KR102606640B1 - 대사성 질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제 및 이의 용도 - Google Patents

대사성 질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 바실러스 벨레젠시스 균주, 바실러스 리체니포미스 균주, 엔테로코커스 훼시엄 균주 및 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 복합생균제로, 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료용 미생물 제제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 생균활성 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품(건강기능식품) 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 음용수 첨가제 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제에 관한 것으로, 본 발명의 복합생균제는 대사성 질환을 예방하거나 개선이 요구되는 건강기능식품이나 치료가 요구되는 의약품, 가축이나 반려동물의 대사성 질환 개선을 위한 사료 첨가제나 동물용 의약품 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

대사성 질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제 및 이의 용도{Probiotics mixture with prevention, improvement or treatment effect on metabolic disease and uses thereof}
본 발명은 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 주요 생균제로 하는 복합생균제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비만 식이로 인한 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 상기 복합생균제, 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 비만 식이로 인한 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제제를 제조하는 방법, 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 생균 활성 조성물, 약학 조성물, 식품(건강기능식품) 조성물, 음용수 첨가제 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
대사성 질환은 잉여 영양분의 과도한 축적으로 인해 지방 조직의 급격한 증가와 만성 염증의 야기로 인해 인슐린 저항성, 당 및 지질 대사 이상 등의 비정상적인 대사 과정과 면역기능 저하 등으로 발생하는 비만, 당뇨병, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 동맥경화증, 골다공증, 근감소증 등의 질환을 총칭하여 일컫는다(Koopman, R. J., Swofford, S. J., Beard, M. N., and Meadows, S. E. 2009. Obesity and metabolic disease. Prim Care 36, 257-270).
그 중 비만은 대표적인 대사성 질환의 초기 증상으로 나타난다. 비만의 주요 원인은 고칼로리의 음식 섭취와 낮은 대사 활동으로 인한 잉여 영양분이 지방으로 전환, 축적되어 발생하며 간 등의 주요 대사 조직의 과도한 지방 축적은 인슐린 저항성, 당 및 지질 대사 이상 등의 대사 질환의 발생을 유도한다.
현재까지 알려진 비만치료제는 작용 기전에 따라 크게 포만감 항진제, 지방흡수 억제제, 항정신성 식욕 억제제로 나뉘며, 가장 대표적인 약물들로는 제니칼(XenicalTM, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(ReductilTM, 애보트사, 미국), 엑소리제(ExoliseTM, 아토파마, 프랑스) 등이 있으나 지방변, 장내가스발생, 복부팽만감, 배변 실금 등을 유발하고, 심장질환, 호흡기 질환, 신경계질환 등의 부작용을 동반하며, 그 효능의 지속성이 낮다는 문제점이 있다.
비만을 치료하기 위해서는 과량의 지방을 연소시켜 체중을 감소시키거나 대사성 불균형(metabolic imbalance)을 개선시키는 것이다. 현재 비만의 치료는 체중감량뿐만 아니라, 조기에 심혈관 질환을 유발하는 요인을 제거하여 대사 이상을 개선하는 데 그 목표가 있다. 또한 식이섭취 조절 및 에너지 소비 조절을 통해 비만을 억제하는 연구도 활발히 이루어지고 있다.
비만은 신진대사와 면역 항상성뿐만 아니라 장 미생물 군락의 균형을 교란한다. 비만에서 변형된 장 미생물은 신진대사와 면역기능 장애 사이의 중요한 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, 인슐린 저항성은 'leaky gut'에서 흡수된 혈청 내 독소에 의해 유도되고 전신성 염증을 증가시킨다. 장내 균총 이상(Gut dysbiosis)은 면역 항상성을 방해하고 다양한 염증성 및 대사성 질환의 발달을 촉진한다. 비만 관련 미생물의 변화는 장 투과성 및 순환 내독소 수준의 증가로 이어져 낮은 등급의 전신성 염증을 유발한다. 미생물 군집 구성원이 서로 어떻게 상호 작용하는지 그리고 숙주 면역계와 상호작용하여 비만을 예방하거나 보호하는 연구가 광범위하게 진행 중이다. 특정 박테리아 분류(texa) (예, Akkermansia muciniphila)는 내독소혈증(endotoxemia)을 감소시키고 지방 조직에서 조절 T세포의 축적을 촉진시킴으로써 상기 증상을 조절하는 것으로 밝혀졌다.
장내에는 다양한 박테리아들이 미생물상을 구성하고 있으며 고지방 식이는 이러한 미생물 균총의 이상을 유발하여 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 농도를 증가시킴으로써 낮은 수준의 만성 염증을 일으키고, 이러한 염증적 환경은 대사 이상을 유발하여 비만 및 제 2형 당뇨병을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Hersoug, L. G., Moller, P., and Loft, S. 2016. Gut microbiota-derived lipopolysaccharide uptake and trafficking to adipose tissue: implications for inflammation and obesity. Obes Rev 17, 297-312; Moreno-Navarrete, J. M., Ortega, F., Serino, M., Luche, E., Waget, A., Pardo, G., Salvador, J., Ricart, W., Fruhbeck, G., Burcelin, R., and Fernandez-Real, J. M. 2012. Circulating lipopolysaccharide-binding protein (LBP) as a marker of obesity-related insulin resistance. Int J Obes (Lond) 36, 1442-1449).
면역 및 대사 시스템의 조절을 통해 숙주의 건강에 기여하는 것으로 알려진 유산균을 포함한 probiotic 박테리아는 고지방식에 의한 장내 미생물 균총의 이상을 억제하여 LPS-유발 염증을 낮춤으로써 비만과 제 2형 당뇨병의 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로 보고되었다. 프로바이오틱스는 장과 지방 세포에서 인슐린 저항성을 개선시키는데 중요한 역할을 하는 adiponectin과 포만감을 느끼게 돕는 glucagon-like peptide 1 (GLP-1)과 같은 호르몬의 분비를 조절함으로써 유익한 효과를 얻을 수 있는 것으로 보고되었다. 또 다른 연구에서는 고지방 식이 쥐에 유산균을 함께 투여할 경우, 지방산 산화의 증가에 의한 지방간 및 고지혈증을 개선시키는 것으로 보고되었다(Saez-Lara, M. J., Robles-Sanchez, C., Ruiz-Ojeda, F. J., Plaza-Diaz, J., and Gil, A. 2016. Effects of Probiotics and Synbiotics on Obesity, Insulin Resistance Syndrome, Type 2 Diabetes and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: A Review of Human Clinical Trials. Int J Mol Sci 17, 589-595; 이연주. 2017. 고지방 식이 쥐의 대사이상 유발에 대한 유산균주의 억제효과. 전남대학교).
과거 지방 세포는 단순히 인체의 잉여 에너지를 중성지방의 형태로 저장하고 외부로부터 충격을 완충해주는 작용을 하는 세포로 인식되어 왔다. 하지만 최근에 지방 세포는 공복, 대사, 인슐린 민감도(insulin sensitivity)를 조절하는 아디포사이토카인(adipocytokine)을 분비하는 내분비기관으로서 항상성 유지와 에너지 대사 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 에너지 대사의 주요 조직인 지방 세포의 리모델링은 에너지 소비 증가를 통해 에너지 불균형을 개선하는 것으로 확인되면서 최근 비만, 당뇨, 지방간 등 대사성 질환의 예방 및 치료전략으로 관심이 증가되고 있다. 장내 미생물과 에너지 대사 조절 신호 경로와의 연관성은 지속적으로 규명되고 있고, 장내 미생물에 의한 에너지 대사 조절을 매개하는 숙주의 핵심적인 주요 조절자 발굴을 통해 장내 미생물과 대사 이상의 연관성에 대한 조절 기전을 규명하려는 연구가 활발히 진행 중이다.
한편, 생균제(probiotics)란 적정량 섭취 시 유당불내증의 경감, 면역활성 및 조절, 알레르기 반응 및 염증의 완화, 혈중 콜레스테롤의 감소, 대장암에 대한 억제효과, 아토피피부염, 크론병, 설사, 캔디다 감염증 및 요도 감염의 임상적 증상 감소 그리고 병원균의 경쟁적 저해 등을 통하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 부여하는 미생물을 총칭한다(Cho, Jung-Whan, Kim, Dong-Hyeon, Kim, Hyun-Sook, Kim, Hong-Seok, Hwang, Dae-Geun, Song, Kwang-Young, Yim, Jin-Hyuk, Choi, Dasom, Lim, Jong-Soo and Seo, Kun-Ho Seo. 2014. Effect of Probiotics on Risk Factors for Human Disease: A Review. Korean J. Dairy Sci. Technol. 32: 17-29).
생균제는 동물 소화관내에서 유용한 작용을 하는 미생물로써 장내 균총 개선과 같은 숙주동물에 유용한 작용을 한다. 생균제로 사용되는 균주로는 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Bacillus, Clostridium, Saccharomyces, Aspergillus 속 등이 있다. 생균제의 작용기전은 장내 세균총 정상화, 항생물질 생산, 병원균의 정착을 저지하기 위한 영양소 경합, pH 저하에 의한 유기산 생산, β-glucuronidase, azoreductase, nitroreductase 등 병원균 유해효소 억제, 부패 산물 및 독소 생산저지, 소화효소 생산, 비타민 합성, 면역자극 등이 있다.
본 발명자들은 생균제의 생리활성 특성을 연구하던 중 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주들이 서로 다른 생리활성 효과를 갖고 있는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 이들 균주를 특정 비율로 배합하였을 때, 항산화와 항염증 활성을 보였고, 에너지 대사를 증가시켜 비만을 억제하는 효과를 발견하였다. 최적 배합비를 갖는 균주 혼합물을 구성하여 복합생균제를 제조한 후 고지방 식이를 급여하여 비만을 유도한 실험동물에서 대사성 질환을 예방, 개선, 또는 치료 효과를 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
공개특허공보 제10-2019-0122083호
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주의 복합생균제가 대사성 질환을 개선시키는 것을 최초로 발견하였다.
