CN104894034B - 一种海洋来源小单孢菌scsio 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用。海洋来源小单孢菌SCSIO 01819于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M 9737。本发明利用海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819生产具有脂肪酶活性和蛋白酶活性的酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周期；还可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，可以定向转化粗蛋白产生具有提高水产动物幼苗存活率和增重率功能的肽类，酶制剂为催化剂制备的鱿鱼内脏水解蛋白中，分子量1000‑10000Da的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物，并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种利用海洋微生物生产脂肪酶制剂并利用其进行珍珠加工及制备鱿鱼内脏水解蛋白的技术，具体涉及一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，由于养殖环境等条件的变化，我国海水珍珠只有极少数呈现银白色，品质明显下降，养殖效益降低。漂白和染色是提升珍珠品质的有效加工手段，可创造良好经济效益。日本于1922年首次报道了珍珠加工的技术，至今仍保持国际领先的地位(张偲,肖志会et al.2009)。我国于20世纪70年代就开始了珍珠加工的研究工作，对漂白机理、漂白剂、漂白工艺、染料等进行了深入研究，并开发了一些珍珠加工的方法，但在实际应用中还未达到理想效果。20世纪90年代，我国引进了日本的低温珍珠加工技术，应用后取得良好效果。但是日本技术的前处理工艺、漂白剂、染色剂成分等内容仍然保密，我国珍珠产业未掌握珍珠精深加工的核心技术，行业发展受到制约(沈海光，曾生1996；童银洪,邓陈茂et al.2010)。中国科学院南海海洋研究所经过十余年的研发工作，成功开发了海洋微生物酶介导的珍珠漂白和染色技术，利用海洋微生物酶定向改造珍珠层内的杂蛋白，并介导活性染料进入珍珠层深层，加工效果达到或超过了日本技术的平(张偲,龙丽娟et al.2008)。
珍珠层含有少量长链饱和脂肪酸、脂肪酸甘油酯、甾醇等物质。这些脂溶性成分导致了珍珠层的强疏水性，堵塞亚分子通道，不利于漂白和染色剂到达有效作用部位。传统的前处理方法中，通过用有机溶剂、碱液浸泡和皂煮等方法进行脱脂(张小丽1997)。因珍珠层由六边形霰石结晶与角蛋白堆积形成，结构致密，传统脱脂方法中碱性溶液和有机溶剂不能充分和脂类接触，效果未能达到最佳。
鱿鱼内脏的深入开发利用具有经济和环保意义。随着我国海洋捕捞业的迅速发展，鱿鱼已成为我国重要的水产加工原料之一。鱿鱼加工处理过程中，一般有15％左右的内脏废弃物产生。这些废弃物含有丰富的蛋白质，但极易腐烂变质，难以储存。常见的处理方式为提取鱿鱼油后掩埋，近期也有对鱿鱼内脏进行初级加工制成鱿鱼溶浆直接用作鱼类饲料的报道，但是未经精深加工，这种饲料生物利用率不高，还会导致水体环境的富营养化，增加养殖动物病害爆发的机会，同时也难以长期保存。因而传统处理方式不仅经济效益低，造成资源浪费，还会引起环境污染。因此，研究开发鱿鱼内脏的精深加工技术，对于发掘鱿鱼废弃物的经济价值，降低环境污染，有重要意义(王龙，2006)。
将大分子粗蛋白酶解成小肽后用作海水养殖饲料的功能蛋白源，是鱿鱼内脏深度开发利用的有效方式。蛋白质是动物最重要的营养物质之一。对于海水养殖动物而言，饲料中的蛋白质不仅用于组织合成，还是重要的供能物质，蛋白的需求量远高于陆生动物。提高水生动物对蛋白质的利用率，是促进动物营养吸收的有力措施。在饲料中使用酶解蛋白替代粗蛋白，不仅可以降低饲料系数，还具有促进矿物质吸收、提高免疫力和降低幼苗畸形率等功效。因此，使用生物酶技术将鱿鱼粗蛋白水解转化为水产动物更易吸收、同时具备一定生理功能的蛋白源是一种有效的高值化利用方式。
鱿鱼内脏的酶解方法研究已经引起广泛重视。薛长湖、刘春娥等研究了酶的种类、用量、反应温度、反应时间等因素对鱿鱼内脏粗蛋白转化率的影响(刘春娥，2004)；酶解鱿鱼内脏还可生产海味素(苏鹤声，1996)。已报道的鱿鱼内脏酶解方法中,采用的酶的种类有胰蛋白 酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及这些酶的混合物。张偲等发明了这一种海洋微生物酶酶解制备鱿鱼小肽的方法，在酶解过程中利用海洋微生物生产的酶制剂，破坏对肽链水解位点有保护作用的鱿鱼蛋白的糖基侧链，可以使鱿鱼内脏蛋白在更温和条件下水解成肽类，减少过度水解，具有很高的功能肽得率(张偲，2011)。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种海洋来源的小单胞菌(Micromonosporachalcea)SCSIO01819，该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M 9737。
