CN108624646A - 采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法 - Google Patents

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CN108624646A CN201810621986.2A CN201810621986A CN108624646A CN 108624646 A CN108624646 A CN 108624646A CN 201810621986 A CN201810621986 A CN 201810621986A CN 108624646 A CN108624646 A CN 108624646A
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Abstract

本发明属于微生物发酵，特别是指一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。方法包括种子液的制备、在通气发酵过程中通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液等工艺步骤；本发明解决了现有技术存在的异养培养制备的平滑菱形藻发酵液中发酵细胞密度和岩藻黄素产率低的技术难题。具有所制备的平滑菱形藻发酵液中细胞密度及岩藻黄素产率高、可以稳定实现连续工业化生产、能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物、较大型海藻来源的岩藻黄素更安全等优点。

Description

采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵，特别是指一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。
背景技术
岩藻黄素(Fucoxanthin)，又称岩藻黄质、褐藻素，是一种天然的类胡萝卜素，参与光合作用中光系统II的反应，主要来自大藻、硅藻及金藻等大型海藻和微藻。近年来研究发现，岩藻黄素具有多种功能活性，包括抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病和抗疟等生理活性，具有广阔保健食品和药物开发前景。
目前市场上岩藻黄素主要是从裙带菜、海带等大型海藻中提取获得，但是大型海藻细胞壁厚、多糖类物质含量高、纯化困难，存在海洋污染等问题，且大型海藻中岩藻黄素含量极低(仅为干重的0.01％-0.07％)。综上所述，岩藻黄素的产品质量在一定程度上难以保证，并且下游分离纯化的难度加大，因其对提取分离纯化有更高的技术要求，从而导致高纯岩藻黄素价格昂贵，进一步限制了岩藻黄素的应用。一些海洋微藻细胞中岩藻黄素含量即高达0.6％，是大型海藻的近100倍，海洋微藻是岩藻黄素更好的替代来源。
硅藻为分布广泛的海洋微藻，在海洋、淡水及潮湿的表面上均广泛存在，一般依靠光能合成自身所需的养分。研究发现舟形藻属、小环藻属、筒柱藻属等硅藻可异养培养生长，本申请中的设计人发现其生物量浓度极低，较难应用于高密度异养发酵(Guo,et al.,2016)。平滑菱形藻(Nitzchia laevis)是一种单细胞藻类，属于硅藻门(Bacillariophyta)，羽纹硅藻纲(Pennaeae)，双菱藻目(Surirellales)，菱形藻属(Nitzschia)，具有异养发酵培养的潜力。利用平滑菱形藻生产岩藻黄素的研究较少。申请人经检索发现申请号为201310329269.X的专利文献中公开了一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，提出平滑菱形藻可用于光照培养生产岩藻黄素，但是该文献仅公开了利用小环藻制备岩藻黄素的方法、步骤及工艺条件，且并未公布采用其他菌种可进行岩藻黄素的生产，同时其中也未见相关的培养条件、光照强度、培养基组份、生物量浓度等培养结果以及岩藻黄素含量和产率等一系列关键技术信息。申请人于申请号为201710523735.6的专利文献中公开了一种利用平滑菱形藻异养发酵生产岩藻黄素的方法，上述专利文献优化了适合平滑菱形藻生长和岩藻黄素积累的碳源浓度、氮源种类和浓度、硅酸盐浓度等条件，获得了较高的岩藻黄素产率，阐述了初始葡萄糖浓度为10g/L时细胞比生长速率和岩藻黄素产率最高，而初始硝酸钠浓度为1g/L时细胞比生长速率和岩藻黄素产率最高，分批发酵条件下最高细胞浓度仅为4.5g/L，而此时岩藻黄素的含量和产率均为最低。上述文献中未涉及流加发酵及相关内容提高岩藻黄素产率，而结果分析说明初始发酵培养基在10g/L以上葡萄糖浓度和1g/L以上硝酸盐浓度下均有显著抑制作用。本申请的设计人等利用异养手段培养平滑菱形藻，细胞密度仅为1.5-4.5g/L，岩藻黄素产率仅为3.31mg/(L·d)。因此有必要通过对于发酵工艺的进一步优化，以提高发酵细胞密度和岩藻黄素产率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。通过在通气培养平滑菱形藻藻种的过程中通过流加营养组分，优化发酵条件，进而进一步提高发酵生产岩藻黄素的产率。
本发明的整体技术构思是：
采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2-8天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；所述的平滑菱形藻藻种选自平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP 1092；
