JPH06225778A - 海洋微細藻類によるドコサヘキサエン酸の生産方法 - Google Patents
海洋微細藻類によるドコサヘキサエン酸の生産方法Info
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- JPH06225778A JPH06225778A JP5034636A JP3463693A JPH06225778A JP H06225778 A JPH06225778 A JP H06225778A JP 5034636 A JP5034636 A JP 5034636A JP 3463693 A JP3463693 A JP 3463693A JP H06225778 A JPH06225778 A JP H06225778A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産性海洋微細
藻類によるＤＨＡの生産において、培養液内の光強度を
均一に分散させる装置を用い、かつその光強度を一定の
範囲に制御することを特徴とするＤＨＡの生産方法。 【効果】本発明の方法により、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ
ｇａｌｂａｎａをはじめとするＤＨＡ生産性海洋微細藻
類の培養によるＤＨＡの生産を、高い効率で行うことが
可能となる。
藻類によるＤＨＡの生産において、培養液内の光強度を
均一に分散させる装置を用い、かつその光強度を一定の
範囲に制御することを特徴とするＤＨＡの生産方法。 【効果】本発明の方法により、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ
ｇａｌｂａｎａをはじめとするＤＨＡ生産性海洋微細藻
類の培養によるＤＨＡの生産を、高い効率で行うことが
可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は海洋微細藻類によるドコ
サヘキサエン酸の生産方法に関するものである。
サヘキサエン酸の生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】ＤＨＡは
脳の神経組織やヒトの網膜の構成脂質として、重要な機
能を果たすことが知られている（Drats EA, Deese AJ
(1986), Health Effects of Polyunsaturated Fatty Ac
ids in Seafoods. Academic Press, 319-340、Neuring
er M, Connor WE, van Patten C, Barstad L (1984) J
Clin Invest, 73:272-281）。さらに、ＤＨＡなどのω
３系統の高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、ヒトの種々
の疾病に対して予防効果があることが報告されている
（Yongmanitchai W, Ward OP(1989) Omega-3 fatty aci
ds:Alternative Sources of Production. ProcessBioc
hemistry 117-125）。現在、これらの高度不飽和脂肪酸
の供給源は魚油であるが、魚油由来のＤＨＡは魚臭が強
く品質が悪い。一方、魚油中のこれらの脂肪酸の起源
は、魚の餌である海洋微生物であることが知られてい
る。
脳の神経組織やヒトの網膜の構成脂質として、重要な機
能を果たすことが知られている（Drats EA, Deese AJ
(1986), Health Effects of Polyunsaturated Fatty Ac
ids in Seafoods. Academic Press, 319-340、Neuring
er M, Connor WE, van Patten C, Barstad L (1984) J
Clin Invest, 73:272-281）。さらに、ＤＨＡなどのω
３系統の高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、ヒトの種々
の疾病に対して予防効果があることが報告されている
（Yongmanitchai W, Ward OP(1989) Omega-3 fatty aci
ds:Alternative Sources of Production. ProcessBioc
hemistry 117-125）。現在、これらの高度不飽和脂肪酸
の供給源は魚油であるが、魚油由来のＤＨＡは魚臭が強
く品質が悪い。一方、魚油中のこれらの脂肪酸の起源
は、魚の餌である海洋微生物であることが知られてい
る。
【０００３】
【課題を解決するための手段】ある種の海洋微細藻類例
えば、海洋単細胞藻類の一種であるハプト藻（Ｉｓｏｃ
ｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）にはＥＰＡやＤＨＡが
豊富に含まれていることが報告されている（Yongmanitc
hai W, Ward OP (1989) Omega-3 fatty acids:Alternat
ive Sources of Production. Process Biochemistry 1
17-125）。Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａはω
３系統の高度不飽和脂肪酸源として知られ、餌料藻類と
して水産業に利用されている（Bayne BL (1976) The bi
ology ofthe mussel larvae. In:Bayne BL(eds)Marine
Mussels:Their Ecology and Physiology. Cambridge Un
iversity Press, London, 319-340、Epifanio CE (197
9)Comparison of yeast algal diets for bivalve moll
usucs. Aquaculture, 16:187-192)。これまで、Ｉ．ｇ
ａｌｂａｎａでは餌料藻類として藻体を利用することを
主目的として研究が行なわれてきたが、ＤＨＡに注目し
て行なった研究はほとんどなかった（Molina Grima E,
Sanchez Perez J A; Garcia Sanchez J L; Garcia Cama
cho F, lopez Alonso D (1992) EPA from Isochrysis g
albana. Growth Conditions and Productivity. Proces
