CN107201317A - 一株撕裂蜡孔菌及其防治作物真菌病害的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株撕裂蜡孔菌新种及其在防治作物真菌病害中的应用，保藏号为CGMCC No. 13899，分类命名为Ceriporia lacerate HG2011，所述菌株具有C. lacerateHG2011 18S rDNA序列表中的核苷酸序列。属于平革菌科（Phanerochaetaceae）蜡孔菌属（Ceriporia）。菌落白色，呈绒毛状、絮状；生长适宜温度：25~28℃。该菌株能分泌几丁质酶、纤维素酶、β‑1,3‑葡聚酶及蛋白酶等多种胞外酶，其发酵液对植物多种病原真菌有较强的拮抗作用，并应用于烤烟和辣椒疫霉病害防治，在植物病原真菌防治方面有较大的应用潜力。

Description

一株撕裂蜡孔菌及其防治作物真菌病害的应用
技术领域
本发明涉及一株撕裂蜡孔菌新种，还涉及到该菌株在作物真菌病害防治方面的应用，属于农业生防微生物领域。
背景技术
化学农药是重要的农业生产资料，在现代集约化农业生产中，需要大量频繁施用农药防治作物病害。但长期、大量施用农药造成了一系列生产、环境和健康问题，如病菌耐药性增强，药效降低，用药量增大，环境和农产品的农药残留量增加，影响食品安全，危害人类健康等。
真菌病害占作物病害的70％～80％。目前，病害防治的主要手段是选育高抗品种，加强田间管理和施用化学农药为主。但是，育种周期较长，费用高昂；田间管理需要生产者较高的操作水平，消耗大量劳力；大量施用化学农药产生上述一系列生产、环境和健康问题。因此，研制安全、无毒、高效的生物农药十分必要。
近年来，人们发现的生防菌主要为细菌，真菌相对较少。在已发现的生防菌中，具有抗菌谱广、高效、适应性强的菌株不多，亟待筛选出更多的广谱、高效、适应性强的菌株，应用于农业生产。目前，人们所发现的生防真菌主要包括木霉菌属、毛壳菌属、菌根真菌属和腐霉属，它们通过分泌抗菌物质，产生溶菌和重寄生作用，诱导植物产生抗性等多种途径拮抗病菌。
撕裂蜡孔菌(Ceriporialacerata)是一种木生菌，生长于腐木、腐殖质和部分土壤中。已发现的撕裂蜡孔菌能分泌多种黄酮类物质，在医学上用于治疗贫血、胃病、肺癌和心脏病等多种人类疾病；能分解木材中的木质素和纤维素，用于生物制浆造纸的环境污染治理；能分解刚果红、橙黄G，在环保上用于染料废水脱色。因此，撕裂蜡孔菌在多领域有良好的应用前景。目前，国内外对撕裂蜡孔菌用于防治作物真菌病害未见报道。本发明所筛选的撕裂蜡孔菌新种能分泌几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚酶和蛋白酶等多种胞外酶，对植物病原菌具有广谱、高效的拮抗作用，对生防菌资源库的构建，安全、高效的生物农药的研制有重要的意义。
发明内容
针对现有生防菌种数量有限，以及生防效果欠佳等问题，本发明的目的在于提供一株撕裂蜡孔菌HG2011新种，对作物真菌病害具有显著的生防效果。
一株撕裂蜡孔菌，其特征在于，保藏号为CGMCC NO.13899，分类命名为Ceriporialacerate HG2011；具有C.lacerate HG2011 18S rDNA序列表中的核苷酸序列。
所述撕裂蜡孔菌能分泌几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚酶和蛋白酶等多种胞外酶。
所述撕裂蜡孔菌制备的发酵液，拮抗作物多种病原真菌。
所述撕裂蜡孔菌制备的发酵液，用于烤烟黑胫病和辣椒疫霉病害的防治。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明获得的C.lacerate HG2011为撕裂蜡孔菌属的新种，能分泌几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚酶和蛋白酶等多种胞外酶，拮抗多种作物的病原真菌，有效防治烤烟和辣椒疫霉病。
2、本发明获得的C.lacerate HG2011营养要求简单、环境适应性强，生长迅速，丰富了生防菌资源库，为生物农药研制提供了菌种选择。
3、与目前的生防菌相比，本发明用C.lacerate HG2011制备发酵液的工艺简单，原料广，成本低，应用范围广，可用于生产安全、高效的生物农药。
附图说明
图1为本发明撕裂蜡孔菌HG2011在光学显微镜下的形态；
图2为本发明撕裂蜡孔菌HG2011 18S rDNA PCR电泳图；
图3为本发明撕裂蜡孔菌HG2011系统发育树；
图4为本发明撕裂蜡孔菌HG2011的产胞外酶平板检测图；
图5为本发明撕裂蜡孔菌HG2011发酵液对柑橘炭疽病、西瓜蔓枯病、松立枯病和烟草黑胫病病原菌的拮抗效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
培养基及其制备
选择培养基：1.0g碱木质素、2.5gNaNO3、1.0gKH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.1gCaCl2、1mL微量元素混合液(0.16gFeCl3·6H2O、1.5gZnSO4·7H2O、0.16gCoCl2·6H2O、0.15gCuSO4·5H2O、1.5gMnSO4·H2O、0.3gH3BO3、0.1g Na2MoO4·2H2O)、20g琼脂、1L去离子水，pH5.0。121℃、1.5大气压灭菌冷却后倒平板备用。
PDA固体培养基(液体培养基去除琼脂)：200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1L去离子水，pH6.50。121℃、1.5大气压、30min灭菌冷却后倒平板(固体培养基)或取20mL于150mL三角瓶中(液体培养基)备用。