本发明所述的海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819，是从我国南海北部(E 116°17.754′，N 118°53.719′)水深30米的海底沉积物中分离获得的。常规PCR扩增Micromonospora chalcea SCSIO 01819的16S rDNA并测序并提交到GenBank中，得到序列号KR052241。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该菌株与M.chalcea的相似度为99.4％，说明该菌株SCSIO 01819为小单孢菌属(如图1所示)。邻接法表明该菌株与一组小单孢菌属物种的系统进化关系，证明该菌属于小单孢菌属的一种。
形态学特征和生理生化分析：
该菌属于革兰氏阳性，好氧放线菌，孢子球状表面光滑。菌落圆形直径1.3-2.0mm，突起成丘。无可溶性色素产生。生长初期红色至深红色，成熟及后期变棕色和黑褐色。能水解淀粉、纤维素、吐温20，40，60，牛奶凝固和胴化，硝酸盐还原反应阳性；H2S产生，吐温80水解阴性。明胶液化、接触酶和氧化酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利用D-纤维二糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-麦芽糖，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核糖， D-蔗糖，D-乳糖，D-山梨糖和和果糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-木糖，松三糖、D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6.0-9.0，0-5％和10-45℃，最适生长温度25-30度，pH7-8，3％盐浓度。细胞壁含有meso-DAP。优势醌为MK-10(H2)。G+C摩尔含量为68.0(±0.5)％。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与已知最接近的菌株Micromonosporachalcea DSM 43026T较为相似，且16S rRNA基因序列相似性达到99.4％；因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为小单孢菌属Micromonospora chalcea的一个菌株SCSIO 01819。该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M 9737，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819能够发酵生产具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液，该酶制剂溶液可用于珍珠加工和制备鱿鱼内脏水解蛋白。因此，本发明的第二个目的是提供海洋来源的小单胞菌(Micromonosporachalcea)SCSIO01819在制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，是通过以下方法制备的：
将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在28～37℃下培养12～48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容器中，在pH＝7.5～8.0、温度28～37℃下培养12～96小时，当发酵液脂肪酶活力达到1000～3000u/mL，蛋白酶活力达到1500～3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO 01819酶制剂溶液-1。
所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，是通过以下方法制备的：
将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在28～37℃下培养12～48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容器中，在pH＝7.5～8.0、温度28～37℃下培养12～96小时，蛋白酶活力达到2500～3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO 01819酶制剂溶液-2。
所述的活化培养基，优选，每1L培养基的配方为：酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
在脂肪酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优选，每1L培养基的配方为：玉米粉2.0～4.0g，大豆粉0.5～2.0g，马氏珍珠贝软体部的石油醚浸提物1.0～1.5g，蔗糖0.5～2.0g，30～50％陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100～300KDa。所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸泡提取后，取提取液减压蒸干所得的残留物。