s Biochemistry 27:299-305)。本発明者らは、ＤＨＡお
よびＤＨＡ含有脂質に着目し、微細藻類による高品質Ｄ
ＨＡの高効率生産を目的として研究を行い、海洋微細藻
類の培養条件、特に光照明方法及びその強度を制御する
こと等により、ＤＨＡの高効率生産を達成できることを
発見し、さらに研究を進めて本発明を完成した。
えば、海洋単細胞藻類の一種であるハプト藻（Ｉｓｏｃ
ｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）にはＥＰＡやＤＨＡが
豊富に含まれていることが報告されている（Yongmanitc
hai W, Ward OP (1989) Omega-3 fatty acids:Alternat
ive Sources of Production. Process Biochemistry 1
17-125）。Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａはω
３系統の高度不飽和脂肪酸源として知られ、餌料藻類と
して水産業に利用されている（Bayne BL (1976) The bi
ology ofthe mussel larvae. In:Bayne BL(eds)Marine
Mussels:Their Ecology and Physiology. Cambridge Un
iversity Press, London, 319-340、Epifanio CE (197
9)Comparison of yeast algal diets for bivalve moll
usucs. Aquaculture, 16:187-192)。これまで、Ｉ．ｇ
ａｌｂａｎａでは餌料藻類として藻体を利用することを
主目的として研究が行なわれてきたが、ＤＨＡに注目し
て行なった研究はほとんどなかった（Molina Grima E,
Sanchez Perez J A; Garcia Sanchez J L; Garcia Cama
cho F, lopez Alonso D (1992) EPA from Isochrysis g
albana. Growth Conditions and Productivity. Proces
s Biochemistry 27:299-305)。本発明者らは、ＤＨＡお
よびＤＨＡ含有脂質に着目し、微細藻類による高品質Ｄ
ＨＡの高効率生産を目的として研究を行い、海洋微細藻
類の培養条件、特に光照明方法及びその強度を制御する
こと等により、ＤＨＡの高効率生産を達成できることを
発見し、さらに研究を進めて本発明を完成した。
【０００４】すなわち、本発明の要旨は、ドコサヘキサ
エン酸（ＤＨＡ）生産性海洋微細藻類によるＤＨＡの生
産において、培養液内の光強度を均一に分散させる装置
を用い、かつその光強度を一定の範囲に制御することを
特徴とするＤＨＡの生産方法に関する。好ましくは、そ
の光強度を均一に分散させる装置がフォトバイオリアク
ターであり、そのＤＨＡ生産性海洋微細藻類がハプト藻
（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）であり、特
に好ましくは、そのＤＨＡ生産性海洋微細藻類が、パブ
ロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）、ク
リコスファエラ・カルテラエ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒ
ａ ｃａｒｔｅｒａｅ）、カエトセロス・カルシトラン
ス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎ
ｓ）、カエトセロス・グラシリス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒ
ｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、又はクリプトモナス・スピ
ーシーズ（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）であるも
のである。
エン酸（ＤＨＡ）生産性海洋微細藻類によるＤＨＡの生
産において、培養液内の光強度を均一に分散させる装置
を用い、かつその光強度を一定の範囲に制御することを
特徴とするＤＨＡの生産方法に関する。好ましくは、そ
の光強度を均一に分散させる装置がフォトバイオリアク
ターであり、そのＤＨＡ生産性海洋微細藻類がハプト藻
（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）であり、特
に好ましくは、そのＤＨＡ生産性海洋微細藻類が、パブ
ロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）、ク
リコスファエラ・カルテラエ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒ
ａ ｃａｒｔｅｒａｅ）、カエトセロス・カルシトラン
ス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎ
ｓ）、カエトセロス・グラシリス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒ
ｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、又はクリプトモナス・スピ
ーシーズ（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）であるも
のである。
【０００５】微細藻類によるＤＨＡ生産をコントロール
する要因として、光、二酸化炭素、温度および培地成分
が考えられる。これらの要因を最適化することによって
微細藻類がもつ光合成能力、ＤＨＡ生産能力を発揮させ
ることができる。この中でも光の照明の最適化は困難な
問題である。藻体懸濁液に外部から光を照射すると、藻
体懸濁液の光照射側に存在する細胞に光が遮られ、実際
には、懸濁液内部の細胞には光が供給されない。したが
って、微細藻類を効率よく培養するためには、培養液内
において十分に光を供給する必要がある。培養液内の光
強度を均一にし、かつ培養に必要な光を十分に供給する
ことが可能な、フォトバイオリアクターが開発されてい
る（Matsunaga T, Takeyama H, Sudo H, Oyama N, Ariu