几丁质琼脂培养基：0.7gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.01gFeSO4、0.001gZnSO4、2.0g胶体几丁质、20g琼脂、去离子水1L，pH6.5～7.0。121℃、1.5大气压、30min灭菌冷却后倒平板(固体培养基)或取20mL于150mL三角瓶中(液体培养基)备用。
纤维素刚果红固体培养基：0.5gK2HPO4、0.25gMgSO4、1.88g纤维素粉、0.2g刚果红、2g明胶、14g琼脂、100mL土壤浸提液、900mL去离子水，pH6.5～7.0。121℃、1.5大气压、30min灭菌冷却后倒平板(固体培养基)或取20mL于150mL三角瓶中(液体培养基)备用。
葡聚糖苯胺蓝gutting培养基：1.0g葡萄糖、4.0g茯苓粉、1.0gK2HPO4、3.0gNa2HPO4、60mg苯胺蓝、0.5gMgSO4.7H2O、0.005gFeSO4、20g琼脂、1L去离子水，pH6.5～7.0、121℃、1.5大气压、30min灭菌冷却后倒平板(固体培养基)或取20mL于150mL三角瓶中(液体培养基)备用。
奶粉固体培养基：2g脱脂奶粉、2g琼脂、1000mL去离子水，pH6.5～7.0。
实施例1：菌株HG2011的筛选
采集缙云山松树林枯枝落叶层，用稀释平板涂布法筛选出分解木质素的真菌。
具体步骤如下：称取10g枯枝落叶，置于装有90mL无菌水的锥形瓶中，摇床振荡30min后按梯度稀释，稀释倍数为10-2～10-7(即10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)。在无菌条件下，分别吸取0.1mL不同浓度的稀释液，于选择培养基上涂布，每个稀释度重复涂布6个平板，25℃培养4d。在菌落数为40～60个的平板上，挑取不同类型的菌落于选择培养基上进行纯化，纯化4次后，挑选具有实施例2菌落形态的菌株HG2011，3～5℃保存。
实施例2：菌株HG2011的鉴定
1、菌落的形态观察
将上述菌株HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，观察菌落形态并拍照记录。用接种针挑取菌丝至载玻片上，加1滴乳酸石碳酸棉蓝染色液，盖上盖玻片并置于显微镜下观察。图1为本发明获得的HG2011菌株，在光学显微镜下的形态为：菌株生长迅速，菌落大、蓬松、干燥、不透明，呈绒毛状、絮状，菌丝可沿培养基表面蔓延生长，菌落初期呈白色，生长后期变为浅黄色(图1A)。生殖菌丝无色无隔、薄壁、频繁分枝，交织排列(图1B)；椭圆形担孢子(图1C)。
2、18SrDNA鉴定
将上述菌株HG2011接种于PDA固体培养基中，25℃培养5d，首先用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株HG2011的基因组DNA，作为18SrDNA扩增的模板，用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增，引物序列由上海Invitrogen TradingCo.Ltd提供。PCR反应体系(20μL)：10×EX Taq buffer 2μL；dNTP Mix(2.5mM)1.6μL；引物1和引物2各0.8μL；DNA模板0.5μL；5μ EX Taqpolymerase0.2μL；无菌水14.1μL。PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸40s、35个循环，72℃后延伸10min。扩增目的条带大小为618bp，如图2所示，为本发明HG2011菌株的18SrDNAPCR电泳图；将扩增获得的PCR产物经1％琼脂糖电泳回收，由上海美吉生物医药科技有限公司纯化和测序。具体见HG2011 18S rDNA核苷酸序列表。
将所得序列与NCBI的GenBank DNA序列数据库进行同源性对比分析，结果显示所获菌株与Ceriporia lacerata(GeneBank accession numbers AY730555,FJ462746,HQ891300,KC881071,KF151851,KF850375,KJ780757,KP297476,KP326576,KX514741)的序列有较高的同源性。用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，如图3所示。根据同源性比对和系统发育分析得出，该菌株为Ceriporia lacerata一个新种，命名为C.lacerateHG2011。
本发明提供的菌株C.lacerate HG2011，已于2017年6月2日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.13899，分类命名为撕裂蜡孔菌C.lacerateHG2011。
实施例3：抗菌特性测定
1、胞外酶测定
将C.lacerate HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块1个，接种于几丁质琼脂培养基中央，25℃培养5d。在几丁质水解酶作用下，乳白色的几丁质被水解为可溶性小分子物质，乳白色的几丁质消失，在菌落周围形成无色透明区(参见图4A)。
将C.lacerate HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块1个，接种于纤维素刚果红固体培养基中央，25℃培养5d。在纤维素酶的作用下，纤维素被水解成为小分子糖类，刚果红与纤维素形成的红色消失，在菌落周围形成无色或浅黄色水解区(参见图4B)。