在具有蛋白酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优选，每1L培养基的配方为：玉米粉2.0～4.0g，大豆粉0.5～2.0g，脱脂鱿鱼内脏浆2.0～4.0g，蔗糖0.5～2.0g，30～50％陈海水1L。超滤膜的截流分子量为100-300KDa。所述的脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油醚或正己烷萃取三次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1适宜作用pH范围在7.5～13，最适pH为10，适宜作用温度范围为28～37℃，最适作用温度为35℃。所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2适宜作用pH范围在7.5～13，最适pH为10，适宜作用温度范围为28～37℃，最适作用温度为35℃。
本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-1可用于珍珠加工，可以使珍珠层蛋白结构变松散，促使酶制剂浸入珍珠层深层。气相色谱和质谱联用分析表明，珍珠层的脂类成分中大部分为中性脂，主要以甘油三脂肪酸酯的形似存在。本发明中，珍珠层中性脂可在SCSIO01819酶制剂溶液-1作用下水解为甘油和极性脂(游离脂肪酸)，与原有极性脂一起被溶解于碱性溶液，从而被洗脱，达到脱除珍珠层脂类的目的。与有机溶剂浸泡、皂煮精炼等传统方法比较，本发明的方法可以更彻底地脱除中性脂，珍珠层总脂类的脱除率大幅提升，珍珠层的渗透性增大，使漂白和染色试剂更容易到达粘结片状霰石结构的杂色角蛋白，显著缩短加工周期，在珍珠层被破坏(麻点)出现前完成漂白，提升精深加工成品珠质量，提高漂白的成品率。
因此，本发明的第四个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除中的应用。
所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将珍珠原珠与SCSIO 01819酶制剂溶液-1以珠-液比2～5：1比例(m:v)混合，调节pH值到8.5～13.0，温度28～37℃，浸泡脱脂12～24小时，将珍珠从SCSIO 01819酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体；
(2)、将步骤(1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为2～3：1(m/v)，0.5～2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和残留酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
使用上述方法处理后珍珠脂类脱除率为76.9％～82.3％。
本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-2可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，定向水解粗蛋白 产生具有水产动物保健功能的肽类。以SCSIO 01819酶制剂为催化剂制备的鱿鱼内脏水解蛋白中，分子量1000～10000Da的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物，并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。
因此，本发明的第五个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应用。
所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO 01819酶制剂溶液-2按体积比1～5:1(v：v)混合进行酶解，反应的起始pH值为7.0～13.0，温度为40～50℃，时间10～20小时，酶解物经静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死亡率的水解鱿鱼内脏蛋白。
本发明利用海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819生产具有脂肪酶活性和蛋白酶活性的脂肪酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周期；还可用于制备水解鱿鱼内脏蛋白，水解鱿鱼加工下脚料制备功能肽类。
本发明的海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M 9737，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明：
图1是海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819的系统发育树；
图2是珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图；