ra S, Takano H, Hirano M, BurgessJG, Sode K, Nakam
ura N (1991) Glutamate production from CO2 by mari
necya-nobacterium Synechococcus sp. using a novel
biosolar reactor employing light-diffusing optical
fibers. Appl Biochem Biotechnol 28/29:157-167）。
する要因として、光、二酸化炭素、温度および培地成分
が考えられる。これらの要因を最適化することによって
微細藻類がもつ光合成能力、ＤＨＡ生産能力を発揮させ
ることができる。この中でも光の照明の最適化は困難な
問題である。藻体懸濁液に外部から光を照射すると、藻
体懸濁液の光照射側に存在する細胞に光が遮られ、実際
には、懸濁液内部の細胞には光が供給されない。したが
って、微細藻類を効率よく培養するためには、培養液内
において十分に光を供給する必要がある。培養液内の光
強度を均一にし、かつ培養に必要な光を十分に供給する
ことが可能な、フォトバイオリアクターが開発されてい
る（Matsunaga T, Takeyama H, Sudo H, Oyama N, Ariu
ra S, Takano H, Hirano M, BurgessJG, Sode K, Nakam
ura N (1991) Glutamate production from CO2 by mari
necya-nobacterium Synechococcus sp. using a novel
biosolar reactor employing light-diffusing optical
fibers. Appl Biochem Biotechnol 28/29:157-167）。
【０００６】本発明に用いられるＤＨＡ生産性海洋微細
藻類としては、培養条件を適当に選べばＤＨＡを産生す
ることができる海洋微細藻類であれば特に限定されるこ
とはなく、また遺伝子組換え、突然変異等の手段により
得られるＤＨＡ高生産株も含まれる。具体例としては、
ハプト藻に属するイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈ
ｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）、ツノケイ藻に属するカ
エトセロス・グラシリス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇ
ｒａｃｉｌｉｓ）、カエトセロス・カルシトランス（Ｃ
ｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、クリ
プト藻に属するクリプトモナス属菌（Ｃｒｙｐｔｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．）、その他パブロバ属菌（Ｐａｖｌｏｖ
ａ ｌｕｔｈｅｒｉ）およびクリコスファエラ属菌（Ｃ
ｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ ｃａｒｔｅｒａｅ）などが挙
げられる。
藻類としては、培養条件を適当に選べばＤＨＡを産生す
ることができる海洋微細藻類であれば特に限定されるこ
とはなく、また遺伝子組換え、突然変異等の手段により
得られるＤＨＡ高生産株も含まれる。具体例としては、
ハプト藻に属するイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈ
ｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）、ツノケイ藻に属するカ
エトセロス・グラシリス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇ
ｒａｃｉｌｉｓ）、カエトセロス・カルシトランス（Ｃ
ｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、クリ
プト藻に属するクリプトモナス属菌（Ｃｒｙｐｔｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．）、その他パブロバ属菌（Ｐａｖｌｏｖ
ａ ｌｕｔｈｅｒｉ）およびクリコスファエラ属菌（Ｃ
ｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ ｃａｒｔｅｒａｅ）などが挙
げられる。
【０００７】より具体的には、イソクリシス・ガルバナ
ＬＢ２３０７、イソクリシス・ガルバナ ＬＢ９８０
７、カエトセロス・グラシリス ２３７５、カエトセロ
ス・カルシトランス ＣＣＡＬ１３１５、クリプトモナ
ス・スピーシーズ ＬＢ２４２３、パブロバ・ルテリ
ＬＢ１２９３、クリコスファエラ・カルテラエ ＬＢ１
０１４、クリコスファエラ・カルテラエ ＬＢ２１６７
等が挙げられ、これらの菌株はテキサス大の藻類カルチ
ャーコレクション及びｐｒｏｖａｓｏｌｉ Ｇｉｌｌａ
ｒｄ藻類カルチャーセンターのいずれかから容易に入手
することができる。
ＬＢ２３０７、イソクリシス・ガルバナ ＬＢ９８０
７、カエトセロス・グラシリス ２３７５、カエトセロ
ス・カルシトランス ＣＣＡＬ１３１５、クリプトモナ
ス・スピーシーズ ＬＢ２４２３、パブロバ・ルテリ
ＬＢ１２９３、クリコスファエラ・カルテラエ ＬＢ１
０１４、クリコスファエラ・カルテラエ ＬＢ２１６７
等が挙げられ、これらの菌株はテキサス大の藻類カルチ
ャーコレクション及びｐｒｏｖａｓｏｌｉ Ｇｉｌｌａ
ｒｄ藻類カルチャーセンターのいずれかから容易に入手
することができる。
【０００８】光強度を培養液内に均一に分散させる装置
としては、均一な光強度を培養液内の藻細胞に均等に照
射させるための装置であれば足り、例えば培養液内に光
源を投入し、かつ効果的な撹拌を行う簡便な装置から、
水中光合成装置（特願平４−５６２２６）そしてフォト
バイオリアクター（Matsunaga ら Appl. Biochem. Biot
echn. 28/29, 157 (1991))などが挙げられる。
としては、均一な光強度を培養液内の藻細胞に均等に照
射させるための装置であれば足り、例えば培養液内に光
源を投入し、かつ効果的な撹拌を行う簡便な装置から、
水中光合成装置（特願平４−５６２２６）そしてフォト
バイオリアクター（Matsunaga ら Appl. Biochem. Biot
echn. 28/29, 157 (1991))などが挙げられる。
【０００９】上記フォトバイオリアクターの一例の概要