所述的平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，National Center for Marine Algae and Microbiota，简称NCMA)、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047(购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库，CultureCollection of Algae at The University of Texas at Austin，简称UTEX)、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，National Centerfor Marine Algae and Microbiota，简称NCMA)，其中优选平滑菱形藻(Nitzschialaevis)UTEX 2047；
B、发酵培养
将步骤A中平滑菱形藻细胞处于对数生长期的种子液按照体积比为3％-20％的接种量转接至装有无菌发酵培养基的反应釜进行通气发酵，通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液，通气发酵过程中温度20℃-30℃，发酵周期4-14天，发酵培养基的溶氧不低于20％，pH＝6-9，发酵培养基的葡萄糖、硝酸盐、磷酸盐浓度分别为1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L；
所述的流加营养组分包括碳源、氮源和磷源，其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物的一种或其组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨的一种或其组合，磷源采用磷酸钾及其水合物、磷酸氢钾及其水合物、磷酸二氢钾及其水合物、磷酸钠及其水合物、磷酸氢钠及其水合物、磷酸二氢钠及其水合物的一种或其组合。
因从发酵液中分离平滑菱形藻细胞以及从平滑菱形藻细胞中提取岩藻黄素属于现有技术，申请人在此不再赘述。
本发明的具体技术构思还有：
为满足平滑菱形藻藻种不同生长阶段对于营养物质的需求，优选的技术实现手段是，所述的流加营养组分中碳源：氮源：磷源的质量比＝52-141∶5.6-21.1∶1。
营养成分在流加时可以包括但不局限于采用如下方式，流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例单独流加或至少其中两种成分以上复配的方式流加。
为便于生产过程中的控制，简化工艺并缩短操作时间，优选的技术实现手段是，流加培养是将流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例复配后制成补料液流加至反应釜内的发酵培养基中，补料液中碳源浓度以葡萄糖为标准，葡萄糖浓度为100g/L-500g/L，氮源及磷源浓度分别为22.7g/L-113.4g/L及3.3g/L-16.6g/L。
为满足平滑菱形藻藻种的生长需要，便于终产物的积累，优选的技术实现手段如下：所述的种子培养基及发酵培养基包括如下含量的原料：
碳源1g/L-20g/L；氮源0.3g/L-3g/L；磷酸盐40-1000mg/L；NaCl 10g/L-32g/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L-0.27g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO33.06mg/L-30.56mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L-0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L-0.892g/L；H2SO41.64μg/L-16.4μg/L；vitamin B121.5g/L-15×10-5g/L；biotin 2.5g/L-25×10-5g/L；Na2SiO30.064g/L-2.0g/L；pH＝6-9.5；其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物中的一种或其两种以上的组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨中的一种或其两种以上的组合，磷源采用磷酸钾或其水合物、磷酸氢钾或其水合物、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸钠或其水合物、磷酸氢钠或其水合物、磷酸二氢钠或其水合物中的一种或其两种以上的组合。
通气发酵培养可以采用多种现有设备实现，其中较为优选的技术实现手段是，所述的通气发酵过程采用搅拌式发酵罐通气培养或三角瓶摇床培养，采用通气搅拌式发酵罐时搅拌转速100-750转/分钟，按照发酵罐体积的10％-20％向发酵罐中通入无菌空气；采用三角瓶摇床培养时摇床转速为100-240转/分钟。
所述的流加培养的方式包括连续流加和间歇流加。其中较为优选的技术实现方式是，所述的流加培养的方式采用间歇流加。
为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法进行实验：
1、平滑菱形藻细胞干重的测定
接种后每隔24小时取3mL发酵液，在转速为3000转/分钟的条件下离心5分钟，ddH2O洗涤后重新离心，重复2次；将发酵液滤至预称重的滤纸上，放入80℃真空干燥箱中烘干至恒重。
2、岩藻黄素的检测
目前申请人未发现岩藻黄素检测的国家或者企业标准，主要通过紫外可见吸光法(UV法)和高效液相色谱仪(HPLC)检测，因UV法特异性差，易受其他色素的干扰，因此HPLC法是岩藻黄素目前较好的检测手段。本申请参照Guo等人的研究，并在其基础上进行改进，具体如下：
称取20mg冻干后的藻粉，低温研磨后加入5mL无水乙醇震荡提取10分钟，离心(条件为温度4℃、转速3000转/分钟、时间5分钟)收集上清，沉淀中重新加入3mL无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈白色。收集提取液，在温度4℃、转速为12000转/分钟的条件下离心10分钟，取上清氮气吹干，再加入1mL无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪(HPLC)分析，整个过程避光条件下进行。