图3是珍珠层脂类甲酯化后GC-MS分析。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例中的海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M 9737。珍珠原珠为海水养殖污斑珠(直径为3-5mm)。原珠和马氏珍珠贝软体部由广州市祺福珍珠加工有限公司提供，产于广东省湛江市。酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖为恒新生物技术有限公司产；玉米粉、大豆粉、蔗糖购自超市；陈海水采自海南三亚鹿回头；超滤膜包为颇尔OA300C12和OA100C12(Pall，美国，截留分子量分别为300KDa和100KDa)；用于成分分析的氯仿、甲醇、正己烷购自默克公司(Merck，德国)，无水乙醇购自、石油醚购自广州化学试剂厂，酪蛋白、聚乙烯醇(聚合度1750±50)购自大博试剂公司，橄榄油购自百灵威科技有限公司，纯水为密理博RiOs5纯水机制备。其余有机试剂购于天津百世试剂公司，无机试剂购于广州化学试剂厂。
实验方法：
1、脂肪酶活测定：按国家标准《脂肪酶制剂-GB/T 23535-2009》中的方法测定。
2、蛋白酶活力测定方法：按中华人民共和国专业标准《蛋白酶活力测定法SB/T10317-1999》方法测定。
3、水解蛋白中肽类分子量分布参照国家标准《大豆肽粉-GB/T 22392-2008》中的方法测定。
4、珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法
取待测珍珠，剥离珍珠层，用玛瑙研钵研磨，得珍珠初碎粉。参照Marthe Roussea等人的方法(Comparative Biochemistry and Physiology,Part B 145(2006)1–9)，称取珍珠初碎粉30g，磨碎后加入500mL甲醇，同时剧烈搅拌，然后小心破碎所有块状物，室温下静置混合物半小时，间歇搅拌。将甲醇1/2体积的氯仿搅拌加入，使用分散机(IKADisperser T 10)匀浆20分钟后，离心沉淀固态残渣，上清液移入圆底烧瓶中。残渣移回烧杯，并且重新以同样的步骤再提取两次。合并萃取液，真空下蒸干为浸膏(脂肪-蛋白混合物)，重新用10倍体积的氯仿被萃取该浸膏3次，萃取液合并后用氯仿脱脂的2号滤纸过滤至分液漏斗。向滤液中加入甲醇和0.1mol/mL的氯化钾溶液，使氯仿、甲醇、氯化钾溶液的最终比例为10：5：3。在震荡并4摄氏度或更低温度下储存后，随后让混合液回暖到室温。混合液清晰分层后回收氯仿层，40℃减压蒸干，移至安瓿瓶，40℃下烘干恒重后精确称量重量，即珍珠层总脂类重量。
珍珠层中总脂、中性脂和极性脂含量用下面公式计算:
总脂(％)＝(A-B)/mˉ100％
式中：A－恒重后装有珍珠粉中提取出的总脂容器的质量(g)；
B－容器质量(g)；
m－脱脂前珍珠粉样品质量(g)。
将总脂加入硅胶柱(200-300目)，用石油醚/乙醚(9:1，v/v)和石油醚/乙醚/乙酸(7:3:0.2，v/v)依次各洗脱10个柱体积，分别收集两个溶剂系统的洗脱液，40℃减压蒸馏除去溶剂，得中性脂(石油醚/乙醚洗脱部分)和极性脂(石油醚/乙醚/乙酸洗脱部分)，移至安瓿瓶， 40℃下烘干恒重后精确称量重量，用于计算珍珠层中的中性和极性脂类含量。
极性脂类(％)＝(A极性-B)/mˉ100％
中性脂类(％)＝(A中性-B)/mˉ100％
式中：A极性和A中性－分别为恒重后装有极性和中性脂类提取物容器质量(g)；B－容器质量(g)；m－脱脂前珍珠粉样品质量(g)。
实施例1：珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定
按照实验方法“珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法”部分，取原珠1000g测量其总脂及其中中性脂脂和极性脂的含量，重复3次。珍珠层总脂含量为0.49±0.05％，中性脂0.33±0.03％，极性脂0.11±0.02％。以上结果表明，珍珠层脂类成分以游离脂肪酸和甘油三脂肪酸酯为主，甘油三脂肪酸脂含量高于游离脂肪酸。
取珍珠总脂，以及甲酯化的总脂进行气象色谱和质谱联用分析。甲酯化反应参照《中华人民共和国国家标准》GB/T 2154-2008/ISO/TS 17764:2002的方法，进行，具体方法如下。
准确称量5-7mg脂类样品至反应瓶，加入正己烷1mL，再加入5mg无水硫酸钠，震荡溶解试样。加入100uL甲醇化钾溶液，密封反应瓶，用震荡器剧烈振摇3分钟，仔细取出含脂肪酸甲酯上层液，用于GC/MS分析。
色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.53mm×0.25μm)，进样口温度：280℃，分流比：30:1，载气为：氦气，流速：1ml/min。柱温从50℃开始，保持1min后，以5℃/min的速度升温至280℃。
质谱条件：
GC-MS接口温度：280℃，轰击源为：电子轰击源，电子能量：70eV，离子源温度： 200℃，扫描范围：45～1000amu。
珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图如图2所示。色谱图中主要有21个峰，通过NIST数据系统检索(NIST MASS SPECTRA DATABASE)鉴定了其中17个化合物，其名称与面积归一化法计算所得相对含量如表1所示。
表1.珍珠层脂类成分分析
甲酯化的珍珠层脂类GC-MS分析分析结果见附图3和表2所示。GC-MS图谱主要显示了8个脂肪酸甲酯类化合物的色谱峰。通过NIST数据系统检索(NIST MASS SPECTRADATABASE)鉴定了它们的结构，其名称与面积归一化法计算所得相对含量见表2。
表2.甲酯化的珍珠层脂类成分分析