は次のとおりである。アクリル製カラム（７０ｍｍ×９
００ｍｍ）を培養器とし、そこに外径１ｍｍの側面から
光が分散する処理を施した光ファイバーが１ｍｍ間隔で
６６１本挿入してある。ファイバーの両端は結束してあ
る。光源はキセノンランプ（３００Ｗ、ラフォーレエン
ジニアリング社製）を用い、結束した光ファイバーの一
端から光を導入する。ファイバーに入射した光は、ファ
イバー表面から光を放ちながらファイバーの中を通って
行く（Matsunaga T, Takeyama H, Sudo H, Oyama N, Ar
iura S, Takano H, Hirano M, BurgessJG, Sode K, Nak
amura N (1991) Glutamate production from CO2 by ma
rinecya-nobacterium Synechococcus sp. usinga novel
biosolar reactor employing light-diffusing optica
l fibers. ApplBiochem Biotechnol 28/29:157-167）。
ファイバー表面の光強度はキセノンランプの光量を変化
させることによって制御することができる。キセノンラ
ンプ光源装置は電圧によって光量を変化させることが可
能である。培養液へのガス供給は、リアクターの底に取
り付けた２つのノズル（φ２ｍｍ）を用いて、８００ｍ
ｌ／ｍｉｎの速度で行なう。光強度は培養中、一定の範
囲に制御される。一定の範囲とは、偏平フラスコ培養に
おいては、１００〜６００μＥｍ-2ｓ-1の範囲、上記フ
ォトバイオリアクターの場合は、ファイバー表面の光強
度を２〜８μＥｍ-2ｓ-1の範囲で制御することを意味す
る。
は次のとおりである。アクリル製カラム（７０ｍｍ×９
００ｍｍ）を培養器とし、そこに外径１ｍｍの側面から
光が分散する処理を施した光ファイバーが１ｍｍ間隔で
６６１本挿入してある。ファイバーの両端は結束してあ
る。光源はキセノンランプ（３００Ｗ、ラフォーレエン
ジニアリング社製）を用い、結束した光ファイバーの一
端から光を導入する。ファイバーに入射した光は、ファ
イバー表面から光を放ちながらファイバーの中を通って
行く（Matsunaga T, Takeyama H, Sudo H, Oyama N, Ar
iura S, Takano H, Hirano M, BurgessJG, Sode K, Nak
amura N (1991) Glutamate production from CO2 by ma
rinecya-nobacterium Synechococcus sp. usinga novel
biosolar reactor employing light-diffusing optica
l fibers. ApplBiochem Biotechnol 28/29:157-167）。
ファイバー表面の光強度はキセノンランプの光量を変化
させることによって制御することができる。キセノンラ
ンプ光源装置は電圧によって光量を変化させることが可
能である。培養液へのガス供給は、リアクターの底に取
り付けた２つのノズル（φ２ｍｍ）を用いて、８００ｍ
ｌ／ｍｉｎの速度で行なう。光強度は培養中、一定の範
囲に制御される。一定の範囲とは、偏平フラスコ培養に
おいては、１００〜６００μＥｍ-2ｓ-1の範囲、上記フ
ォトバイオリアクターの場合は、ファイバー表面の光強
度を２〜８μＥｍ-2ｓ-1の範囲で制御することを意味す
る。
【００１０】本発明に用いられる藻類培養のための培地
としては、目的の藻類の培養に適するものであれば特に
制限されるものではなく、例えば、Ｅｐｐｌｅｙの培地
（Eppley R Wら、J. Exp. Marine Biology and Ecology
1，191 (1967)）が挙げられる。Ｅｐｐｌｅｙの培地
は、海水９００ｍｌと蒸留水１００ｍｌ中に５０．５ｍ
ｇＫＮＯ3 、８．７ｍｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｍｌの微量
金属混液、１ｍｌのビタミン混液から成る。微量金属混
液の組成は、蒸留水１リットルに１９．６ｍｇＣｕＳＯ
4 ・５Ｈ2 Ｏ、４４．０ｍｇ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、
２０．０ｍｇＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、３６０ｍｇ Ｍｎ
Ｃｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、１２．６ｍｇ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ Ｆｅ−ＥＤＴＡであり、ビタミン混
液の組成は、２００ｍｇチアミン、１ｍｇビオチン、
０．２ｍｇビタミンＢ12である。
としては、目的の藻類の培養に適するものであれば特に
制限されるものではなく、例えば、Ｅｐｐｌｅｙの培地
（Eppley R Wら、J. Exp. Marine Biology and Ecology
1，191 (1967)）が挙げられる。Ｅｐｐｌｅｙの培地
は、海水９００ｍｌと蒸留水１００ｍｌ中に５０．５ｍ
ｇＫＮＯ3 、８．７ｍｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｍｌの微量
金属混液、１ｍｌのビタミン混液から成る。微量金属混
液の組成は、蒸留水１リットルに１９．６ｍｇＣｕＳＯ
4 ・５Ｈ2 Ｏ、４４．０ｍｇ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、
２０．０ｍｇＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、３６０ｍｇ Ｍｎ
Ｃｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、１２．６ｍｇ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ Ｆｅ−ＥＤＴＡであり、ビタミン混
液の組成は、２００ｍｇチアミン、１ｍｇビオチン、
０．２ｍｇビタミンＢ12である。
【００１１】培養は、例えば１．５リットル容の偏平フ
ラスコに１リットルのＥｐｐｌｅｙ培地を入れ、３００
〜６００ｍｌ／ｍｉｎのＣＯ2 ガス通気を行いつつ、一
定の光強度の光照射下、２０〜３０℃で４〜７日間行
う。光強度が通常のフラスコ培養では１００〜６００μ
Ｅｍ-2ｓ-1の範囲、好ましくは１５０〜２５０μＥｍ-2