따라서 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료용 미생물 제제를 제공하고자 한다.
또한, 상기 복합생균제를 배양하는 단계를 포함하는 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료용 복합생균제제를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 생균활성 조성물, 약학 조성물, 식품(건강기능식품) 조성물, 음용수 첨가제 및 사료용 조성물 등을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주의 복합생균제를 제공한다.
상기 바실러스 벨레젠시스 균주는 전라북도 군산시 토양에서 분리하였다. 분리한 균주를 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하여 동정한 결과, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis, KCTC13417)로 확인되었다.
상기 바실러스 리체니포미스 균주는 전라북도 군산시 공설시장에서 구매한 재래 된장에서 분리하였다. 균주 동정을 위해 16S rDNA 유전자 서열 검사를 실시한 결과, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis, KCTC1918)로 확인되었다.
상기 엔테로코커스 훼시엄 균주는 김치에서 분리하여 동정한 후 사용하였는데, 16S rDNA 검사 결과, 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium, KCTC13225)으로 확인되었다.
상기 락토바실러스 플란타럼 균주는 시중에 판매되는 발효 김치에서 분리하였다. 분리한 균주를 16S rDNA 분석법으로 염기서열 분석을 통하여 동정한 결과, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, KCTC3108)로 확인되었다.
본 발명에서 사용되는 용어 '대사성 질환(Metabolic disease)'은 잉여 영양분의 과도한 축적으로 인해 지방 조직의 급격한 증가와 만성 염증의 야기로 인해 인슐린 저항성, 당 및 지질 대사 이상 등의 비정상적인 대사 과정과 면역기능 저하 등으로 발생하는 비만, 당뇨병, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 동맥경화증, 골다공증, 근감소증 등의 질환을 총칭하여 일컫는 임상적 증상을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "억제"란, 본 발명에 따른 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 복합생균제제를 개체에 투여하여 대사성 질환의 일부 또는 전체 임상증세를 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 복합미생물제제 및 이의 배양액을 대사성 질환 의심 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명은 본 발명의 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 복합미생물 제제는 유효성분으로서 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하여 제조될 수 있다.
이때, 상기 복합생균제제의 혼합비율은 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주를 1-3:1-3:1-3:1-3의 혼합비로 혼합될 수 있다.
보다 더 구체적으로는 상기 복합생균제제의 혼합비율은 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주를 3:3:3:1의 혼합비로 혼합될 수 있다.
상기 복합생균제는 각각의 균주를 개별적으로 배양하고 동결건조하여 일정비로 혼합하거나, 균주들을 혼합한 후 합동 배양을 하여 증식시킬 수 있으나, 더욱 바람직하게는 균주를 개별적으로 배양한 후 최종적으로 일정한 혼합비로 혼합하는 것이 효과를 더욱 보장할 수 있다.
상기 복합생균제는 in vitro 실험에서 높은 항산화 활성(50%), 산화적 스트레스 저항성(82.3%), LPS로 유발한 염증에 대한 항염증 활성, 호중구와 대식세포의 활성을 통한 선천적 면역능 증진, 아토피 피부염 개선, 조골세포 분화효소 활성(121.6%) 및 파골세포 분화세포 억제(76.8%)를 통한 골 소실 억제활성, MuRF1 유전자 발현 억제를 통한 근손실 억제, triglyceride 생성량 감소(58.6%)와 높은 콜레스테롤 동화능(78.2%)으로 확인한 비만 억제 효과를 나타내어 우수한 생리활성 효과를 가진 것으로 판단된다.
또한, 상기 복합생균제는 세균 또는 진균 등에 대한 항균 효과가 인정된다. 상기 세균 또는 진균의 구체적인 예로는 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 장티푸스 균(Salmonella enterica serovar Typhi), 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토제니스(Listeria monocytogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergilus fumigatus) 등 일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 복합생균제는 대사증후군 동물 모델을 이용한 대사성 질환 개선 실험에서 고지방식이의 급여로 인한 급격한 체중 증가를 억제시켰고(66%에서 44.2%로 감소), 콜레스테롤 수치들과 중성지방(307.8 mg/㎗에서 157.2 mg/㎗로 감소)을 개선시켰으며, 동맥경화 지수와 심혈관 위험지수를 유의적으로 낮췄고, 염증반응 억제인자 및 염증 지표를 개선시키고, 식욕억제 인자를 유의적으로 증가시켜, 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 복합생균제을 배양하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 복합생균제제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 복합 균주를 배양하는 방법은 당 업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 생균활성 조성물을 제공한다. 본 발명의 복합생균제은 64.8% 이상의 비교적 높은 내산성, 64.1%의 내담즙산성과 70℃에서 10분간 열처리하여도 89.8% 이상의 높은 생존률을 나타내어 프로바이오틱 생균으로 매우 우수한 특성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명은 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예선, 개선, 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, '약학적으로 허용 가능한 담체'란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 상기 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단일 제제로도 사용할 수 있고, 공인된 대사성 질환 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 대사성 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 대사성 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 1 g(또는 mL) 당 본 발명의 균을 균수로 환산하였을 경우, 7 log CFU 내지 10 log CFU의 양, 바람직하게는 8 log CFU/g 내지 9 log CFU/g의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 상기 복합생균제의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는 지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 복합 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대상성 질환의 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주혼합물을 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주혼합물 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 쵸코렛, 캔디류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 음료수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것일 수 있다. 건강기능식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 대사성 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이때, 상기 식품에 포함되는 상기 복합생균제 또는 이의 배양액의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다.
상기 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 복합생균제 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선용 음용수 첨가제를 제공한다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제는 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물을 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용하거나, 음용수 제조시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 음용수 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미 노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주의 복합생균제는 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과가 매우 우수하므로, 상기 복합생균제 및 이의 배양액은 대사성 질환의 예방이나 개선이 요구되는 건강기능식품이나 치료가 요구되는 의약품, 가축이나 반려동물의 대사성 질환 예방, 개선, 또는 치료를 위한 사료 첨가제나 동물용 의약품 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 복합생균제의 급여가 고지방식이로 비만을 유도한 실험동물(생후 6주령 수컷 C57BL/6 마우스)의 5주간 사양 중 생체 증가를 억제하는 효과를 가시적으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1]
<시험 균주의 준비>
본 발명의 시험 균주인 바실러스 벨레젠시스(KCTC13417), 바실러스 리체니포미스(KCTC1918), 엔테로코커스 훼시엄(KCTC13225) 및 락토바실러스 플란타럼(KCTC3108) 균주들을 준비하여 각각 Brain heart infusion (BHI, Difco Laboratories, U.S.A.) 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양하여 균주를 증식시킨 후 원심 분리하여 균주를 얻었다. 균주는 동결건조시켜 분말로 조제한 후 -20℃에 냉동 보관하며 하기 실험에 사용하였다.
[실시예 1 내지 5] 복합생균제 혼합물의 제조
동결보관 중인 시험 균주의 분말들을 바실러스 벨레젠시스 30 중량%, 바실러스 리체니포미스 30 중량%, 엔테로코커스 훼시엄 30 중량% 및 락토바실러스 플란타럼 10 중량%로 칭량하여 준비한 후 미리 선정한 부형제와 분말혼합기를 이용하여 고르게 잘 섞은 다음 멸균한 포장지에 2 g씩 분주한 후 밀봉하여 본 발명의 복합생균제 시험시료를 준비하였다. 부형제는 시험균주 혼합물의 생리학적 효능을 주요하게 파악하고 균주 외에 다른 성분들이 활성 효과에 영향을 주는 것을 가급적 피하고자 부형제의 종류를 최소화하여 구성하였다. 균주 혼합물 균주를 50중량%로 하였을 때, 부형제는 옥수수전분(20중량%), 무수당(16중량%), 덱스트란(12중량%), 솔비톨(1중량%), 어류콜라겐(12중량%)을 선정하였다.
[실험예 2] <복합생균제의 생리활성 효과>
<2-1> 실험 방법
① DPPH 법에 의한 항산화 활성 시험
실시예 1을 BHI broth에 접종하여 배양한 후, 원심분리(7,000×g, 20분, 4℃)한 다음 균주 침전물과 배양 상등액을 분리하였다. 배양 상등액은 0.45 μL fliter로 여과한 후 냉장고에 보관하였다. 균주 침전물은 다시 PBS 용액으로 3회 세척하여 세포수 약 108 CFU/mL로 맞춰 동일한 buffer에서 현탁시켰다. 현탁액을 두 부분으로 분리하여 한 부분은 냉장고에 보관하며 생균 시료로 사용하였다. 나머지 반은 뚜껑있는 시험관에 넣은 후 90℃로 미리 고정한 수조에 넣어 15분간 가열처리하여 사멸시킨 다음, 원심분리하여 사균체를 얻었다. 생균체와 사균체는 시험 직전에 동량의 증류수를 가하여 희석시킨 후 사용하였다. DPPH에 대한 수소 공여능은 100 M DPPH 용액(DPPH 6 mg, EtOH 100 mL, 증류수 100 mL) 1,000 μL에 시험 균주의 배양 상등액, 생균체, 사균체를 각각 200 μL 를 가하여 10초 동안 진탕한 후 10분간 방치한 다음, 528 nm에서 흡광도를 측정하였다.