3、HPLC分析方法
高效液相色谱仪waters2695，配置PDA检测器，检测波长450nm，选用C18反相柱(250mm×4.6mm×5mm)。流动相为：A相为纯乙酸乙酯，B相为乙腈：甲醇：水＝84:2:14，C相为纯甲醇，采用梯度洗脱，流动相均采用HPLC级。
梯度洗脱条件如下：
时间(min) A(％) B(％) C(％) 流速(mL/min)
0 0 100 0 0.8
15 32 0 68 0.8
30 32 0 68 0.8
35 0 100 0 0.8
本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
1、本发明首次提出利用流加方式高密度发酵平滑菱形藻，用于生产岩藻黄素，经申请人实验证实，所建立发酵模型异养高密度培养平滑菱形藻，获得高细胞密度(至少可达5g/L，最高可达17.25g/L)，较现有技术(目前报道最高为4.5g/L)提高2.83倍，岩藻黄素的产率高(至少可达5.5mg/(L·d)，最高可达16.5mg/(L·d)，较现有技术提高3.98倍。
2、本发明提供的方法具有应用于工业化生产岩藻黄素的潜力。一是优化培养条件后细胞密度大大提高；二是岩藻黄素产率远高于目前报道的所有硅藻和其他藻类。
3、本发明所获得的平滑菱形藻粉，在不受外界条件限制下可以稳定实现连续工业化生产的基础上，能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物，较大型海藻来源的岩藻黄素更安全。
4、相对其他微藻培养生产岩藻黄素，生产周期大大缩短，最短可4天结束发酵，在提高生产效率、降低生产成本的同时，大大降低了培养过程中的污染风险。
附图说明
图1是平滑菱形藻分批培养过程中碳源、氮源、磷源的消耗速度及与细胞浓度的关系。
摇瓶中培养时，细胞72h开始进入平台期，而氮源在48h消耗完毕，磷源在64h消耗完毕，葡萄糖在84h消耗完毕。根据营养物质消耗速度和细胞生长速度，确定12h-72h为细胞的对数生长期，碳源、氮源和磷源的底物转化率分别为0.35g/g、2.60g/g和32.21g/g。
图2是平滑菱形藻细胞生长浓度相对于流加营养组分中浓度的关系。
根据三种主要底物的消耗速度和细胞生长速度，计算获得碳源：氮源：磷源比例为91.55：12.37：1.00，根据此比例配制用于补料发酵过程中补料。
图3是平滑菱形藻发酵罐分批补料培养、三角瓶分批补料培养和发酵罐分批补料培养三种条件下最高生物量浓度和岩藻黄素产率。
由图中可见，三角瓶分批但不补料发酵时细胞密度最高仅为2.13g/L，而三角瓶补料分批发酵条件下，细胞密度显著提高，最高可达7.13g/L，而当利用发酵罐补料分批发酵时，生物量最高达17.25g/L，是现有报道技术最高细胞密度的3.83倍，此时细胞中岩藻黄素浓度高达0.96％(占细胞干重)，岩藻黄素产率为16.5mg/(L·d)，是现有技术最高产率的4.98倍。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
平滑菱形藻三角瓶异养培养
本实施例中的生产菌种选用平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047。
本实施例包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；
B、发酵培养
将步骤A中的种子液按照体积比为10％的接种量转接入装有无菌发酵培养基的三角瓶中进行摇床培养制备发酵液，在培养温度为23℃、转速为150转/分钟的条件下培养5天，流加碳源、氮源和磷源使得三种培养基组分的浓度控制分别控制在1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L的范围内，优选方案为配制碳源、氮源和磷源的浓度分别为500.0g/L、113.4g/L和16.6g/L的补料液，按照如下体积流加：
发酵时间段 流加时间点 总流加体积(mL)
0-24h 0-24h内任意时间点 0.138
24-48h 24-48h内任意时间点 0.268
48-72h 48-72h内任意时间点 0.519
72-96 78-96h内任意时间点 1.007
96-120h 110-120h内任意时间点 1.953
所述的种子培养基和发酵培养基内包括如下组分：
NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L；FeCl3·6H2O 0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.132mg/L；ZnCl20.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O0.018mg/L；H3BO330.56mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L；Tris-buffer 0.892g/L；H2SO48.2μg/L；vitamin B1215×10-5g/L；biotin 25×10-5g/L；Na2SiO30.96g/L；NaNO30.3g/L；KH2PO440mg/L；葡萄糖1g/L；pH＝6；
从步骤B发酵结束后的发酵液中提取岩藻黄素并用HPLC检测。
实施例1的效果分析：
平滑菱形藻藻种(Nitzschia laevis)UTEX 2047在异养流加条件下生长状态较佳，生物量最高达7.13g/L，异养条件下岩藻黄素产率为6.82mg/(L·d)。目前报道的异养培养平滑菱形藻的最高岩藻黄素产率是3.31mg/(L·d)，本实施例较现有技术提高了106.7％。
实施例2
平滑菱形藻三角瓶异养培养
本实施例中的生产菌种选用平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559。
本实施例包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养7天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；