ｓ-1の範囲に制御するのがよい。光強度が１００μＥｍ
-2ｓ-1未満では、光飽和点に未到達であり、６００μＥ
ｍ-2ｓ-1を越えると細胞に与えるエネルギーが過剰であ
るので好ましくない。但し、フォトバイオリアクターを
使用する場合、光強度は２〜８μＥｍ-2ｓ-1の範囲が好
ましく、３〜５μＥｍ-2ｓ-1が特に好ましい。
ラスコに１リットルのＥｐｐｌｅｙ培地を入れ、３００
〜６００ｍｌ／ｍｉｎのＣＯ2 ガス通気を行いつつ、一
定の光強度の光照射下、２０〜３０℃で４〜７日間行
う。光強度が通常のフラスコ培養では１００〜６００μ
Ｅｍ-2ｓ-1の範囲、好ましくは１５０〜２５０μＥｍ-2
ｓ-1の範囲に制御するのがよい。光強度が１００μＥｍ
-2ｓ-1未満では、光飽和点に未到達であり、６００μＥ
ｍ-2ｓ-1を越えると細胞に与えるエネルギーが過剰であ
るので好ましくない。但し、フォトバイオリアクターを
使用する場合、光強度は２〜８μＥｍ-2ｓ-1の範囲が好
ましく、３〜５μＥｍ-2ｓ-1が特に好ましい。
【００１２】フォトバイオリアクターにより培養する場
合は、前培養した培養液を遠心分離し、得られた細胞を
新鮮培地に再懸濁し、光強度、温度等を制御しつつ培養
を行う。
合は、前培養した培養液を遠心分離し、得られた細胞を
新鮮培地に再懸濁し、光強度、温度等を制御しつつ培養
を行う。
【００１３】本発明で得られる藻体中のＤＨＡの含量の
測定は常法に従い以下のように行う。まず対数増殖期の
後期の細胞を６０００Ｇで１０分間遠心分離し、ｐＨ９
のホウ酸緩衝液で洗浄し、凍結乾燥してＤＨＡの分析に
供する。１０ｍｇの乾燥藻体に、２ｍｌの５％塩酸−メ
タノールを加え３時間加熱し、藻体中の脂肪酸を直接メ
チル化する（Hirano M, Miura Y, Matsunaga N, Nakamu
ra N, matsunaga T (1990) Gamma Linole-nic acid pro
duction by microalgae.Appl Biochem Biotechnol 24/2
5:183-191、Kates M (1964) Simplified procedures fo
r hydorolysis or methanolysis of lipids. J Lipid R
es 5:132-135)。メチル化後、ｎ−ヘキサンで脂肪酸メ
チルエステルを抽出し、ＧＣ−ＦＩＤで脂肪酸分析を行
なう。装置はＨｉｔａｃｈｉ−１６３（日立製作所製）
を用い、カラムはＤＥＧＳ（φ３ｍｍ×２ｍ）を用い、
１９０℃の定温条件で行なう。脂肪酸含量は、内部標準
法により決定する。ＤＨＡの同定は、ＧＣ−ＭＳ（Ｃ
Ｉ）で行なう。ＧＣＭＳ−ＱＰ１０００（島津製作所
製）を用い、カラムはＣＰ−Ｓｉｌ ８８（５０ｍ×
０．２２ｍｍＩＤ、ｄｆ＝０．２μｍ、ＣＨＲＯＭＰＡ
ＣＫ製）、１００℃（２ｍｉｎ）→＜５ｍｉｎ＞→２４
０℃の昇温条件で行なう。標準物質のリテンションタイ
ムおよびフラグメンテーションとの比較により、ＤＨＡ
の同定を行なう。
測定は常法に従い以下のように行う。まず対数増殖期の
後期の細胞を６０００Ｇで１０分間遠心分離し、ｐＨ９
のホウ酸緩衝液で洗浄し、凍結乾燥してＤＨＡの分析に
供する。１０ｍｇの乾燥藻体に、２ｍｌの５％塩酸−メ
タノールを加え３時間加熱し、藻体中の脂肪酸を直接メ
チル化する（Hirano M, Miura Y, Matsunaga N, Nakamu
ra N, matsunaga T (1990) Gamma Linole-nic acid pro
duction by microalgae.Appl Biochem Biotechnol 24/2
5:183-191、Kates M (1964) Simplified procedures fo
r hydorolysis or methanolysis of lipids. J Lipid R
es 5:132-135)。メチル化後、ｎ−ヘキサンで脂肪酸メ
チルエステルを抽出し、ＧＣ−ＦＩＤで脂肪酸分析を行
なう。装置はＨｉｔａｃｈｉ−１６３（日立製作所製）
を用い、カラムはＤＥＧＳ（φ３ｍｍ×２ｍ）を用い、
１９０℃の定温条件で行なう。脂肪酸含量は、内部標準
法により決定する。ＤＨＡの同定は、ＧＣ−ＭＳ（Ｃ
Ｉ）で行なう。ＧＣＭＳ−ＱＰ１０００（島津製作所
製）を用い、カラムはＣＰ−Ｓｉｌ ８８（５０ｍ×
０．２２ｍｍＩＤ、ｄｆ＝０．２μｍ、ＣＨＲＯＭＰＡ
ＣＫ製）、１００℃（２ｍｉｎ）→＜５ｍｉｎ＞→２４
０℃の昇温条件で行なう。標準物質のリテンションタイ
ムおよびフラグメンテーションとの比較により、ＤＨＡ
の同定を行なう。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。 実施例１ ＤＨＡ生産微細藻類のスクリーニング 海洋微細藻類の脂質、脂肪酸に関しては多くの報告があ
る。しかし、ＤＨＡの生産に関する報告はなかった。そ
こで、比較的高度不飽和脂肪酸含量が高く、ＤＨＡ生成
が確認されている微細藻類を収集し、藻体中のＤＨＡ含
有量についてスクリーニングを行なった。これを表１に
示す。スクリーニングを行なった８株のうち、藻体中の
ＤＨＡ含量はハプト藻Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂ
ａｎａ ＵＴＥＸ ＬＢ２３０７が最も高かった。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。 実施例１ ＤＨＡ生産微細藻類のスクリーニング 海洋微細藻類の脂質、脂肪酸に関しては多くの報告があ
る。しかし、ＤＨＡの生産に関する報告はなかった。そ
こで、比較的高度不飽和脂肪酸含量が高く、ＤＨＡ生成
が確認されている微細藻類を収集し、藻体中のＤＨＡ含
有量についてスクリーニングを行なった。これを表１に
示す。スクリーニングを行なった８株のうち、藻体中の
ＤＨＡ含量はハプト藻Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂ
ａｎａ ＵＴＥＸ ＬＢ２３０７が最も高かった。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例２ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ ＵＴＥＸ Ｌ
Ｂ２３０７細胞の脂肪酸組成 ＧＣ−ＦＩＤ分析の結果、Ｉ．ｇａｌｂａｎａ ＵＴＥ
Ｘ ＬＢ２３０７の脂肪酸は、Ｃ16:0が１０〜１５％、
Ｃ18:1が２０％、Ｃ18:4が１５〜２０％、Ｃ22:6が１０
％であり、Ｃ20:5が０．５％であった。Ｃ22:6のピーク