② H2O2에 대한 저항성 시험
실시예 1을 BHI broth에 접종하여 배양한 후, 원심분리(7,000×g, 20분, 4℃)한 다음 PBS 용액으로 3회 세척하여 세포수 약 108 CFU/mL로 맞춰 동일한 buffer에서 현탁시켰다. 0.5 mM H2O2 용액 500 μL와 동량의 세포 현탁액을 즉시 혼합하여 60분 간격으로 총 5시간 반응시킨 후 잔존하는 H2O2을 제거하기 위해 다시 원심분리(20,000×g, 1분, 4°C)하여 pellet을 회수하였다. Pellet을 buffer에 재현탁 시킨 다음 단계별로 희석하고 BHI agar에 평판배양(30°C, 24시간)하여 생성된 집락수를 측정한 후 초기 균수에 대한 감소율을 나타내었다.
③ 항염증 효과 시험
실시예 1의 배양상등액이 Raw 264.7 대식세포에서 LPS로 유도되는 NO 생성률과 대식세포의 생존율을 측정하였다. 즉, Raw 264.7 대식세포를 10% FBS가 포함한 DMEM 배지로 96 well plate에 1×104/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 부착된 세포에 2.5%와 5% 농도의 배양액을 1시간 전 처리 한 다음, lipopolysaccharide(LPS, 100 ng/mL)를 처리하여 20시간을 배양하였다. 20시간 후 상등액을 취하여 Geiess reagent(0.2% N-(1-naphthy) ethylene diamine 용액:0.2% sulfanilamide 용액 = 1:1)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해활성은 LPS만을 처리한 군과 비교하는 방법으로 평가하였다. 별도로, NO 저해 활성이 배양액의 세포독성에 의한 것인지를 확인하기 위하여, NO 생성량을 측정하기 위해 상등액을 취하고 남은 배양액에 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma, St.Louis, MO, USA) 용액을 최종 농도가 500 μg/mL이 되도록 한 후 4시간 가량 배양한 다음, MTT 용액을 제거하고 각 well에 DMSO를 100 μL씩 처리하여 well에 생성된 fomazan을 모두 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 LPS만 처리한 군의 흡광도 평균에 대한 배양액 처리군의 흡광도 평균의 비율을 구하여 생존율(%)을 계산하였다.
④ 면역 활성 평가
실시예1의 면역학적 활성을 확인하기 위해 상기의 방법을 사용하여 얻은 생균과 배양상등액의 면역 활성을 측정하였다. 면역 활성 확인 실험은 2가지로 진행하였다. 먼저 Oxidative burst는 호중구(Neutrophil)의 활성도를 확인하는 실험으로 개의 전혈을 세포배지(RPMI1640)와 1:1로 섞어 준비한 뒤 1.5 mL tube에 25 μL의 생균 혹은 대사물질을 넣었다. 100 μL의 전혈을 넣고 잘 섞은 후 30분간 정치하였다. 25 μL의 50 μM PMA(blank : PBS)와 25 μL의 30 μg/mL DHR123 solution(blank : PBS)을 넣고 15분간 정치하였다. 원심분리(250×g, 5분) 후 상등액을 제거하고. Pellet을 재현탁하여 1 mL RBC lysis buffer를 넣고 암실에서 7분 정치시켰다. FACS buffer(PBS, 1% FBS, 0.1% sodium azide)에 세척 후 다시 0.3 mL FACS buffer에 띄워 Flow cytometry로 rhodamine 123의 MFI(mean fluorescence intensity) 값을 측정하였다. 대식세포(Macrophage)의 탐식 활성을 알아보기 위해 Phagocytosis 활성을 측정하였다. 1.5 mL tube에 100 μL의 전혈과 100 μL의 생균 혹은 대사물질을 넣고 잘 섞은 후 30분 정치하였다. 이후 원심분리(200×g, 5분)하고 상등액은 버리고 Pellet을 재현탁시킨 후 100 μL의 Fluorosphere beads solution(Polysciences, Inc)을 넣고 30분간 정치하였다. 원심분리(250×g, 5분) 후 상등액을 제거하고 1 mL RBC lysis buffer를 넣어 암실에 7분 정치시켰다. FACS buffer로 세척 후 다시 0.3 mL FACS buffer에 띄워 Flow cytometry로 beads의 MFI(mean fluorescence intensity)를 측정하였다.
⑤ 아토피 피부염 개선 효과 시험
본 발명의 복합생균제 배양액이 LPS에 의한 NO 생성을 저해시킴에 따라(표 3), 그 기전을 규명하기 위해 염증성 전사인자인 Nuclear factor of activated T-cells 5(NFAT5) 및 사이토카인의 발현을 살펴보았다. 사람 각질형성세포인 HaCat 세포를 10% FBS가 포함한 DMEM 배지로 6 well plate에 분주한 후 약 80% 정도 자랐을 때, 2.5%와 5% 농도의 배양액을 1시간 동안 처리하였다. 1시간 후, 10 ng/mL TNF-α 및 500 μM H202를 처리하여 24시간 배양하였다.
⑥ 골 감소증 억제효과 시험
본 발명의 복합생균제 배양액이 조골세포와 파골세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 세포의 세포 증식률과 활성 지표효소인 ALP의 활성 정도를 측정하였다. MC3T3-E1 세포는 α-MEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 골세포 분화를 유도하기 위해 10 mM β-glycerol phosphate (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)와 50 μg/mL의 비타민C를 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.
배양된 MC3T3-E1 세포를 1×104 cells/well로 조정하여 96 well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 분화 유도 배지로 교환하여 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 처리하였다. 3일 뒤, PBS로 세척한 다음, 0.1% Triton X-100 20 μL을 첨가하여 37℃에서 30분간 용해시켰다. 용해된 세포의 상층액 5 μL은 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상층액에 0.1 N glycine 20 μL과 100 mM p-notrophenylphosphate (p-NPP) 10 μL을 첨가한 후 다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 200 μL의 0.1N NaOH로 반응을 중지하고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP 활성은 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol(p-NP)를 측정하여 p-NP에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 대조구와의 상대 비교를 통해 도출하였다.
4~5주령된 ICR 마우스의 경골을 적출하여, 양끝을 절단하고 α-MEM essential medium을 통과시켜 골수세포를 수집하고, 50 ng/μL M-CSF (macrophagy-colony stimulation factor)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 미부착 세포를 α-MEM으로 세척한 후 96 well에 5×104 cells/well이 되도록 분주하고 50 ng/μL M-CSF가 첨가된 α-MEM 배지에 3일간 배양하였다. 그 후 50 ng/μL M-CSF와 100 ng/μL RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)을 함께 처리하고, 배양액을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 96 well에 5×104 cells/well이 되도록 세포를 분주하고, 분화 인자와 배양액을 처리하여 4일간 배양하였다. 배지를 제거하여 PBS로 세척한 다음 10% formaldehyde로 고정한 세포에 기질 용액 (1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartate, 50 mM citrate buffer, pH 4.6)을 100 μL씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 플레이트에 옮기고 0.1 N NaOH로 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 표시하였다.
⑦ 근손실 억제 효과 시험
Myoblast에서 myotube로 분화가 유발될 경우 세포들 사이의 융합에 따른 근섬유의 수가 증가하고 근섬유의 지름이 두꺼워지는 특징을 나타낸다. 그러나, 근위축이 유발될 경우에는 근육 단백질의 분해를 통하여 근섬유의 수와 지름이 감소함으로서 전체적인 근육량의 감소가 나타나게 된다. C2C12 myoblast는 10% FBS 및 100 unit/mL antibiotics가 포함된 DMEM 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 2% Horse serum이 함유된 분화 배지를 사용하였다.
근위축 세포모델을 구축하기 위해, 충분히 분화가 유발된 C2C12 세포에 Dex를 처리하여 E3 ligase MuRF1의 발현 증가를 확인하였다. 동일한 배양조건에서, 108 CFU/mL의 농도를 갖는 시험 균주 배양액과 Dex를 함께 처리하여 근섬유 지름 및 MuRF1 단백질 발현을 확인하였다.
⑧ 비만 억제 효과 시험
3T3-L1 지방 전구세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지(Gibco, BRL)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 3T3-L1 지방 전구세포를 세포 배양용 6 well plate에 confluent 상태까지 배양한 후 10 μg/mL insulin, 0.1 mM dexamethasone 및 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)가 포함된 분화 배지(MDI)로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매 2일마다 10 μg/mL insulin이 포함된 배지로 교환하였다. 3T3-L1 세포를 충분히 지방 세포로 분화시킨 다음, 50 nM Triodothyronine(T3)을 처리하여 갈색 지방 세포로 전환시켰다. T3 처리군을 양성대조구으로, T3와 함께 시험 균주의 배양액을 처리하여 에너지 대사 촉진인자인 PPARα 및 PGC1α의 발현을 western blot 분석을 통해 측정하였다.