GC/MS分析结果表明，海水珍珠层脂类成分中含有脂肪酸、长链烃、醛、卤代脂肪酸酯等成分，其中十五酸和3-氯丙酸十七烷基酯含量最高。甲酯化后，总脂中脂肪酸甘油酯分子中的脂肪酸部分被转化为甲酯，而游离脂肪酸未被转化，其GC/MS分析所得各种脂肪酸甲酯的种类和含量可以揭示中性脂中脂肪酸的组成特点。珍珠层总脂甲酯化后，其GC/MS分析结果显示(表2)，十五酸甲酯、十七酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯四种成分的含量之和超过总量的90％，说明它们是珍珠层中性脂中的主要脂肪酸。同时这些GC/MS分析 结果还表明游离脂肪酸和脂肪酸甘油酯中的脂肪酸组成有明显差别。
实施例2：制备“SCSIO 01819酶制剂溶液-1”及进行珍珠层脱脂
1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培养48小时，温度为28℃，转速为120rmp，得活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7.5L的发酵罐中(保兴，10L)，在初始pH＝7.5、28℃下培养96小时，发酵液脂肪酶活力达到1000u/mL，蛋白酶活力达到1500u/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得“SCSIO 01819酶制剂溶液-1”5.5L。滤膜的截留分子量为100KDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉2.0g，大豆粉0.5g，马氏珍珠贝软体部(干)的石油醚浸提物1.0g，蔗糖0.5g，30％陈海水1L。
3、取原珠1000g，装入5000mL烧杯中，再加入步骤2所述“SCSIO 01819酶制剂溶液-1”2L，用1mol/mL NaOH调节pH值至8.5，保持温度为28℃，浸泡12小时，取出后用滤纸吸干水分。
4、用无水乙醇2L浸泡步骤3所得珍珠，0.5小时后取出珍珠用滤纸吸干珍珠表面乙醇，重复浸泡3次，40℃下烘干后得脱脂珍珠。
5、采用《南珠加工前处理技术规范》方法(A1和B1处理液)，对珍珠(1000g)进行碱液和有机溶剂浸泡预处理，40℃下烘干后得脱脂珍珠。
6、分别测定步骤4、5所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层总脂、中性脂和极性脂的含量，重复3次，结果见表3。
7、根据总酯、中性脂、极性脂含量测试结果，用下式计算处理后珍珠的脂类脱除率。
脱除率(％)＝(空白对照脂含量-脱脂后脂含量)/空白对照脂含量×100
本实施例各实验的总酯、中性脂、极性脂脱除率的测试结果列于附表3。
表3.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
应用《南珠加工前处理技术规范》的传统碱液结合有机溶剂浸泡的前处理方法处理后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂的脱除率分别为：53.5％、43.3％、71.3％；使用本专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分别为：80.4％、82.3％、76.9％。传统方法可以较为有效的去处珍珠层中的游离脂肪酸，但是对与以甘油三脂肪酸酯为主的中性脂脱除效果较差。而本专利的方法中，脂肪酶可以充分接触到珍珠层中的甘油脂肪酸酯类物质，并催化其水解转化为甘油和游离脂肪酸，易被碱性溶液所溶解洗脱，总体脱脂效果明显强于碱液和有机溶剂浸泡的方法。
实施例3：制备“SCSIO 01819酶制剂溶液-1”及进行珍珠层脱脂
1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培养12小时，温度为37℃，转速为120rmp。活化培养基组成为酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
2、活化的菌液500mL加入7L诱导产酶发酵培养基的发酵罐中(保兴，10L)，在初始pH＝8.0、温度37℃下培养12小时，发酵液脂肪酶活力达到3000单位/mL，蛋白酶活力达到3000单位/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得珍珠脱脂用酶制剂溶液4.6L。滤膜的截留分子量为300KDa。诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉4.0g，大豆粉2.0g，马氏珍珠贝软体部(干)的石油醚浸提物1.5g，蔗糖2.0g，50％陈海水1L。超滤膜的截流分子量为300KDa。
3、取原珠1000g装入容器，再加入步骤2所述小单孢菌SCSIO 01819的发酵制得的酶制剂溶液5L，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至13.0保持温度为37℃，浸泡24小时，取出后用滤纸吸干水分。
4、用无水乙醇3L浸泡步骤3所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇并晾干，重复浸泡3次，40℃烘干后得SCSIO 01819珍珠层脱脂珍珠。