B、发酵培养
将步骤A中的种子液按照体积比为20％的接种量转接入装有400mL无菌发酵培养基的1L三角瓶中进行摇床培养制备发酵液，在培养温度为30℃、转速为240转/分钟的条件下培养4天，流加碳源、氮源和磷源使得三种培养基组分的浓度控制分别控制在1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L的范围内，优选方案为配制碳源、氮源和磷源的浓度分别为300.0g/L、68.0g/L和9.96g/L的补料液，按照如下体积流加：
发酵时间段 流加时间点 总流加体积(mL)
0-24h 0-24h内任意时间点 0.23
24-48h 24-48h内任意时间点 0.45
48-72h 48-72h内任意时间点 0.87
72-96 78-96h内任意时间点 1.68
所述的种子培养基和发酵培养基包括如下组分：
NaCl 32g/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L；CaCl2·2H2O 0.15g/L；FeCl3·6H2O 0.402mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L；ZnCl20.132mg/L；CoCl2·6H2O 0.0332mg/L；Na2MoO4·2H2O0.024mg/L；H3BO33.06mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L；H2SO48.2μg/L；vitamin B127.5×10-5g/L；biotin 12.5×10-5g/L；Na2SiO30.064g/L；NaNO31g/L；KH2PO4400mg/L；葡萄糖10g/L；pH＝8.2；
从步骤B发酵结束后的发酵液中提取岩藻黄素并用HPLC检测。
实施例2的效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559在异养流加条件下生长状态较佳，生物量最高达6.92g/L，比现有技术提高了97.0％。
实施例3
平滑菱形藻三角瓶异养培养
本实施例中的生产菌种选用平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092。
本实施例包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养5天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；
B、发酵培养
将步骤A中的种子液按照体积比为3％的接种量转接入装有2L无菌发酵培养基的5L三角瓶中进行摇床培养制备发酵液，在培养温度为20℃、转速为150转/分钟的条件下培养5天，流加碳源、氮源和磷源使得三种培养基组分的浓度控制分别控制在1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L的范围内，优选方案为配制碳源、氮源和磷源的浓度分别为100.0g/L、22.68g/L和3.32g/L的补料液，按照如下体积流加：
所述的发酵培养基包括如下组分：
NaCl 16g/L；MgSO4·7H2O 1.40g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L；MnCl2·4H2O 0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L；CoCl2·6H2O 0.0114mg/L；Na2MoO4·2H2O0.012mg/L；H3BO38.02mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.154mg/L；Tris-buffer 0.446g/L；H2SO416.4μg/L；vitamin B121.5×10-5g/L；biotin 2.5×10-5g/L；Na2SiO32g/L；NaNO33g/L；KH2PO41000mg/L；葡萄糖5g/L；pH＝9.5；
从步骤B发酵结束后的发酵液中提取岩藻黄素并用HPLC检测。
实施例3的效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092在异养流加条件下生长状态较佳，生物量最高达6.2g/L，异养条件下岩藻黄素产率为5.85mg/(L·d)。目前报道的异养培养平滑菱形藻的最高岩藻黄素产率是3.31mg/(L·d)，本申请比现有技术提高了77.3％。
实施例4
平滑菱形藻发酵罐异养培养
本实施例中的生产菌种选用平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047。
本实施例包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养5天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；
B、发酵培养
将步骤A中的种子液按照体积比为10％的接种量转接入装有无菌发酵培养基的发酵罐中进行培养制备发酵液，培养温度为23℃，发酵罐初始无菌空气通入量为每分钟发酵罐体积的10％，发酵罐搅拌器初始转速200转/分钟，持培养液溶氧不低于30％(低于30％时提高搅拌器转速或通风量)，pH值自动调节恒定于8.2，上述条件培养14天，流加碳源、氮源和磷源使得三种营养成分的浓度控制分别控制在1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L的范围内，优选方案为配制碳源、氮源和磷源的浓度分别为500.0g/L、113.4g/L和16.6g/L的补料液，按照如下体积流加：
发酵时间段 流加时间点 总流加体积(mL)
0-24h 0-24h内任意时间点 1.73×发酵液体积(L)
24-48h 24-48h内任意时间点 3.4×发酵液体积(L)
48-72h 48-72h内任意时间点 6.5×发酵液体积(L)