⑨ 콜레스테롤 동화능(흡수 저해능)
본 발명의 복합생균제의 콜레스테롤 동화능(흡수 저해능) 효과를 확인하기 위해 Rudel and Morris의 방법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 0.5% (w/v) oxgall(Sigma-Aldrich, USA)과 0.1 g/L water-soluble cholesterol (Sigma-Aldrich)이 첨가된 MRS 액체배지에 본 발명의 복합생균제 시작품 시료의 배양액을 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 24시간 혐기 배양(GasPak EZ Anaerobe Container System, Becton Dickinson and company, USA)한 후, 원심분리(9,950×g, 5분, 4℃) 하였다. 상기 원심분리를 통하여 얻어진 상등액 1 mL에 2 mL의 33%(w/v) KOH와 3 mL의 95%(v/v) 에탄올수용액을 첨가한 후 1분간 잘 혼합하고, 60℃의 수욕조에서 10분간 유지한 후, 이를 차가운 흐르는 물로 냉각시키고, 5 mL의 hexane을 첨가하여 잘 혼합하고 1 mL의 증류수를 첨가하여 재현탁시킨 후, 층 분리를 위해 상온에 10분간 방치하였다. 분리된 상층의 헥산(hexane층 3 mL를 깨끗한 시험관에 옮긴 후 질소가스로 농축시켰다. 농축시킨 시료에 4 mL O-phthaladehyde reagent(0.5 mg O-phthalaldehyde/glacial acetic acid 1 mL, Sigma-Aldrich)를 첨가하여 잘 혼합한 후, 상온에서 10분 간 방치하고, 2 mL의 진한 황산을 천천히 첨가하여 잘 섞어주고 10분 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑩ 통계 분석
실험 결과의 통계학적 분석은 SPSS 13.0 통계전용 소프트웨어인 'Independent-Sample-T-Test법'을 이용하여 분석하였고, 평균수치±기준차로 표기하였다. 또한, 다중비교는 LSD법으로 표기하였고, *, # : p<0.05, **, ## : p<0.01 수준의 차이를 나타냄을 의미한다.
<2-2> 실험 결과
① DPPH 법에 의한 항산화 활성
항산화성 물질은 자유라디칼(free radical)에 전자나 수소를 공여하여 복합체를 만들고, 1,1-다이페닐-2-피시릴 하이드라질(1,1-diphenyl-2-picyryl hydrazyl; DPPH)은 항산화성 물질로부터 전자 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하므로, 전자공여능(electron donating ability)으로부터 항산화 활성을 측정할 수 있다(Seo, Y.-H., Kim, I.-.J., Min, H.-K. and Park, S.-U. (1999) Fatty acid composition and antioxidative activity in wax corn (Zea mays L.) F1s. Kor. J. Food Sic. Technol. 31, 1415-1420).
본 발명의 복합생균제 시료의 배양액, 생균체와 사균체에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 검사한 결과는 표 1에 나타냈다. BHI broth를 음성 대조구로 사용하였고, 양성대조구로 Vitamin C를 사용하였으며, Vitamin C의 값을 100으로 했을 때, 얻어진 결과의 값을 백분율로 나타냈다. 본 발명의 복합생균제 시작품 개발에서 부형제로 사용한 원료들은 균주 혼합물의 항산화 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 조제하여, 얻어진 결과들은 균주혼합물의 활성으로 평가할 수 있다.
항산화 활성(DPPH) 라디칼 소거능 평가 결과
복합생균제 시료 종류1)
배양상등액 생균체 사균체
실시예1 42.1±3.6 53.6±1.8* 52.4±1.5*
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
1)결과 값은 양성대조구인 Vitamin C의 값을 100으로 했을 때, 얻어진 결과의 백분율 값을 나타낸다.
본 발명의 복합생균제 시료의 항산화 활성은 배양액에서 42.1%의 DPPH 라디컬 소거능을 나타냈고, 생균에서는 53.6%를 보였으며, 사균에서는 52.4%의 소거능 효과를 보였다. 선행연구에서 본 발명의 복합생균제의 주요 원료균주인 B. lichenifomis의 DPPH 라디컬 소거능이 54.9%(배양액)에서 64.2%(생균)과 65.7%(사균)로 매우 높아 시료의 DPPH 라디컬 소거능 활성에 주요한 원인균으로 작용하는 것으로 사료된다.
② H2O2로 유발한 산화적 스트레스에 대한 저항성
본 발명의 복합생균제의 H2O2로 유발한 산화적 스트레스에 대한 저항성을 시험한 결과는 표 2에 나타냈다.
생체 내 에너지 생산을 위한 호흡 대사 과정 중 일정량의 산소는 반응성이 높은 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이라는 유해 물질, 즉 자유 라디칼 (free radical)과 과산화수소(H2O2) 등을 생성하여 산화적 스트레스를 유발한다. 산화적 스트레스는 살아있는 생명체에 유해한 생화학 반응을 유발하고 죽상동맥경화증을 비롯한 각종 혈관 질환, 돌연변이, 암, 신경퇴행성질환, 면역기능 장애 및 노화의 원인으로 알려져 있다. 한편 일부 미생물은 Mn-SOD, Cu-SOD와 같은 항산화 효소를 생산하여 활성산소를 비독성화시키고, NADH, NADPH, glutathione 및 uric acid 같은 항산화제를 생산하여 hydroxyl radical을 분해할 수 있다고 보고되었다. Lac. plantarum, Lac. lactis와 같이 SOD를 생산하는 유산균들은 금속 이온을 킬레이팅하는 활성으로 갖고 있어 높은 항산화력으로 지질 과산화를 저해하고, 대장의 염증 개선에도 효과가 있는 것으로 알려졌다.
H2O2로 유발한 산화적 스트레스에 대한 저항성 시험 결과
균주 생육률 (%)1)
1 h 3 h 5 h
실시예1 38.4±1.2 62.7±1.6* 82.3±1.5**
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
1)결과 값은 H2O2에 일정 시간 노출시킨 후 회수한 균체의 생육 정도를 처리직 전의 균수를 기준으로 하였을 때의 백분율 값으로 나타낸 것이다.
H2O2 처리 1시간 후에 38.4%의 산화적 스트레스 저항성을 나타냈고, 시간이 경과할수록 생육이 회복되어 3시간 후에는 62.7%를 보였으며, 5시간 후에는 82.3%의 소거능 효과를 보였다. 시간의 경과에 따른 차이는 통계적인 유의성을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 복합생균제의 산화적 스트레스에 대한 저항성 효과는 원료균주들인 B. lichenifomis, B. velezensis, Lac. plantarum등의 균주들이 갖고 있는 활성 효과에서 기인한 것으로 사료된다.
③ 항염증 효과 시험
LPS는 면역세포에서 L-arginine으로부터 iNOS에 의한 NO 생성을 증가시키는데, 과도하게 생성된 NO는 염증반응을 심화시키고 만성 염증성 질환 및 자가면역질환, 암을 비롯한 여러 질병 발생의 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편, RAW264.7 대식세포는 LPS 자극에 민감하여 NO 생성이 잘 일어나므로 항염증 효과를 평가하는데 사용된다. Raw 264.7 대식세포에 LPS를 처리하여 iNOS를 유도 생성되는 NO에 대한 본 발명의 복합생균제 배양액을 5% 처리하였을 때의 NO 생성율과 Raw 264.7 대식세포 생존율을 표 3에 나타냈다. 음성대조구는 무처리구를 의미하고, 양성대조구는 LPS 단독 처리구로 시료 배양액을 처리하지 않은 것을 나타낸다. NO 생성 저해 지수(NO inhibition index)는 NO 생성량에 대한 세포 생존율을 무처리구 값인 1과의 차이를 나타낸 것으로, 값이 낮을수록 저해 효과가 낮은 것이고 지수 값이 높을수록 저해 효과가 높은 것을 말한다.
Raw 264.7 대식세포에서 본 발명의 복합생균제의 처리가 LPS로 유발한 NO 생성량 및 세포 생존율에 미치는 영향
NO 생성량 (%) 생존률 (%) NO 생성 억제 지수1)
음성대조구 100 100 1
양성대조구 127.3±3.2* 71.4±2.7* 0.441*
실시예1 109.1±1.8# 82.7±0.1# 0.736#
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
1)NO 생성 억제 지수 (Inhibition Index)는 NO 생성량에 대한 세포 생존율을 무처리구 값인 1과의 차이로 나타낸 것이다.
LPS에 의해 증가된 NO 생성량(127.3%)이 본 발명의 복합생균제 배양액 처리에 의해 109.1%로 감소되었고, 이때 세포 생존율은 71.4%에서 82.7%로 증가되고 NO 생성억제 지수 또한 0.441에서 0.736으로 나타나 본 발명의 복합생균제 배양액은 세포독성 없이 LPS에 의한 염증반응을 개선시킨 것으로 나타났다.
④ 면역 활성 평가
본 발명의 복합생균제 생균 및 배양상등액의 면역학적 활성을 시험한 결과는 표 4에 나타냈다.
본 발명의 복합생균제 시작품의 면역 활성 평가
Sample 호중구 활성 (%) 대식세포 활성 (%)
생균 배양상등액 생균 배양상등액
음성대조구 11.26±1.26 12.05±1.87 9.56±2.35 10.72±1.65
양성대조구1 678.24±18.74* 681.06±23.32*
양성대조구2 52.3±3.69* 54.36±2.74*
실시예1 445.14±11.57# 98.73±12.36# 490.71±21.31# 289.94±26.11#
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
산화적 손상에 대한 활성 시험에서 음성대조구(DHR) 및 양성대조구1(DHR+PMA)의 값과 비교했을 때, 본 발명의 복합생균제 생균은 양성 대조구의 678.24%와 배양상등액에 대한 681.06%보다 호중구의 활성을 높이지는 않아 445.14%와 98.73%를 나타내어 배양상등액의 활성은 생균에 의한 활성보다 낮은 것을 확인하였다. 대식세포 활성에서는 양성대조구2(beads)와 비교하였을 때 생균과 배양액 모두에서 활성을 높게 증가시켰다. 생균은 490.71%의 활성을 나타냈고, 대사물질을 처리하였을 때는 289.94%의 활성을 나타냈다. 생균의 처리가 배양액 내 대사물질을 처리하였을 때보다 호중구와 대식세포를 더 활성화 시키는 것으로 관찰되었다.