5、取脂商品肪酶DENIE-DEG NS-G酶制剂(30000U/g)170g溶于1L水中，制成活力约5000U/mL的溶液，加入KOH溶液(1mol/L)调节pH至13.0。DENIE-DEG NS-G是上海丹尼悦生物科技有限公司出产的碱性脂肪酶制剂，常用于皮革脱脂。其最佳活力温度为50℃，最佳pH值12.0-13.0。
6、称取原珠1000g，小心浸入DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液，保持温度为50℃，浸泡24小时。从DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液中取出珍珠，并用滤纸吸干珍珠表面水分。
7、用无水乙醇3L浸泡步骤6所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇，换新的无水乙醇浸泡，重复3次，滤纸吸干溶剂40℃烘干后得DENIE-DEG NS-G珍珠层脱脂的珍珠。
8、用实施例2中的方法测量步骤4、7所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层中脂类、中性脂和极性脂的含量，重复3次。计算脱脂率，结果列于表4。
表4.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液脱脂后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分别为：58.6％、57.6％、67.1％；使用本专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分别为：76.4％、79.4％、67.0％；SCSIO 01819脱脂作用明显强于DENIE-DEGNS-G酶制剂。结合实施例3的分析结果，可以发现DENIE-DEG NS-G酶制剂脱除中性脂的效果强于传统的碱液加有机溶剂的方法，脱除极性脂的作用略弱于传统方法。SCSIO 01819对总脂类、中性脂和极性脂的脱除效果都明显强于DENIE-DEG NS-G酶制剂，可能是由于SCSIO01819酶制剂除脂肪酶或外还具有蛋白酶活性，可以使珍珠层中的角蛋白结构变松散，使得包裹在其中的脂类成分更容易接触到酶制剂，从而转化成脂肪酸和甘油，易溶解于碱性溶液被洗脱。
实施例4：珍珠漂白效果的评估
1、配制聚乙二醇甲醚质量分数为0.2％,双氧水体积分数为5％的海水珍珠漂白液。
2、取实施例2、3的小单孢菌SCSIO 01819酶制剂处理后珍珠、《南珠加工前处理技术规范》方法处理珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂后的珍珠，以及作为空白对照的原珠各100粒，分别放入50mL磨口三角烧瓶中，温度控制在35℃左右，每2天换一次漂白液，定时轻微摇动锥形瓶(一天2次)，漂白后取出珍珠样品,滤纸吸干表面漂白液，用海水浸泡1d，然后用蒸馏水反复冲洗干净，40℃下干燥，对漂白效果进行评估。共进行5次实验，漂白时间依次为2、4、6、8、10天。统计每批珍珠的漂白率、长麻率。原珠颜色记为0级，然后从深至浅分别为灰、灰白、浅灰白、浅黄白、玉白和雪白色，依次定为1，2，3，4和5级。漂白后颜色达到4和5级视为达标，漂白率用下式计算：
漂白率(％)＝达标珍珠粒数/原珠粒数×100
加工后珍珠出现1个以上腐蚀斑点视为长麻，长麻率用下式计算：
长麻率(％)＝出现腐蚀斑点珍珠粒数/原珠粒数×100
分析结果见表5。
表5.漂白率和长麻率
由表5可知，使用“SCSIO 0189酶制剂-1”脱脂后的珍珠，加入过氧化氢漂白液后，2天后有14％珍珠达到漂白标准，8天后漂白率达到最高98％。而《南珠加工前处理技术规范》方法脱脂珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂方法脱脂珍珠、未处理原珠最早出现颜色达标的珍珠时间均为4天，而DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂脱脂珍珠漂白10天后颜色达标率可到达96％，《南珠加工前处理技术规范》处理珍珠和原珠第十天后颜色达标率为66％和45％，还未达到最高值。所有方法处理的珍珠漂白8天后都出现了少量麻点，第10天较多珍珠出现麻点(15～32％)。上述结果显示，漂白效果和珍珠脱脂率，尤其是中性脂脱除率有明显关系，脱脂率最高的SCSIO 01819酶制剂处理的珍珠层渗透性最强，漂白剂可以充分与作用部位接触，在最短时间内达到98％的漂白率，而此时仅有1％的长麻率；而其它方法不能在珍珠大规模长麻之前达到最高漂白率，说明SISIO0189酶制剂在海水珍珠层脱脂方面有明显优势。
实施例5：制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
1、将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活 化培养基中，在摇床上发酵培养12小时，温度为28℃，pH值为7.5，转速为120rmp，得活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7.5L的发酵罐中(保兴，10L)，在初始pH＝7.5、37℃下培养12小时，蛋白酶活力达到约2500u/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得“SCSIO 01819酶制剂溶-2”液5L。滤膜的截留分子量为300KDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉2.0g，大豆粉0.5g，鱿鱼内脏浆2.0g，蔗糖0.5g，30％陈海水1L。