72-96 78-96h内任意时间点 12.6×发酵液体积(L)
96-120h 110-120h内任意时间点 24.4×发酵液体积(L)
120-144h 120-144h内任意时间点 47.35×发酵液体积(L)
144-336h - 0
所述的发酵培养基包括如下组分：
NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L；FeCl3·6H2O 0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.132mg/L；ZnCl20.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O0.018mg/L；H3BO330.56mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L；Tris-buffer 0.892g/L；H2SO48.2μg/L；vitamin B1215×10-5g/L；biotin 25×10-5g/L；Na2SiO30.96g/L；NaNO30.3g/L；KH2PO440mg/L；葡萄糖1g/L；pH＝6。
从步骤B发酵结束后的发酵液中提取岩藻黄素并用HPLC检测。
实施例4的效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在异养流加条件下生长状态较佳，生物量最高达17.25g/L，异养条件下岩藻黄素产率为16.5mg/(L·d)。目前报道的异养培养平滑菱形藻的最高岩藻黄素产率是3.31mg/(L·d)，本实施例较现有技术提高了4.98倍。
实施例5
平滑菱形藻发酵罐异养培养
本实施例与实施例4的区别在于发酵罐初始无菌空气通入量为每分钟发酵罐体积的20％，发酵罐搅拌器初始转速400转/分钟，维持培养液溶氧不低于30％(低于30％提高转速和通气量)，pH值自动调节恒定于8.2，上述条件培养14天，流加碳源、氮源和磷源使得三种培养基组份的浓度控制分别控制在1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L的范围内，优选方案为配制碳源、氮源和磷源的浓度分别为300.0g/L、68.0g/L和9.96g/L的补料液，按照如下体积流加：
发酵时间段 流加时间点 总流加体积(mL)
0-24h 0-24h内任意时间点 2.9×发酵液体积(L)
24-48h 24-48h内任意时间点 5.7×发酵液体积(L)
48-72h 48-72h内任意时间点 10.8×发酵液体积(L)
72-96 78-96h内任意时间点 21.0×发酵液体积(L)
96-120h 110-120h内任意时间点 40.1×发酵液体积(L)
120-144h 120-144h内任意时间点 78.9×发酵液体积(L)
144-336h - 0
所述的发酵培养基包括如下组分：
NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L；FeCl3·6H2O 0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.132mg/L；ZnCl20.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O0.018mg/L；H3BO330.56mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L；Tris-buffer 0.892g/L；H2SO48.2μg/L；vitamin B1215×10-5g/L；biotin 25×10-5g/L；Na2SiO30.96g/L；NaNO30.3g/L；KH2PO440mg/L；葡萄糖1g/L；pH＝6；
从步骤B发酵结束后的发酵液中提取岩藻黄素并用HPLC检测。
实施例5的效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在异养流加条件下生长状态较佳，生物量最高达16.1g/L，异养条件下岩藻黄素产率为14.5mg/(L·d)，本实施例比现有技术提高了3.38倍。
实施例6-8
平滑菱形藻发酵罐异养培养
实施例6-8与实施例5的不同之处在于，实施例6-8的初始空气通入量为每分钟发酵罐体积的12.5％、15％和17.5％。
实例6-8效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在不同空气通入量的情况下均生长良好，生物量分别高达15.4g/L、16.3g/L、16.5g/L，异养条件下岩藻黄素产率为13.2mg/(L·d)、14.5mg/(L·d)、16.2mg/(L·d)。
实施例9
平滑菱形藻发酵罐异养培养
实施例9与实施例5的区别处在于，所述的发酵培养基包括如下组分：
NaCl 16g/L；MgSO4·7H2O 1.40g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L；MnCl2·4H2O 0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L；CoCl2·6H2O 0.0114mg/L；Na2MoO4·2H2O0.012mg/L；H3BO38.02mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.154mg/L；Tris-buffer 0.446g/L；H2SO416.4μg/L；vitamin B121.5×10-5g/L；biotin 2.5×10-5g/L；Na2SiO32g/L；NaNO33g/L；KH2PO41000mg/L；葡萄糖5g/L；pH＝9.5。
实施例9效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在培养基组份下生长良好，生物量浓度高达15.9g/L，异养条件下岩藻黄素产率为15.3mg/(L·d)。
实施例10与实施例5的区别处在于，所述的发酵培养基的组分中氮源为硝酸钾，磷源为磷酸二氢钾，碳源为果葡糖浆。