⑤ 아토피 피부염 개선 효과 시험
<Raw 264.7 대식세포에서 LPS에 의한 염증성 전사인자 NFAT5 및 사이토카인의 감소 효과>
Nuclear factor of activated T-cells 5(NFAT5)는 NFκB의 중요한 조절인자임이 규명되면서, 류마티스 관절염, 중상경화증, 그리고 당뇨병, 신장병증 등과 같은 염증성 질환에서 활성화됨에 따라 항염증제 연구의 주요 표적으로 알려졌다.
본 발명의 복합생균제 배양액 처리가 Raw 264.7 대식세포에서 LPS에 의한 염증성 전사인자 NFAT5 및 사이토카인의 감소 효과
시험 항목1)
NFAT5 사이토카인
TNF-α IL-6 IL-1β
음성대조구 - - - -
실시예1 +++ +++ +++ +++
1)시험 항목의 활성도 표시 - : 효과 없음, + : 약함 (30% 이하), ++ : 보통 (31 - 70%), +++ : 강함 (71-100%)를 나타냄
본 발명의 복합생균제 배양액이 LPS에 의한 NO 생성을 저해시킴에 따라, 그 기전을 규명하기 위해 염증성 전사인자인 NFAT5 및 사이토카인의 발현을 관찰한 결과는 표 5에 나타냈다. 시험 결과, Raw 264.7 대식세포에서 모든 시작품 시료는 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 저해시켜 염증성 전사인자인 NFAT5와 사이토카인인 TNF-α, IL-6과 IL-1β의 발현을 억제시키는 것으로 나타났다.
<TNF-α에 의한 피부 염증성 전사인자 및 사이토카인의 감소>
사람 유래 피부 각질형성 세포인 HaCat 세포에서 시험 균주들의 항염증 활성을 규명하였고, 아토피 피부염과 유사한 피부세포 내 TNF-α에 의한 피부염증성 모델을 구축함에 따라 시험 균주의 배양액 및 생균 처리가 아토피 피부염에 대한 항염증 효과를 시험한 결과는 표 6에 나타냈다.
HaCat 세포에서 TNF-α에 의해 유도된 피부 염증성 전사인자 및 사이토카인의 감소에 대한 본 발명의 복합생균제 배양액 및 생균의 효과
시험 항목1)
NFAT5 사이토카인
IL-6 IL-1β
배양상등액 생균체 배양상등액 생균체 배양상등액 생균체
음성대조구 - - - - - -
실시예1 ++ +++ ++ +++ ++ +++
1)시험 항목의 활성도 표시 - : 효과 없음, + : 약함 (30% 이하), ++ : 보통 (31 - 70%), +++ : 강함 (71-100%)를 나타냄
TNF-α로 유발한 피부염에 대한 본 발명의 복합생균제는 염증성 전사인자인 NFAT5의 단백질 발현을 감소시켰으며, 염증성 사이토카인인 IL-6과 IL-1β의 발현을 감소시켰다.
TNF-α에 의해 증가된 NFAT5 및 p65의 단백질 발현이 감소되며, 이는 IL-6와 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 감소를 초래한다. 즉, 본 발명의 복합생균제의 처리가 Raw 264.7 대식세포 내에서 NO 생성을 저해시키는 항염증 효과가 나타난 것(표 3)과 마찬가지로, 피부세포 내 염증 조절인자인 NFAT5 및 p65의 단백질 발현을 감소시켜 염증성 사이토카인의 유전자 발현 또한 감소시키는 것으로 사료된다.
⑥ 골 감소증 억제효과 시험
조골세포(Osteoblast)는 세포막에 염기성 인산 분해 효소 (ALP)를 가지고 있는데, 이 효소는 세포의 외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산은 운반, 세포 분열이나 분화를 조절하며 조골세포 활성의 표지인자로 알려져 있다. 파골세포(Osteoclast)는 단핵 대식세포로부터 분화되어 일반적으로 M-CSF와 TNF -related activation induced cytokine(TRANCE, RANKL)에 의해 조절되기 때문에 마우스 골수세포를 분리하여 M-CSF와 RANKL을 이용하여 파골세포 분화를 유도한다. 파골세포는 분화가 진행되면서 세포 융합에 따라 다핵의 성숙 파골세포를 형성하게 되고 이는 골 표면에 부착하여, 골을 흡수하는 작용을 한다, 또한 파골세포는 TRAP와 칼시토닌 수용체를 가지며, 산 생성이 활발한 특징을 가지기 때문에 TRAP은 파골세포의 표지인자로 사용된다.
본 발명의 복합생균제 배양상등액이 조골세포와 파골세포의 분화에 미치는 영향과 각 세포별 활성 지표인 ALP와 TRAP 효소의 활성에 미치는 영향을 시험한 결과는 표 7에 나타냈다.
본 발명의 복합생균제 시작품 배양액의 처리가 조골세포(Osteoblast)와 파골세포(Osteoclast)의 증식 및 골소실 관련 효소 ALP와 TRAP의 활성에 미치는 영향
조골세포(%) 파골세포(%)
생육률 ALP 활성 생육률 TRAP 활성
음성대조구 100 100 100 100
실시예1 105.4±1.3* 121.6±1.5** 81.2±0.8* 76.8±0.8**
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
본 발명의 복합생균제 배양상등액의 처리에 따른 조골세포의 증식률은 102.3%, ALP 효소 활성은 116.3%로 음성대조구보다 높게 나타났으나, 파골세포의 증식률은 84.6%, TRAP 효소 활성은 82.1%로 나타나 조골세포의 분화 증식률과는 정반대로 모든 시료에서 억제되었다. 본 발명의 복합생균제의 골 손실 억제 효과는 원료 균주 중 Lac. platarum이 파골세포 분화를 유도하는 TRAP 효소의 활성을 저해함으로서 파골세포의 성장을 억제해 골다공증 등 골 손실 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
⑦ 근손실 억제 효과 시험
C2C12 myoblast 세포에서 시험 균주들의 배양액이 근세포 내 단백질 감소를 억제하는 효과를 측정하기 위해 충분히 분화가 유발된 C2C12 세포에 Dexamethasone(Dex)을 처리하여 E3 ligase MuRF1의 발현 증가를 확인한 후, 동일한 배양조건에서, 108 CFU/mL의 농도를 갖는 시험 균주 배양액과 Dex를 함께 처리하여 근섬유 지름 및 MuRF1 단백질 발현을 확인하였다(표 8).
본 발명의 복합생균제 배양상등액의 처리가 Dexamethasone(Dex)에 의해 유발되는 단백질 감소 억제에 미치는 효과
Strain Items tested1)
MuRF1 Myotube 직경 (%)
대조구 +++ 43.1±0.5
실시예1 - 28.7±0.6**
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
1)시험 항목의 활성도 표시 - : 없음, + : 약함 (30% 이하), ++ : 보통 (31 - 70%), +++ : 강함 (71-100%)를 나타냄.
충분히 분화된 C2C12 세포에 Dex를 처리하여 근위축을 유도한 결과, MuRF1 단백질 발현이 증가하였고 이와 동일하게 단백질이 감소하여 myotube diameter가 약 42.6%로 나타났다. 그러나, 본 발명의 복합생균제 배양상등액을 처리한 결과, Dex에 의해 증가된 MuRF1 발현이 완전히 감소하였고, myotube diameter도 약 24.3%로 나타나 근섬유의 위축을 저해함에 따라 myotube diameter를 회복시켰다.
⑧ 비만 억제 효과 시험
지방세포는 에너지를 저장하는 백색 지방세포와 그와는 반대로 에너지원을 열로 방출하는 역할을 하는 갈색 지방세포로 나눌 수 있다. 갈색 지방세포는 체내 지방을 열로 분해함이 보고되면서 새로운 표적으로 연구되고 있는데, 최근 백색지방조직에서 갈색지방세포와 유사한 Beige 세포가 존재한다고 밝혀졌다(Kershaw & Flier, 2004). 갈색지방세포 분화과정은 여러 단계를 거쳐 multiple factor에 의해 이루어지는데, 특히 PGC-1/PPARα는 백색지방세포에서 갈색지방세포로의 분화전환을 유도하며 갈색지방세포와 유사하게 에너지를 소비하는 UCP-1이 발현됨에 따라 미토콘드리아로부터 에너지 대사를 촉진시킨다. 3T3-L1 전지방 세포가 지방세포로 분화될 때, PPARγ는 adipogenesis를 조절하는 핵심 전사인자로서 분화 후기에 높게 발현되어 세포 내 지방이 축적된다. 본 발명의 복합생균제 배양상등액의 처리가 3T3-L1 지방 전구세포가 지방 세포로의 분화과정에서 나타나는 lipid droplet 생성을 억제하는지를 시험하였다. 3T3-L1 전지방세포가 지방세포로 분화될 때, 보유 균주 배양액의 처리가 비만 관련 인자들의 발현과 지방구 축적(TG 함량 증가)에 미치는 영향을 시험한 결과는 표 9에 나타냈다.
본 발명의 복합생균제 배양액 처리가 3T3-L1 세포 내 Triglyceride 함량 및 비만 관련인자(PPARγ, PPARα, PGC1α, UCP-1)의 발현에 미치는 영향
Sample 시험 항목1)
Triglyceride (%) 전사인자
PPARγ PPARα PGC1α UCP-1
음성대조구 17.6±0.08 - - - -
양성대조구 100 +++ - - -
실시예1 58.6±0.08* - +++ +++ +++
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
1)시험 항목의 활성도 표시 - : 효과 없음, + : 약함 (30% 이하), ++ : 보통 (31 - 70%), +++ : 강함 (71-100%)를 나타냄.