3、称取10kg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9.3L糊状物。取5kg内脏浆，按1：1(内脏浆：酶制剂)比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混合，调节反应的起始pH值为7.0，温度为40℃，时间10小时，搅拌速度50rpm。水解完成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏的水解蛋白(1.70kg)。
实施例6：制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
1、将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培养48小时，温度为37℃，pH值为8.0，转速为120rmp，得活化菌液。培养基组成为酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7.5L的发酵罐中(保兴，10L)，在初始pH＝8.0、28℃下培养96小时，蛋白酶活力达到约3000u/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得SCSIO 01819酶制剂溶液5L。滤膜的截留分子量为100KDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉4.0g，大豆粉2.0g，鱿鱼内脏浆4.0g，蔗糖2.0g，50％陈海水1L。
3、称取10kg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9.0L糊状物。取5kg糊状物，按5：1(内脏浆：酶制剂)比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混合，调节反应的起始pH值为13.0，温度为50℃，时间20小时，搅拌速度50rpmin。水解完成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白(1.72kg)。
实施例7：制备用于对比试验的鱿鱼内脏水解蛋白
称取10kg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9.1L糊状物。取5kg糊状物，向糊状物中入碱性蛋白酶(终浓度1000u/mL)，调节反应的起始pH值为8.0，温度为45℃，时间20小时，搅拌速度50r/min。水解完成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白(1.78kg)。
实施例8：实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布按国家标准《大豆肽粉-GB/T22392-2008》中的方法测定，结果见表6。
表6.实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
表6数据表明，由SCSIO 01819酶制剂制备的水解蛋白，分子量1000-10000Da之间的肽类含量超过40％，明显高于用碱性蛋白酶催化的水解产物中相应分子量段的含量。
实施例9：鱿鱼水解蛋白对奥尼罗非鱼仔鱼生长率和死亡率的影响
奥尼罗非鱼鱼苗由广东海大集团畜牧水产研究中心提供，为出膜1天的同一批奥尼罗非鱼仔鱼。实验前先将仔鱼放在50L的塑料桶内驯养2天，驯养期间不投喂饵料。
将奥尼罗非鱼鱼苗分成1个对照组和4个实验组，其中对照组所用的饲料配方是鱼粉46％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％,磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％。
实验组1所用的饲料配方是鱼粉41％，实施例5得到的鱿鱼水解蛋白5％，其余组分与对照组相同。
实验组2所用的饲料配方是鱼粉41％，实施例6得到的鱿鱼小肽5％，其余组分与对照组相同。
实验组3所用的饲料配方是鱼粉36％，实施例5得到的鱿鱼小肽10％，其余组分与对照组相同。
实验组4所用的饲料配方是鱼粉36％，实施例6得到的鱿鱼小肽10％，其余组分与对照组相同。
饲养鱼苗桶里放置气石，24h充气，每天换水50％，吸出桶底废物，并用恒温棒控制温度为27℃。每天投喂仔鱼体重10％的配合饵料3次；实验周期21天，重复3次。
死亡率和增重率用下面公式计算：
在实验开始和结束时分别测量奥尼罗非鱼的体重(精确到0.001g)，以及鱼苗数量。
死亡率＝(实验开始时鱼苗数量-实验结束时鱼苗数量)/实验开始时育苗数量×100％
绝对增重率＝(实验结束时鱼苗重量(g)-实验开始时鱼苗重量(g))/实验天数
结果是，对照组中鱼苗的死亡率是54％±3％，绝对增重率0.0033±0.0012g/天，实验组1中鱼苗的死亡率是41％±8％，绝对增重率0.0062±0.0005g/天，实验组2中鱼苗的死亡率是45％±10％，绝对增重率0.0068±0.0011g/天，实验组3中鱼苗的死亡率是35％±8％，绝对增重率0.0055±0.0015g/天，实验组4中鱼苗的死亡率是38％±10％，绝对增重率0.0059±0.0008g/天。