がＤＨＡであることを確認するために、ＧＣ−ＭＳ（Ｃ
Ｉ）分析を行なった。また、Ｉ．ｇａｌｂａｎａの脂肪
酸メチルエステル（図１中の（Ａ））についてトータル
イオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）を行った結果を図
１に示した。比較として、ＤＨＡ標準試料（ＤＨＡメチ
ルエステル：図１中の（Ｂ））のＴＩＣを示した。標準
試料のＤＨＡメチルエステルと同じリテンションタイム
のピーク１（図１）が確認された。さらに、ピーク１の
フラグメンテーションと標準試料のフラグメンテーショ
ンとの比較、およびコンピュータデータベースによるラ
イブラリーサーチからピーク１はＤＨＡメチルエステル
であることが確認された。
Ｂ２３０７細胞の脂肪酸組成 ＧＣ−ＦＩＤ分析の結果、Ｉ．ｇａｌｂａｎａ ＵＴＥ
Ｘ ＬＢ２３０７の脂肪酸は、Ｃ16:0が１０〜１５％、
Ｃ18:1が２０％、Ｃ18:4が１５〜２０％、Ｃ22:6が１０
％であり、Ｃ20:5が０．５％であった。Ｃ22:6のピーク
がＤＨＡであることを確認するために、ＧＣ−ＭＳ（Ｃ
Ｉ）分析を行なった。また、Ｉ．ｇａｌｂａｎａの脂肪
酸メチルエステル（図１中の（Ａ））についてトータル
イオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）を行った結果を図
１に示した。比較として、ＤＨＡ標準試料（ＤＨＡメチ
ルエステル：図１中の（Ｂ））のＴＩＣを示した。標準
試料のＤＨＡメチルエステルと同じリテンションタイム
のピーク１（図１）が確認された。さらに、ピーク１の
フラグメンテーションと標準試料のフラグメンテーショ
ンとの比較、およびコンピュータデータベースによるラ
イブラリーサーチからピーク１はＤＨＡメチルエステル
であることが確認された。
【００１７】実施例３ Ｉ．ｇａｌｂａｎａの生育およびＤＨＡ生成に対する照
射光強度の影響について調べた。Ｅｐｐｌｅｙ培地を用
いた偏平フラスコ培養を行い、照射光強度を１０〜３０
０μＥｍ-2ｓ-1の間で変化させたとき、３００μＥｍ-2
ｓ-1で生育が最大となり、一方、藻体当たりのＤＨＡ含
量は２００μＥｍ-2ｓ-1で最大となった。次にＩ．ｇａ
ｌｂａｎａのＤＨＡ生成に対する温度の影響を調べた。
Ｅｐｐｌｅｙ培地を用いた偏平フラスコ培養において照
射光強度を１５０μＥｍ-2ｓ-1に保ち、培養温度を１５
〜３０℃の間で変化させたとき、２０℃で得られたＤＨ
Ａ含量は最大となった。なお、得られたＩ．ｇａｌｂａ
ｎａ藻体を暗条件で処理したところ、通常の処理条件下
で得られたＤＨＡ含量の１．２倍の含量が観察された。
また藻体処理を１５℃の低温で行ったところ、ＤＨＡ含
量は室温処理の１．１倍であった。これらの事実は、藻
体からのＤＨＡの単離精製には暗条件処理、低温処理が
有利であることを示す。
射光強度の影響について調べた。Ｅｐｐｌｅｙ培地を用
いた偏平フラスコ培養を行い、照射光強度を１０〜３０
０μＥｍ-2ｓ-1の間で変化させたとき、３００μＥｍ-2
ｓ-1で生育が最大となり、一方、藻体当たりのＤＨＡ含
量は２００μＥｍ-2ｓ-1で最大となった。次にＩ．ｇａ
ｌｂａｎａのＤＨＡ生成に対する温度の影響を調べた。
Ｅｐｐｌｅｙ培地を用いた偏平フラスコ培養において照
射光強度を１５０μＥｍ-2ｓ-1に保ち、培養温度を１５
〜３０℃の間で変化させたとき、２０℃で得られたＤＨ
Ａ含量は最大となった。なお、得られたＩ．ｇａｌｂａ
ｎａ藻体を暗条件で処理したところ、通常の処理条件下
で得られたＤＨＡ含量の１．２倍の含量が観察された。
また藻体処理を１５℃の低温で行ったところ、ＤＨＡ含
量は室温処理の１．１倍であった。これらの事実は、藻
体からのＤＨＡの単離精製には暗条件処理、低温処理が
有利であることを示す。
【００１８】実施例４ ＤＨＡ生産に対する温度の影響 初期藻体濃度０．０４ｇ／リットル、光強度１００μＥ
ｍ-2ｓ-1で、培養温度を１０℃から３５℃の範囲でＥｐ
ｐｌｅｙ培地を用いた偏平フラスコ培養を行い、イソク
リシス・ガルバナ（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）ＵＴＥＸ Ｌ
Ｂ２３０７の藻体増殖量（図２）および藻体中のＤＨＡ
含量（図３）を比較した。２５℃のとき藻体増殖量は最
大となり、４日間の培養で０．９ｇ／リットルの藻体が
得られることが確認された。３０℃においても０．７ｇ
／リットルと、比較的高い増殖量を確認した。また、藻
体中のＤＨＡ含量は、図３に示すように培養温度１７℃
で最大となり、１５ｍｇ／ｇ乾燥藻体であった。藻体増
殖量が最大となった２５℃では、ＤＨＡ含量は１３ｍｇ
／ｇ乾燥藻体であった。従って、培養液１リットル当り
のＤＨＡ生産量は、１０℃で１ｍｇ、１７℃で３．８ｍ
ｇ、２０℃で６．６ｍｇ、２５℃で１１．３ｍｇ、３０
℃で６．９ｍｇ、３５℃で１．９ｍｇとなり、２０℃か
ら３０℃の範囲内がＤＨＡの生産に好ましいことが明ら
かである。
ｍ-2ｓ-1で、培養温度を１０℃から３５℃の範囲でＥｐ
ｐｌｅｙ培地を用いた偏平フラスコ培養を行い、イソク
リシス・ガルバナ（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）ＵＴＥＸ Ｌ
Ｂ２３０７の藻体増殖量（図２）および藻体中のＤＨＡ
含量（図３）を比較した。２５℃のとき藻体増殖量は最
大となり、４日間の培養で０．９ｇ／リットルの藻体が
得られることが確認された。３０℃においても０．７ｇ
／リットルと、比較的高い増殖量を確認した。また、藻
体中のＤＨＡ含量は、図３に示すように培養温度１７℃
で最大となり、１５ｍｇ／ｇ乾燥藻体であった。藻体増
殖量が最大となった２５℃では、ＤＨＡ含量は１３ｍｇ
／ｇ乾燥藻体であった。従って、培養液１リットル当り
のＤＨＡ生産量は、１０℃で１ｍｇ、１７℃で３．８ｍ
ｇ、２０℃で６．６ｍｇ、２５℃で１１．３ｍｇ、３０
℃で６．９ｍｇ、３５℃で１．９ｍｇとなり、２０℃か
ら３０℃の範囲内がＤＨＡの生産に好ましいことが明ら
かである。
【００１９】実施例５ フォトバイオリアクターによるＤＨＡ生産 実験に用いたフォトバイオリアクターは、培養液内の光
環境を最適化することが可能である。このフォトバイオ
リアクターを用いることによって、海洋藍藻を１０ｇ／
リットル以上の高密度まで培養できることが確認されて
いる（Ｔａｋａｎｏ，１９９２）。このフォトバイオリ
アクターを用いて、Ｉ．ｇａｌｂａｎａによるＤＨＡ生
産量の増大を試みた。藻体増殖量に対する光強度の影響
を調べた（図４）。即ち、初期藻体濃度は０．７２ｇ／
リットルで、Ｅｐｐｌｅｙ培地を用いて１日培養を行っ