시험 결과, 본 발명의 복합생균제 배양상등액의 처리가 비만 억제활성을 나타냈다. 양성대조구(MDI)을 100%로 하였을 때, 음성대조구(무처리구)의 TG 생성율은 17.6%를 나타냈고, 본 발명의 복합생균제는 58.6%의 triglyceride 생성률을 나타내었다. 본 발명의 복합생균제 처리는 triglyceride 축적 결과와 유사하게 PPARγ 발현이 감소되었기 때문에 본 발명의 복합생균제의 처리가 3T3-L1 지방 전구세포에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ 발현을 억제함으로서 lipid droplet 생성을 감소시켜 지방세포로의 분화가 억제되었을 것으로 사료된다.
에너지 대사 촉진 인자 PPARα/PGC1α 및 UCP-1 발현시험 결과, 무처리구에서는 지방축적 인자인 PPARγ, 에너지 대사 촉진 인자 PPARα, PGC1α 및 UCP-1은 모두 발현되지 않았으나, 본 발명의 복합생균제에서는 T3에 의해 유도된 PPARα 및 PGC1α 단백질 발현이 시료 처리에 따라 증가되었으며, 이는 UCP-1 발현을 촉진시켜 에너지 대사를 촉진시키는 것으로 확인되었다.
갈색 지방세포 분화 과정에서 PGC-1/PPARα의 백색 지방세포에서 갈색 지방세포로의 분화전환 유도와 UCP-1의 발현에 따라 미토콘드리아로부터 에너지 대사를 촉진시키는 것으로 사료된다.
⑨ 콜레스테롤 동화능(흡수 저해능)
본 발명의 복합생균제 시작품들의 콜레스테롤 동화능 효과를 확인한 결과는 표 10에 나타냈다.
본 발명의 복합생균제 배양액 처리에 의한 콜레스테롤 동화능(저해능) 변화
Sample 콜레스테롤 동화능 (%)
0.5% Oxgall 0.5% 결합담즙염
음성대조구 17.6±0.08 10.3±0.02
실시예1 78.2±0.15** 53.7±0.09**
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
콜레스테롤 동화능(흡수 저해능)은 인공 담즙산 조건인 0.5% Oxgall와 0.1 g/L water-soluble cholesterol이 첨가된 BHI 액체 배지에서 배양한 조건에서는 78.2%로 나타났고, 결합담즙염 형태인 0.5% (w/v) TDCA와 0.1 g/L water-soluble cholesterol이 첨가된 조건의 경우, 53.7%를 나타냈다. 콜레스테롤 동화능은 담즙염의 종류에 따라 차이를 보였으며, 결합 담즙염 형태인 sodium taurocholic acid를 첨가한 콜레스테롤 배지보다 oxgall을 첨가한 콜레스테롤 배지에서 더욱 높은 콜레스테롤 동화능을 보이는 것으로 확인되었다.
[실험예 3]
<대사증후군 동물모델을 이용한 복합생균제의 대사성 질환 개선효과 시험>
<3-1> 실험 방법
① 실험동물 및 사양
실험동물은 생후 6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 ㈜오리엔트바이오 (Sungnam, Korea)에서 구입하여 1주일 적응시킨 다음, 3군으로 나눈 후 표 11에서 제시한 바와 같이 제조한 식이를 5주간 급여하였다.
일반식이와 고지방식이 구성표
일반 식이 고지방 식이
탄수화물 Corn starch 44.875 34.375
Sucrose 15 15
Cellulose 5 5
지방 Lard - 10
Corn oil 10 10
Cholesterol - 0.5
단백질 Casein 20 20
비타민 믹스 1 1
미네랄 믹스 3.5 3.5
DL-methionine 0.3 0.3
Choline chloride 0.2 0.2
Taurocholic acid 0.125 0.125
합계 100 100
실험동물은 일반사료를 식이하는 정상대조군(음성대조구; n=7), 65% 지방함유 사료를 식이하는 고지방식이군(양성대조구; n=7), 고지방 함유사료와 본 발명의 복합생균제 급여군(실시예1, n=7) 등 3군으로 구분하였다. 본 발명의 복합생균제는 1일 1회 일정한 시간 (pm 5:00)에 구강을 통해 50 mg/마리 씩 투여하였다. 사양 기간 중 체중을 측정하여 체중 변화를 기록하였다.
② 채혈 및 조직 적출
채혈은 실험 종료 후 각각 에테르를 이용하여 마취한 후 복부 대정맥에서 채혈하였으며, 동시에 간 우엽의 일정한 부위를 적출하였다. 혈액은 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, -80℃에 동결보존 후 이후 실험에 사용하였다.
③ 혈중 지질대사에 미치는 영향
혈청 내 콜레스테롤 및 triglyceride 함량은 Enzymatic assay, high density lipoprotein cholesterol(HDL-C) 함량은 Selective inhibition, low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) 함량은 Enzymetric method의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다.
④ 동맥경화지수(AI) 및 심혈관위험지수(CRF)에 미치는 영향
동맥경화 지수(Atherogenic Index, AI)는 Fiordaliso의 계산법인 AI=([Total-C] -[HDL-C])/[HDL-C] 식을 사용하였다(Fiordaliso 등, 1995). 또한, 심혈관위험지수인 CRF(Cardiac Risk Factor)는 Friedewald의 계산법에 따라 총콜레스테롤의 양을 HDL의 양으로 나누어 계산하였다(Friedewald 등, 1972).
⑤ 간과 신장 기능에 미치는 영향
간 기능은 혈청 내에서 alanine transaminase(ALT), aspartate transaminase (AST) 활성도를 통해 측정하였고, 신장 기능은 혈청 내에서 creatinine, blood urea nitrate(BUN) 활성도를 측정하였다.
⑥ 혈청 adiponectin과 leptin 및 염증지표 측정
혈청 내 adiponectin과 leptin 농도는 각각 ELISA 방법으로 분석하였다. 혈청 내 염증 관련 지표인 C-반응성 단백질(C-response protein, CRP)은 CRP ELISA kit를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑦ 통계 분석
실험 결과의 통계학적 분석은 SPSS 13.0 통계전용 소프트웨어인 'Independent-Sample-T-Test법'을 이용하여 분석하였고, 평균수치±기준차로 표기하였다. 또한, 다중비교는 LSD법으로 표기하였고, *, # : p<0.05, **, ## : p<0.01 수준의 차이를 나타냄을 의미한다.
<3-2> 실험 결과
① 체중 변화
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이를 급여한 모델 동물에서 체중 증가에 미치는 영향을 측정한 결과는 표 12에 나타냈다.
고지방 식이와 본 발명의 복합생균제 급여가 사양 중 실험동물의 체중 증가에 미치는 영향
체중 (g) 체중 증가량(%) 식이 섭취량
(g/day)
실험 전 실험 후
음성대조구 25.2±0.25 35.2±0.36 38.4 23.5±2.4
양성대조구 26.1±0.31 43.5±0.45** 66.5 24.3±2.1
실시예1 25.7±0.2 37.2±0.31## 44.2 24.1±1.9
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
음성대조구(일반사료 급여구)는 실험 시작 시 25.2 g에서 종료 후 35.2 g으로 38.4%의 체중 증가를 나타냈고, 고지방식이 급여구(양성대조구)는 실험 시작 시 26.1 g에서 종료 후 43.5 g으로 66.5%의 체중 증가율을 기록했다. 고지방식이와 본 발명의 복합생균제 급여구(실시예1)는 실험 시작 시 25.7 g에서 39.2 g으로 44.2%의 체중 증가율을 나타내, 음성대조구에 비해서는 고지방식이로 인해 체중이 증가하였으나, 양성대조구에 비하여 체중 증가량이 22.3% 적게 나타났다. 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 복합생균제의 급여가 고지방식이로 비만을 유도한 실험동물의 생체 증가를 억제하는 효과를 가시적으로 확인할 수 있었다. 식이 섭취량은 3개의 실험군 모두 유의적인 차이가 없었다.
② 복합생균제 급여가 고지방식이 실험동물의 혈중 지질 대사에 미치는 영향
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이를 급여한 모델 동물에서 혈중 지질 대사에 미치는 영향을 측정한 결과는 표 13에 나타냈다.
고지방 식이와 본 발명의 복합생균제 급여가 사양 중 실험동물의 혈청 내 콜레스테롤 및 triglyceride의 변화에 미치는 영향
총 콜레스테롤 (mg/㎗) HDL-
콜레스테롤 (mg/㎗)		 LDL-
콜레스테롤 (mg/㎗)		 중성지방 (mg/㎗)
음성대조구 97.14±12.5 20.7±4.8 121.7±11.2 137.28±21.8
양성대조구 199.2±18.2* 18.7±2.7 177.8±18.3* 307.8±18.2**
실시예1 131.2±12.7# 33.2±2.8# 132.1±9.8# 157.2±12.9##
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
고지방 식이에 의해 비만이 유도되면 인슐린 저항성 및 고인슐린 혈증이 동반될 뿐 아니라, 간으로 유입되는 지방산이 증가되어 혈중 중성지방 농도 및 콜레스테롤 농도가 증가하게 된다. 이때, LDL-콜레스테롤은 혈관 벽에 쌓여 심혈관 질환과 뇌혈관 질환을 유도하는 동맥경화를 유발하고, HDH-콜레스테롤은 혈관 벽에 쌓인 LDL-콜레스테롤을 재빨리 간으로 운반한 뒤 분해시켜서 혈중 농도를 낮춤으로써 동맥경화를 예방할 수 있다.