以上结果表明，用鱿鱼水解蛋白部分替代鱼粉后，奥尼罗非鱼仔鱼死亡率明显降低，增重率明显增加。替代比例达到鱼粉重量5％时，即可观察到显著差异。
Claims (10)
1.海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819，保藏编号：CGMCCNo.M 9737。
2.权利要求1所述的海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819在制备用于珍珠脱脂的酶制剂溶液-1及制备用于鱿鱼内脏蛋白水解的酶制剂溶液-2中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于珍珠脱脂的酶制剂溶液-1，是通过以下方法制备的：
将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在28～37℃下培养12～48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容器中，在pH＝7.5～8.0、温度28～37℃下培养12～96小时，当发酵液脂肪酶活力达到1000～3000U /mL，蛋白酶活力达到1500～3000U /mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到用于珍珠脱脂用的SCSIO 01819酶制剂溶液-1；
所述的用于鱿鱼内脏蛋白水解的酶制剂溶液-2，是通过以下方法制备的：
将海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在28～37℃下培养12～48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容器中，在pH＝7.5～8.0、温度28～37℃下培养12～96小时，蛋白酶活力达到2500～3000U /mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到用于鱿鱼内脏蛋白水解用的SCSIO 01819酶制剂溶液-2。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的活化培养基，每1L培养基的配方为：酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50％陈海水1.0L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在用于珍珠脱脂的酶制剂溶液-1的制备中，所述的诱导产酶发酵培养基，每1L培养基的配方为：玉米粉2.0～4.0g，大豆粉0.5～2.0g，马氏珍珠贝软体部的石油醚浸提物1.0～1.5g，蔗糖0.5～2.0g，30～50％陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100～300KDa，所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸泡提取后，取提取液减压蒸干所得的残留物。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在用于鱿鱼内脏蛋白水解的酶制剂溶液-2的制备中，所述的诱导产酶发酵培养基，每1L培养基的配方为：玉米粉2.0～4.0g，大豆粉0.5～2.0g，脱脂鱿鱼内脏浆2.0～4.0g，蔗糖0.5～2.0g，30～50％陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100～300KDa，所述的脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油醚或正己烷萃取三次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于珍珠脱脂的酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将珍珠原珠与SCSIO 01819酶制剂溶液-1以珠-液比1：2～5比例(m：v)混合，调节pH值到8.5～13.0，温度28～37℃，浸泡脱脂12～24小时，将珍珠从SCSIO 01819酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体；
(2)、将步骤(1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为1：2～3(m/v)，0.5～2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和残留酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于鱿鱼内脏蛋白水解的酶制剂溶液-2在制备鱿鱼内脏水解蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO 01819酶制剂溶液-2按体积比1～5:1(v：v)混合进行酶解，反应的起始pH值为7.0～13.0，温度为40～50℃，时间10～20小时，酶解物经静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死亡率功能的鱿鱼内脏水解蛋白。
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