实施例10效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在培养基组份下生长良好，生物量浓度高达14.8g/L，异养条件下岩藻黄素产率为14.2mg/(L·d)。
实施例11-13与实施例5的区别处在于，所述的发酵培养基的组分中氮源选用尿素和蛋白胨的组合，磷源选用磷酸氢钠，碳源选用玉米淀粉水解物。
实施例11-13效果分析：
平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在培养基组份下生长良好，生物量浓度最高达16.2g/L，异养条件下岩藻黄素产率最高为为16.8mg/(L·d)。

Claims (8)

1.采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、种子液的制备
将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2-8天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；所述的平滑菱形藻藻种选自平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP 1092；
B、发酵培养
将步骤A中平滑菱形藻细胞处于对数生长期的种子液按照体积比为3％-20％的接种量转接至装有无菌发酵培养基的反应釜进行通气发酵，通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液，通气发酵过程中温度20℃-30℃，发酵周期4-14天，发酵培养基的溶氧不低于20％，pH＝6-9，发酵培养基的葡萄糖、硝酸盐、磷酸盐浓度分别为1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L；
所述的流加营养组分包括碳源、氮源和磷源，其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物的一种或其组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨的一种或其组合，磷源采用磷酸钾及其水合物、磷酸氢钾及其水合物、磷酸二氢钾及其水合物、磷酸钠及其水合物、磷酸氢钠及其水合物、磷酸二氢钠及其水合物的一种或其组合。
2.根据权利要求1所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加营养组分中碳源：氮源：磷源的质量比＝52-141：5.6-21.1：1。
3.根据权利要求2所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例单独流加或至少其中两种成分以上复配的方式流加。
4.根据权利要求2所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于流加培养是将流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例复配后制成补料液流加至反应釜内的发酵培养基中，补料液中碳源浓度以葡萄糖为标准，葡萄糖浓度为100g/L-500g/L，氮源及磷源浓度分别为22.7g/L-113.4g/L及3.3g/L-16.6g/L。
5.根据权利要求1所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的种子培养基及发酵培养基包括如下含量的原料：
碳源1g/L-20g/L；氮源0.3g/L-3g/L；磷酸盐40-1000mg/L；NaCl 10g/L-32g/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L-0.27g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl2 0.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO3 3.06mg/L-30.56mg/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L-0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L-0.892g/L；H2SO41.64μg/L-16.4μg/L；vitamin B12 1.5g/L-15×10-5g/L；biotin 2.5g/L-25×10-5g/L；Na2SiO3 0.064g/L-2.0g/L；pH＝6-9.5；其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物中的一种或其两种以上的组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨中的一种或其两种以上的组合，磷源采用磷酸钾或其水合物、磷酸氢钾或其水合物、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸钠或其水合物、磷酸氢钠或其水合物、磷酸二氢钠或其水合物中的一种或其两种以上的组合。
6.根据权利要求1所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的通气发酵过程采用搅拌式发酵罐通气培养或三角瓶摇床培养，采用通气搅拌式发酵罐时搅拌转速100-750转/分钟，按照发酵罐体积的10％-20％向发酵罐中通入无菌空气；采用三角瓶摇床培养时摇床转速为100-240转/分钟。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加培养的方式包括连续流加和间歇流加。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加培养的方式采用间歇流加。
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