본 발명의 복합생균제 급여에 따른 혈중 지질 대사를 측정한 결과, 고지혈증을 유발할 수 있는 혈중 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방의 농도가 양성대조구에서 높게 측정되었고 이에 반해 본 발명의 복합생균제 급여구(실시예 1)의 지질 농도는 정상 식이를 급여한 대조구와 유사하게 감소하여 양성대조구에 비해 유의하게 낮았다. 음성대조구의 총 콜레스테롤 농도는 97.1 mg/dL로 측정된 반면, 양성대조구는 199.2 mg/dL로 유의적으로 증가하였다. 실시예1(본 발명의 복합생균제 급여구)은 131.2 mg/dL로 검출되어 양성대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 이 결과는 LDH-콜레스테롤과 중성지방 농도에서도 동일하게 나타났다. 그러나, HDL-콜레스테롤이 양성대조구에서 18.7 mg/dL로 음성대조구(20.7 mg/dL) 보다 낮게 나타났으나, 실시예1에서는 33.2 mg/dL로 유의적으로 높게 나타났다.
② 복합생균제 급여가 고지방식이 실험동물의 혈중 동맥경화 지수와 심혈관 위험 지수에 미치는 영향
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이를 급여한 모델 동물에서 혈중 동맥경화 지수와 심혈관 위험 지수에 미치는 영향을 측정한 결과는 표 14에 나타냈다.
고지방 식이와 본 발명의 복합생균제 급여가 사양 중 실험동물의 혈중 동맥경화 지수와 심혈관 위험 지수의 변화에 미치는 영향
동맥경화 지수 심혈관 위험 지수
음성대조구 3.69±0.02 4.7±0.1
양성대조구 9.65±0.08* 10.6±0.12*
실시예1 3.2±0.07# 4.2±0.1#
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
동맥경화 지수 및 심혈관 위험 지수는 음성대조구에 비해 양성대조구에서 각각 2.6배, 2.2배 증가한 반면, 실시예1(본 발명의 복합생균제 급여구)에서는 대조구보다도 낮게 측정되어 각각 유의적으로 3배, 2.5배 감소되었다. 이 결과는 이전 보고에서 in vitro와 in vivo 실험에서 엔테로코커스 훼시엄과 락토바실러스 존소니를 시험 균주로 쥐의 콜레스테롤 감소 효과를 확인한 연구 결과와 유사하게 나타났는데, 본 발명의 복합생균제의 주요 원료균인 엔테로코커스 훼시엄 등의 활성에 의한 것으로 사료된다. 따라서 본 발명의 복합생균제를 급여한 실험동물의 혈중 지질농도가 음성대조구와 유사하게 현저히 감소한 것은 본 발명의 복합생균제에 의한 유효 대사 기전 혹은 대사물질(metabolites)이 혈중 총 지질 함량을 감소시켜 고지혈증 유발을 억제해 동맥경화 지수나 심혈관 위험 지수를 개선시킨 것으로 사료된다.
③ 복합생균제 급여가 고지방식이 실험동물의 간과 신장 기능에 미치는 영향
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이를 급여한 모델 동물에서 혈중 간 기능 지표인 alanine transaminase(ALT), aspartate transaminase (AST) 활성도와 신장 기능 지표인 혈청 내 creatinine, blood urea nitrate(BUN) 활성에 미치는 영향을 측정한 결과는 표 15에 나타냈다.
고지방 식이와 본 발명의 복합생균제 급여가 사양 중 실험동물의 혈중 동맥경화 지수와 심혈관 위험 지수의 변화에 미치는 영향
간 기능 지표 신장 기능 지표
AST
(IU/L)		 ALT
(IU/L)		 크레아티닌 (mg/㎗) BUN
(mg/㎗)
음성대조구 141.63±11.7 85.2±7.2 0.89±0.04 23.2±2.1
양성대조구 216.8±12.9 87.8±8.9 1.32±0.03 20.1±1.9
실시예1 189.7±17.2 87.2±7.5 1.12±0.03 22.1±1.8
간 조직의 손상은 세포 내부에 존재하는 효소가 혈액으로 유출되는 것을 측정함으로써 확인할 수 있는데, 혈청 중 AST와 ALT의 상승은 간 손상으로 인한 간세포의 파괴가 진행되면서 아미노기 전이 효소가 혈중으로 나와 높게 나타나는 것이므로, 간 세포의 파괴 및 변성의 지표가 될 수 있다. 본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이에 따른 간 손상에 미치는 영향을 살펴보기 위해 AST와 ALT를 측정한 결과, AST 농도가 양성대보구에서 216.8 IU/L로 검출되었으나 음성대조구는 141.63 IU/L로 검출되었고, 실시예1에서는 189.7 IU/L로 검출되어 HFD가 가장 높게 나타났으나 모두 정상 범위로 유의적이진 않았다. ALT 농도는 음성대조구는 85.2 IU/L, HFD는 87.8 IU/L, HFD+D-F에서는 87.2 IU/L로 검출되어 유의적인 차이가 없었다. 따라서, 3개 시험구 모두 실험 동안에는 간 기능에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이에 따른 신장 기능에 미치는 영향을 살펴보기 위해, 혈중 크레아티닌과 BUN을 측정한 결과, 크레아틴의 경우 음성대조구는 0.89 mg/dL, 양성대조구는 1.32 mg/dL, 본 발명의 복합생균제 급여구(실시예1)에서는 1.12 mg/dL로 검출되었고, BUN은 음성대조구에서 23.2 mg/dL, 양성대조구는 20.1 mg/dL, 실시예1에서는 22.1 mg/dL로 검출되었다. 두 시험에서 음성대조구가 가장 낮았고 양성대조구가 가장 높았으나, 간 기능 지수 결과와 마찬가지로 3개의 실험군 모두 혈액 생리학적 정상 범위의 값을 나타내어 통계학적으로 유의적인 차이가 나타나진 않았다.
④ 복합생균제 급여가 고지방식이 실험동물의 혈청 adiponectin과 leptin 및 염증지표 변화에 미치는 영향
본 발명의 복합생균제 급여가 고지방식이를 급여한 모델 동물에서 혈청 내 adiponectin(염증반응 억제인자), leptin(식욕억제 인자), 염증 관련 지표인 C-반응성 단백질(C-response protein, CRP)에 미치는 영향을 측정한 결과는 표 16에 나타냈다.
고지방 식이와 본 발명의 복합생균제 급여가 사양 중 실험동물의 혈청 내 adiponectin, leptin 및 CRP의 변화에 미치는 영향
Adiponectin (ng/㎖) Leptin (pg/㎖) CRP (ng/㎖)
음성대조구 215.7±24.5 0.52±0.3 71.7±5.5
양성대조구 68.3±19.2** 0.68±0.1 98.3±9.2*
실시예1 189.5±27.5## 1.56±0.3# 73.5±4.5#
*, # : p<0.05, **, ## : p<0.01
Adiponectin은 근육과 간의 수용체에 작용하여 염증 반응을 저해거나 인슐린의 작용을 증강시켜 근육이나 간의 지방산 산화를 촉진하고, 중성지방의 축적을 감소시켜 인슐린 감수성을 향상시킨다. 동맥경화나 심혈관계 질환 등에 대한 방어인자로 알려져 있는 adiponectin은 비만한 사람이나 제2형 당뇨병 환자에서는 그 농도가 감소되는 것으로 나타났다. 본 발명의 복합생균제 급여가 혈청 내 adiponectin 농도에 미치는 영향을 살펴본 결과, 음성대조구의 215.7 ng/dL에 비해 양성대조구에서는 유의적으로 감소하여 68.3 ng/dL로 나타났다. 그러나 실시예1에서는 양성대보구에 비해 약 2.7배 가량 증가하여 189.5 ng/dL로 나타났다.
Leptin은 뇌에서 포만감을 인지하여 식욕과 체중을 조절한다. Leptin을 생산하지 못하거나 수용체 결함을 가진 경우 심한 비만이 발생한다는 보고를 통해 leptin이 에너지 소비를 촉진시켜 향상성 유지에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 본 발명의 복합생균제 급여구(실시예1)의 leptin 농도는 1.56 pg/dL로 검출되어 음성대조구(0.52 pg/dL)와 양성대조구(0.68 pg/dL)에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타나, 본 발명의 복합생균제 급여에 의해 증가한 adiponectin과 leptin 농도가 체중 증가 억제와 지질대사 개선 효과에 영향을 미친 것으로 판단된다.
체지방 조직 내에 과잉으로 축적된 지방은 지방세포에서 특이적으로 발현되어 유도된 염증유발 내분비 물질을 분비시켜서 염증반응으로 인한 대사성 질환을 유발하게 된다. 염증반응 지표인 C-반응성 단백질(CRP)은 지방섭취량이나 지방 세포에서 발현되어 체지방량이 높을수록 농도가 증가한다. 실험 결과, CRP 농도는 음성대조구의 71.7 ng/mL에 비해서 양성대조구는 98.3 ng/mL로 유의적으로 증가하였다. 그러나 실시예1에서는 73.5 ng/mL로 음성대조구와 유사하게 나타나 양성대조구에 비해 유의적으로 낮은 농도를 나타내었다. CRP는 간에서 생성되는 비특이적인 급성기 단백질로서 각종 염증반응을 유도함으로 비정상적인 지질대사로 인한 심혈관계 질환 및 당뇨병의 발병을 예측할 수 있는 지표 하나로도 이용되고 있다. 즉, 본 발명의 복합생균제 급여를 통해서도 비만으로 인한 염증반응을 저해함으로써 체지방량을 비롯한 비정상적인 지질 대사를 조절하여 비만으로 인한 여러 대사성 질환을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
[실험예 4] 복합생균제의 probiotics 특성 시험
<4-1> 실험 방법
실시예 1의 본 발명의 복합생균제의 생균제(Probiotics)로서의 특성을 알기 위해 내산성, 내담즙성 및 내열성을 측정하였다. 항균 활성은 세균 4종(Salmonella enterica serovar Typhi(ATCC19430), Escherichia coli O157:H7(ATCC 43895), Staphylococcus aureus(ATCC25923), Listeria monocytogenes(ATCC 19113)), 효모 1종(Candida albicans ATCC 24433) 및 곰팡이 1종(Aspergilus fumigatus ATCC 96918)을 대상으로 Paper disk법으로 조사하였다. 상기 세균 및 진균은 ATCC로부터 구입하여 사용하였다.
