)を得た。次に、それぞれの乾燥藻体０．１ｇに３ｍｌのアセトンを加えボルティックスミキサーでよく撹拌し、フコキサンチンを抽出した。この抽出液をマイショリディスクH-13-5(東ソー社製)を用いて残渣を除いた後減圧濃縮し、定量用サンプルとした。フコキサンチンの定量は、TSKgel-ODS80Ts（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）による高速液体クロマトグラフィー（SCL 10A：470nm；島津製作所社製，流速1.0m/分）により行い、フコキサンチン生産量、および数１に示される計算式を用いて生産性を求めた。なお、フコキサンチンの標準試薬は、和光純薬工業社製のフコキサンチンを用いた。
　この結果、培養例１のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．５３８ｍｇであり、生産性は２．０３ｍｇ/L/日であった。同様に、培養例２のPinguiochrysis pyriformis MBIC10782株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．６４０ｍｇであり、生産性は３．９０ｍｇ/L/日であった。培養例３のPhaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1Aのフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．５８３ｍｇであり、生産性は１．５５ｍｇ/L/日であった。培養例４のPavlova pinguis AC19のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．７９２ｍｇであり、生産性は１．２８ｍｇ/L/日であった。培養例５のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．４２８ｍｇであり、生産性は４．２９ｍｇ/L/日であった。培養例６のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．４０９ｍｇであり、生産性は３．９８ｍｇ/L/日であった。また、Pinguiochrysis pyriformis MBIC10782株の抽出液に５％塩化水素メタノールを加え、９０℃で２時間反応させ、メタノリシスを行った。脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出し、窒素ガスで濃縮した後にガスクロマトグラフィー(GC17A；島津製作所社製)で分析したところ、乾燥藻体０．１ｇあたりエイコサペンタエン酸が６．４ｍｇ含まれていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明により、効率的なフコキサンチンの製造方法、およびそれに用いるフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供され、フコキサンチンの大量生産を可能とし、また、複雑な精製手段等を要せずに、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンを得ることができる。

Claims (11)

  1. 　フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離、抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法。
  2. 培地が糖を含む有機物を含有する培地である請求項１に記載のフコキサンチンの製造方法。
  3. 　微細藻類がピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類である、請求項１または２に記載のフコキサンチンの製造方法。
  4. 　ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
  5. 　黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
  6. 　珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
  7. 　ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）またはパブロバ属（Pavlova）に属する微細藻である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
  8. 　請求項１ないし７のいずれか一項に記載のフコキサンチンの製造方法において、培養物からフコキサンチンを採取すると同時に高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
  9. 　高度不飽和脂肪酸が炭素数２０以上の高度不飽和脂肪酸である、請求項８に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
  10. 　高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種である、請求項９に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
  11. 請求項１ないし７のいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上である微細藻類。
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