将C.lacerate HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块1个，接种于葡聚糖苯胺蓝gutting培养基上，25℃培养5d。在β-1,3葡聚酶的作用下，茯苓粉中的β-1,3葡聚糖降解，β-1,3葡聚糖与苯胺蓝形成的蓝色消失，在菌落周围会形成无色水解区(参见图4C)。
将C.lacerate HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块1个，接种于奶粉培养基上，25℃培养5d。在蛋白酶作用下，奶粉中的蛋白质被分解为可溶性氨基酸，在菌落周围会形成无色的蛋白水解区(参见图4D)。
实施例4：C.lacerate HG2011发酵液对植物病原真菌拮抗活性的测定
将C.lacerate HG2011接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块，接种于PDA液体培养基中(接种量10菌块/100mL培养液)，25℃暗培养7d，过滤去除菌丝，滤液用0.22μm滤膜抽滤去除孢子。将发酵液加入到灭菌冷却至50℃的PDA固体培养基中，分别形成0％(不加发酵液，对照)、25％(稀释4倍)、50％(稀释2倍)的三种浓度，倒入9cm培养皿制作出带毒平板。
西瓜蔓枯病、烟草黑茎病、柑橘炭疽病及松立枯病的病原菌接种于PDA固体培养基上，25℃培养5d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块菌块1个，分别接种于上述带毒平板中央，25℃倒置培养5～7d，出现明显拮抗效果。如图5所示，与空白对照(CK)相比，在发酵液浓度25％的带毒平板上，上述4种不同病原菌菌落直径略减小；在发酵液浓度50％的带毒平板上，上述4种不同病原菌菌落直径显著减小，说明C.lacerateHG2011的发酵液对它们具有抑制作用，其抑菌率如下(表1)。
表1
实施例5：C.lacerate HG2011发酵液防治作物真菌病害
烤烟黑胫病防治实例：2017年5月5日和6月5日，在重庆市某烟地于用C.lacerateHG2011发酵液，兑水稀释4倍，每株烟苗分两次灌根，每次50mL，发病率降低67.4％。
辣椒疫霉病防治实例：2016年4月10日和6月10日，在重庆市某菜地于用C.lacerate HG2011发酵液，兑水稀释4倍，每株辣椒苗分两次灌根，每次100mL，发病率降低60.4％。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，但本领域的技术人员应当理解，在生物防治方面，对本发明所获菌株进行抗菌谱的扩展和防治作物病害种类的替换，由本菌株制备的微生物菌剂和生物农药，以及在该菌株基础上进行的任何扩展或修改等，应视为不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 一株撕裂蜡孔菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> 撕裂蜡孔菌(C. lacerate)GH2011
<220>
<223> 18s rDNA核苷酸序列
<400> 1
tgaacctgcg gaaggatcat tatcgagttt tgaacgggtt gtagctggcc tttaacgagg 60
tatgtgcacg cctggctcat ccactctcaa cctctgtgca ctttatgtaa gaaacggtgt 120
aagccagcta tttaatagtc ggtaataagc ctttcttatg tttactacaa acgcttcagt 180
tatagaatgt ttactgtgta taacacaatt atatacaact ttcagcaacg gatctcttgg 240
ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcaa 300
gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cactccttgg tattccgagg gtatgcctgt 360
ttgagtctca tggaattctc aacccctaaa ttttgtaatg aagtttagtg ggcttggact 420
tggaggttgt gtcggcttct agtcgactcc tctgaaatgc attagcgtga atcttacgga 480
tcgccttcag tgtgataatt atctgcgctg tggtgttgaa gtatttatta gttcatgctt 540
ataatcgtct cttaccgaga caatttatga caatctgagc tcaaatcagg taggactacc 600
cgctgaactt aagcatat 618

Claims (4)

1.一株撕裂蜡孔菌新种，其特征在于，保藏号为CGMCC NO.13899，分类命名为Ceriporia lacerate HG2011；具有C. lacerate HG2011 18S rDNA序列表中的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述撕裂蜡孔菌新种，分泌几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚酶及蛋白酶多种胞外酶，在植物真菌病害防治方面的应用。
3.如权利要求1所述撕裂蜡孔菌新种，其发酵液对植物的多种病原真菌的拮抗作用。
4.如权利要求1所述撕裂蜡孔菌新种，用于烤烟黑胫病和辣椒疫霉病害防治。
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