내산성 시험은 각각 pH 2로 맞춘 PPS(0.2% Photassium phosphate solution)에 총균수를 약 7.0 log CFU/mL으로 맞춘 균주 현탁액을 1% 접종한 후 2시간 동안 배양 후 평판배지 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 총 생육 균수를 계수하였다.
인공 담즙은 BHI Broth에 Oxgall을 1.0% 농도로 첨가하여 인공 담즙을 준비하여 사용하였다. 상기 준비한 인공 담즙에 8.0 log CFU/mL의 배양액을 1% 접종한 후 2시간 배양한 후 평판배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하여 총 생육 균수를 계수하였다.
내열성 시험은 36.5℃에서 20시간 배양(BHI broth 사용)하여 최소 7 log CFU/mL 이상 배양한 후 70℃의 온도 조건(Waterbath 사용)에서 10분간 처리하고 평판배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하여 총 생육 균수를 계수하였다.
본 발명의 복합생균제 시료(실시예1)를 BHI broth에 접종한 후 36.5℃에서 약 20시간 배양하여 최소 7 log CFU/ml 이상 배양한 다음 현탁액을 원심분리한 후 상등액을 취하고 필터링하여 시험 용액을 준비한 후 하기 항균 활성 측정에 사용하였다. 시험 세균 4종 Sal. enterica serovar Typhi, E. coli O157:H7, Sta. aureus, Lis. monocytogenes을 BHI 평판배지에 7 log CFU/ml 이상 도말하고 상기에서 준비한 시험시료 용액에 paper disk를 충분히 담군 후 중앙에 부착한 후 37℃에서 20시간 배양 후 paper disk를 중심으로 생성된 clear zone의 지름을 측정하여 항균성 여부와 정도를 측정하였다. 시험 효모인 Can. albicans는 sabouraud dextrose(Difco Laboratories) 평판배지에, 시험 곰팡이 Asp. fumigatus는 PDA 평판배지에 각각 6 log CFU/mL로 도말한 후 시험 시료용액에 paper disk를 충분히 담군 후 중앙에 부착한 후 25℃에서 72시간 배양 후 paper disk를 중심으로 생성된 clear zone의 지름을 측정하여 항균성 여부와 정도를 측정하였다.
<4-2> 실험 결과
본 발명의 복합생균제의 내산성, 내담즙성과 내열성을 측정한 결과는 표 17에 나타내었다.
본 발명의 복합생균제의 일반특성 시험 결과
일반 특성
내산성 (pH 2) 내담즙성 (1.0% bile) 내열성 (70℃, 10분)
실시예1 4.54 ± 0.04 5.13 ± 0.03 6.29 ± 0.12
본 발명의 복합생균제는 pH 2의 인공 위산 조건에서 4.54 log CFU/mL 수준의 생육을 나타내었고, Oxgall 1.0%를 갖는 인공 담즘산 조건에서는 3.36 log CFU/mL 수준에서 5.13 log CFU/mL 수준의 생육을 나타내었으며, 70℃에서의 내열성은 6.29 log CFU/mL 수준을 나타냈다.
본 발명의 복합생균제의 배양 상등액에 대한 항균 활성 시험 결과는 표 18에 나타내었다.
본 발명의 복합생균제의 항균성 시험 결과
항균 활성 (배양액 원액)
Salmonella enterica
(ATCC19430) 		Escherichia
coli O157:H7
(ATCC43895)		 Staphylococus
aureus
(ATCC25923)		 Listeria monocytogenes
(ATCC19113)		 Candida
albicans
(ATCC24433)		 Aspergillus
fumigatus
(ATCC96918)
실시예1 ++ ++ + ++ - -
상기 표 의 '-' 또는 '+'는 생균 저해환의 지름크기를 기준으로 결정한 것으로, '-'는 항균 또는 항진균 활성이 없는 것을 의미하고, '+'는 저해환 지름 크기가 14.0 mm 미만인 것을 의미하며, '++'는 저해환 지름 크기가 14.0 - 17.0 mm 범위에 있는 것을 의미하고, '+++'는 저해환 지름 크기가 17.0 mm을 초과하는 것을 의미한다.
시험 균주 6종에 대한 항균 활성 실험결과, 원료 균주의 항균 활성이 균주혼합물에서도 활성을 나타내는 것으로 나타났으나, 새로운 활성은 발견되지 않았다. 본 발명의 복합생균제 배양액은 Sal. enterica serover Typhi와 E. coli O157:H7, 그리고 L. monocytogenes(ATCC19113)에 생육저해 활성을 나타냈으나, S. aureus 균주에 대해서는 약한 활성을 나타냈으며, Can. albicans와 Asp. fumigatus에서는 억제활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 본 발명의 복합생균제 중 바실러스 벨레젠시스 균주가 30 중량% 범위, 바실러스 리체니포미스 균주가 30 중량% 범위에서, 엔테로코커스 훼시엄 균주가 30 중량% 범위와 락토바실러스 플란타럼(KCTC3108) 균주가 10 중량%에서 혼합하였을 때 상기 4가지 병원성 세균에 대한 항균 활성이 증가하는 것을 나타낸다. 항균 활성을 나타내는 생균제제에 대한 많은 보고가 있는데 이는 주로 박테리오신과 같은 항균 물질의 생산에 따른 것으로 비록 활성의 차이는 있지만 본 발명의 복합생균제가 항세균 활성은 있으나 항진균 활성은 없는 것으로 사료된다. 상기 일반특성과 항균 활성 결과들을 분석해 볼 때, 본 발명의 복합생균제는 프로바이오틱 생균으로서의 기본적인 특성을 가지는 것으로 사료된다.
<제조예 1> 복합생균제제의 제조
본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제가 함유된 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 제제는 복합생균제를 통상의 동결건조 방법으로 건조한 다음, 부형제와 혼합하여 제조하거나 캡슐화시켜 제조한다.
<제조예 2> 발효유의 제조
당 분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제를 이용하여 발효유를 제조한다. 원유(74.41%)와 탈지분유(6.45%) 등을 혼합하여 배양 종균과 본 발명의 복합생균제를 넣어 배양시켜 배양액(1X109 CFU/mL)을 제조한다.
<제조예 3> 식음료(건강기능식품) 조성물의 제조
<3-1> 음료의 제조
음료는 당 분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 하기에 제시된 제제의 재료를 혼합함으로써 제조된다. 꿀 522 mg, 치옥토산아미드 5 mg, 니코틴산아미드 10 mg, 염산리보플라빈나트륨 3 mg, 염산피리독신 2 mg, 이노시톨 30 mg, 오르트산 50 mg, 본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제 배양 상등액, 물 200 mL
<3-2> 분말제의 제조
본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제의 동결건조 분말(1×109 CFU/g) 20 mg, 유당 100 mg, 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 분말제를 제조한다.
<3-3> 정제(tablet)의 제조
본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제의 동결건조 분말(1×109 CFU/g) 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<3-4> 캡슐제의 제조
본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제 동결건조 분말(1×109 CFU/g) 10 mg, 결정성 셀룰로오스 3 mg, 락토오스 14.8 mg, 마그네슘 스테아레이트 0.2 mg를 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
<3-5> 혼합 분말제의 제조
본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제 동결건조 분말(1×109 CFU/g) 1 g, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 μg, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B1 0.13 mg, 비타민 B2 0.15 mg, 비타민 B6 0.5 mg, 비타민 B12 0.2 μg, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 μg), 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 μg, 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg)을 통상의 건강기능식품 제조 방법에 따라 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다. 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<제조예 4> 사료 조성물의 제조
사료용 조성물은 옥수수 42 g, 대두박 28 g, 소맥 15 g, 우지 4 g, 당밀 3 g, 인산칼슘제 2 g, 석회석 0.4 g, 소금 0.2 g, 본 발명의 실시예 1에서 수득한 복합생균제 10 g을 혼합함으로써 제조된다.
상기와 같이, 본 발명의 대사성 질환 예방, 개선 및 치료 효과를 갖는 본 발명의 복합생균제 및 이의 배양액은 높은 항산화성과 산화적 스트레스 저항성, 항염증 효과를 갖고 있으며, 대사성 질환을 유발하는 비만과 혈액 내 생리생화학적 지표를 개선시켜 대사성 질환의 예방이나 개선이 요구되는 건강기능식품이나 치료가 요구되는 의약품, 가축이나 반려동물의 대사성 질환 개선을 위한 사료 첨가제나 동물용 의약품 등 산업적으로 넓게 활용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제로서,
    상기 복합생균제는 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 리체니포미스, 엔테로코커스 훼시엄 및 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하며,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합생균제는 바실러스 벨레젠시스 30 중량%, 바실러스 리체니포미스 30 중량%, 엔테로코커스 훼시엄 30 중량% 및 락토바실러스 플란타럼 10 중량%을 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 복합생균제.
  3. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 미생물 제제로서,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 미생물 제제.
  4. 삭제
  5. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 생균활성 조성물.
  6. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 음용수 첨가제로서,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방 또는 개선용 음용수 첨가제.
  9. 제1항의 복합생균제 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제로서,
    상기 대사성 질환은 골다공증 및 근감소증 중 선택되는 어느 하나 이상인 대사성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
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