た。その結果、リアクター内に挿入した６６１本の光フ
ァイバー表面の光強度が４．５μＥｍ-2ｓ-1のとき、１
日あたりの藻体増殖量は０．３６ｇ／リットルと最大と
なった。これは今までの培養法によるＩｓｏｃｈｒｙｓ
ｉｓ ｇａｌｂａｎａ Ｐａｒｋｅで報告されている値
（Molina Grima E, Sanchez Perez J A; Garcia Sanche
z J L; Garcia Camacho F, Lopez Alonso D (1992) EPA
from Isochrysis galbana. Growth Conditions and Pr
oductivity. Process Biochemistry 27:299-305)の約３
倍である。藻体中のＤＨＡ含量は、図５に示すようにフ
ァイバー表面の光強度３．４μＥｍ-2ｓ-1のとき１５．
７ｍｇ／ｇ乾燥藻体と最大になった。ＤＨＡ含量は３．
４μＥｍ-2ｓ-1を超える光強度で、光強度の増大ととも
に減少した。藻体増殖値および藻体中のＤＨＡ含量から
１日あたりのＤＨＡ生産量を算出した。ファイバー表面
の光強度４．５μＥｍ-2ｓ-1のとき、ＤＨＡ生産量は最
大となり、フォトバイオリアクターでのＤＨＡ生産量は
１日あたり４．３ｍｇ／リットルであった。この値はこ
れまで報告された値の約２倍である（Molina Grima E,
Sanchez Perez J A; Garcia Sanchez J L; Garcia Cama
cho F, Lopez AlonsoD (1992) EPA from Isochrysis ga
lbana. Growth Conditions and Productivity. Process
Biochemistry 27:299-305)。
環境を最適化することが可能である。このフォトバイオ
リアクターを用いることによって、海洋藍藻を１０ｇ／
リットル以上の高密度まで培養できることが確認されて
いる（Ｔａｋａｎｏ，１９９２）。このフォトバイオリ
アクターを用いて、Ｉ．ｇａｌｂａｎａによるＤＨＡ生
産量の増大を試みた。藻体増殖量に対する光強度の影響
を調べた（図４）。即ち、初期藻体濃度は０．７２ｇ／
リットルで、Ｅｐｐｌｅｙ培地を用いて１日培養を行っ
た。その結果、リアクター内に挿入した６６１本の光フ
ァイバー表面の光強度が４．５μＥｍ-2ｓ-1のとき、１
日あたりの藻体増殖量は０．３６ｇ／リットルと最大と
なった。これは今までの培養法によるＩｓｏｃｈｒｙｓ
ｉｓ ｇａｌｂａｎａ Ｐａｒｋｅで報告されている値
（Molina Grima E, Sanchez Perez J A; Garcia Sanche
z J L; Garcia Camacho F, Lopez Alonso D (1992) EPA
from Isochrysis galbana. Growth Conditions and Pr
oductivity. Process Biochemistry 27:299-305)の約３
倍である。藻体中のＤＨＡ含量は、図５に示すようにフ
ァイバー表面の光強度３．４μＥｍ-2ｓ-1のとき１５．
７ｍｇ／ｇ乾燥藻体と最大になった。ＤＨＡ含量は３．
４μＥｍ-2ｓ-1を超える光強度で、光強度の増大ととも
に減少した。藻体増殖値および藻体中のＤＨＡ含量から
１日あたりのＤＨＡ生産量を算出した。ファイバー表面
の光強度４．５μＥｍ-2ｓ-1のとき、ＤＨＡ生産量は最
大となり、フォトバイオリアクターでのＤＨＡ生産量は
１日あたり４．３ｍｇ／リットルであった。この値はこ
れまで報告された値の約２倍である（Molina Grima E,
Sanchez Perez J A; Garcia Sanchez J L; Garcia Cama
cho F, Lopez AlonsoD (1992) EPA from Isochrysis ga
lbana. Growth Conditions and Productivity. Process
Biochemistry 27:299-305)。
【００２０】実施例６ 実施例１で用いた各種藻類について、実施例４でイソク
リシス・ガルバナについて得られた最適条件下、すなわ
ちファイバー表面の光強度４．６μＥｍ-2ｓ-1、培養温
度２５℃でＤＨＡの生産を行ったところ表２に示す結果
が得られた。本発明方法によれば、従来までＤＨＡの微
量生産しか知られていなかった藻類についても相当量の
ＤＨＡ産生が確認された。
リシス・ガルバナについて得られた最適条件下、すなわ
ちファイバー表面の光強度４．６μＥｍ-2ｓ-1、培養温
度２５℃でＤＨＡの生産を行ったところ表２に示す結果
が得られた。本発明方法によれば、従来までＤＨＡの微
量生産しか知られていなかった藻類についても相当量の
ＤＨＡ産生が確認された。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【発明の効果】本発明の方法により、Ｉｓｏｃｈｒｙｓ
ｉｓ ｇａｌｂａｎａをはじめとするＤＨＡ生産性海洋
微細藻類の培養によるＤＨＡの生産を、高い効率で行う
ことが可能となる。
ｉｓ ｇａｌｂａｎａをはじめとするＤＨＡ生産性海洋
微細藻類の培養によるＤＨＡの生産を、高い効率で行う
ことが可能となる。
【図１】図１は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎ
ａの脂肪酸メチルエステル（Ａ）およびＤＨＡメチルエ
ステル（Ｂ）のトータルイオンクロマトグラフィーであ
る。
ａの脂肪酸メチルエステル（Ａ）およびＤＨＡメチルエ
ステル（Ｂ）のトータルイオンクロマトグラフィーであ
る。
【図２】図２は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎ
ａの藻体増殖量に対する培養温度の影響を示した図であ
る。
ａの藻体増殖量に対する培養温度の影響を示した図であ
る。
【図３】図３は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎ
ａ中のＤＨＡ含量及び単位培養量当たりの総ＤＨＡ含量
に対する培養温度の影響を示した図である。
ａ中のＤＨＡ含量及び単位培養量当たりの総ＤＨＡ含量
に対する培養温度の影響を示した図である。
【図４】図４は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎ
ａの藻体増殖量に対する光強度の影響を示した図であ
る。
ａの藻体増殖量に対する光強度の影響を示した図であ
る。
【図５】図５は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎ
ａ中のＤＨＡ含量及び単位培養量当たりの総ＤＨＡ含量
に対する光強度の影響を示した図である。
ａ中のＤＨＡ含量及び単位培養量当たりの総ＤＨＡ含量
に対する光強度の影響を示した図である。
フロントページの続き (72)発明者 軒原 清史 京都市右京区太秦多薮町14−５ サンベー ル太秦629 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２−41−13 府中第三住 宅２−304
Claims (1)
- 【請求項１】 ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産性海
洋微細藻類によるＤＨＡの生産において、培養液内の光
強度を均一に分散させる装置を用い、かつその光強度を
一定の範囲に制御することを特徴とするＤＨＡの生産方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5034636A JPH06225778A (ja) | 1993-01-30 | 1993-01-30 | 海洋微細藻類によるドコサヘキサエン酸の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5034636A JPH06225778A (ja) | 1993-01-30 | 1993-01-30 | 海洋微細藻類によるドコサヘキサエン酸の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225778A true JPH06225778A (ja) | 1994-08-16 |
Family
ID=12419903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5034636A Pending JPH06225778A (ja) | 1993-01-30 | 1993-01-30 | 海洋微細藻類によるドコサヘキサエン酸の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06225778A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2088366A1 (es) * | 1995-01-13 | 1996-08-01 | Univ Almeria | Microalga marina y su empleo en acuicultura y en la obtencion de acidos grasos poliinsaturados. |
| JP2008182962A (ja) * | 2007-01-30 | 2008-08-14 | Nikken Sohonsha Corp | イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法 |
| WO2009130895A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | 日本水産株式会社 | フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類 |
| US9518248B2 (en) | 2010-11-15 | 2016-12-13 | Cornell University | Optofluidic photobioreactor apparatus, method, and applications |
| US20190345427A1 (en) * | 2017-01-22 | 2019-11-14 | Algaennovation Ltd. | System and method for growing algae |
-
1993
- 1993-01-30 JP JP5034636A patent/JPH06225778A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2088366A1 (es) * | 1995-01-13 | 1996-08-01 | Univ Almeria | Microalga marina y su empleo en acuicultura y en la obtencion de acidos grasos poliinsaturados. |
| JP2008182962A (ja) * | 2007-01-30 | 2008-08-14 | Nikken Sohonsha Corp | イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法 |
| WO2009130895A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | 日本水産株式会社 | フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類 |
| JPWO2009130895A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2011-08-11 | 日本水産株式会社 | フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類 |
| US9518248B2 (en) | 2010-11-15 | 2016-12-13 | Cornell University | Optofluidic photobioreactor apparatus, method, and applications |
| US11186812B2 (en) | 2010-11-15 | 2021-11-30 | Cornell University | Optofluidic photobioreactor apparatus, method, and applications |
| US20190345427A1 (en) * | 2017-01-22 | 2019-11-14 | Algaennovation Ltd. | System and method for growing algae |
| US11912966B2 (en) * | 2017-01-22 | 2024-02-27 | Vaxa Technologies Ltd | System and method for growing algae |
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