CN108660124A - 一种基于核磁共振技术提高黑曲霉a-葡萄糖苷酶活力的方法 - Google Patents

一种基于核磁共振技术提高黑曲霉a-葡萄糖苷酶活力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的方法，属于生物工程领域。本发明通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉生产α‑葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α‑葡萄糖苷酶的酶活力。

Description

一种基于核磁共振技术提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高真菌产酶的方法，特别是一种基于核磁共振技术来筛选真菌重要代谢物并以此调整发酵条件以达到有效提高真菌产酶活力的方法。
背景技术
低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide，IMO)是一类功能性寡聚糖，具有重要的生理功能，如促进肠道有益菌增殖、降低血脂；提高抗龋齿性，作为病人的保健甜味剂。其他作用包括农作物增产促进剂、抗病毒和真菌临床治疗剂、化学合成间体等。
目前利用酶法合成低聚异麦芽糖产量仍旧是供不应求。获得低聚异麦芽糖的方法主要有糖化酶的逆催化作用和α-葡萄糖苷酶的转苷作用。利用糖化酶的逆催化作用是在高浓度的葡萄糖溶液中发生逆转催化，将葡萄糖缩合为低聚异麦芽糖，但此过程低聚糖产量低，不到35％，且生成产物复杂周期长故不适合工业化生产。利用α-葡萄糖苷酶的转苷作用以麦芽糖为底物水解成两分子葡萄糖，释放出葡萄糖残基被以α-1,6糖苷键连接到另一葡萄糖分子而形成异麦芽糖，继续进行转苷作用生成低聚异麦芽糖，此生产工艺相对成熟，应用较广。目前国外α-葡萄糖苷酶已实现工业化生产，其最高酶活力达到30U/mL活力单位(以甲基-α-葡萄糖苷苷为底物，每分钟生成1μmol的葡萄糖的酶量为标准活力单位U)，而国内α-葡萄糖苷酶产品均为国外少数几个大的酶制剂厂生产。
定量核磁共振技术是一种可以通过准确定量代谢物的绝对浓度值来获得物质内部信息的一项技术。现有技术中有利用核磁共振技术制备样品快速方便无损的优点分析不同地区姜黄属的次级代谢产物差异，及从番泄叶根部分离出的镰刀菌的筛选出不同于人工培养条件下的毒素产物。同时利用该技术检测植物在感染病菌会引发的一系列代谢物变化，了解植物防御的自然机制从而来设计基因改良型提高其抗病性等。
本发明所要解决的技术问题提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶的活力，旨在解决传统培养基优化方式中存在的耗时长成本高的问题，采用基于核磁共振技术对代谢物的相对定量，快速筛选到真菌胞内差异代谢物。该技术前处理简便快速，实现对真菌产酶过程中的各代谢物全面分析。结合统计学分析法，找出影响目标酶活的重要前体物质，并通过后期前体物质的外源添加以提高目标酶活。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核磁共振技术判别黑曲霉产酶过程的重要代谢物，并通过代谢组学来筛选提高黑曲霉的α-葡萄糖苷酶活力的前体物质，从而提高黑曲霉的α-葡萄糖苷酶活力。
本发明提供了一种提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法，通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的酶活力。其中，所述一种或多种代谢物包括：葡萄糖、海藻糖、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙醇、醋酸盐，肌酸、胆碱、甜菜碱。
本发明所述提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法包括以下步骤：
1)制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品；
2)对待测样品进行1HNMR分析，获得所述黑曲霉菌体的核磁共振分析谱图；
3)以2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸为内标，采用分段积分方法，根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量；
4)通过比较获得影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物。
进一步地，所述根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量包括利用TOPSPIN3.5对1H NMR谱图进行相位及基线矫正，经MestReNova12.0.1进行分段积分后再导入SIMCA-P13.0进行多元数据分析处理。
进一步地，本发明还公开了所述方法在提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力中的应用。
附图说明
图1是galA1-NR和NR-galA2片段的质粒提取。
其中M：DL10,000bp maker 1：galA1-NR质粒2：NR-galA2质粒。
图2是菌落PCR挑取重新转化的5个单菌落转化子进行PCR验证。
其中M：250bp maker 1：阳性转化子2-5：假性转化子。
图3是galA1-NR和NR-galA2表达盒的扩增。
其中M：250bp maker 1：galA1-NR(2,693bp)2：NR-galA2(2,797bp)。
图4是黑曲霉转化子两个片段Ver-1和Ver-2的1％琼脂糖凝胶电泳条带。
其中1，2：第一个转化子Ver-1和Ver-2；3，4：第二个转化子Ver-1和Ver-25，6：第三个转化子Ver-1和Ver-2；7，8：阴性对照Ver-1和Ver-2。
图5中(a)：黑曲霉HE01和ΔgalA的菌体干重变化曲线；(b)：α-葡萄糖苷酶酶活变化；(c)：糖化酶酶活变化。
图6是600MHz 1HNMR谱图化合物指认。
其中，δH8.5～5.0ppm虚线框放大了4倍。
图7是OPLS-DA分析黑曲霉HE01和ΔgalA的代谢物。
其中，每一个点代表一个样品。
具体实施方式
【实施例1】黑曲霉galA缺失突变株的构建
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的菌株、材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中使用的黑曲霉HE01是生产糖化酶的工业菌株，来源于湖北立业公司，E.coli Top10F购自Invitrogen公司，诺尔丝菌素购自北京索宝来科技公司。
本实施例使用的主要仪器：超净工作台，SW-CJ-1FD，苏净安泰；全自动高压灭菌锅，HVE-50，Hirayama；PCR扩增仪，2720，ABI；琼脂糖凝胶电泳仪，POWER/PAC 300，Bio-Rad；凝胶成像系统，Universal Hood II，Bio-RAD；低温培养箱，LTI-700，EYELA；振荡摇床，SKY-200B，SUKUN；酶标仪，MODEL550，Bio-RAD。
本实施例使用的菌株和质粒如下表1：
菌株和质粒 特征或遗传性状 Source
HE01 高产糖化酶 湖北立业公司惠赠
E.coliTop10F galA1-NR、NR-galA2片段 本发明购建，用于研究目的可向公众公开
pGEMT-Vector 氨苄青霉素抗性(AmpR) 购自Promega
培养基及溶液配制
察氏培养基(g/L)：蔗糖30g，NaNO32g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，FeSO40.01g，固体加琼脂17g，半液体加琼脂0.5g。121℃，20min灭菌。LB培养基(g/L)：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，固体添加琼脂15g。121℃，20min灭菌。
原生质体再生培养基：1×STC 50mL，10×葡萄糖10mL，察氏培养基40mL，单独配制，121℃，20min灭菌后再混合。
1×STC溶液()：山梨醇216.80g，1M Tris-HCl(pH 7.5-8.0)10mL，1M CaCl2100mL，加去离子水定容至1L。
60％PEG 4000：1M Tris-HCl(pH 7.5)10mL，1M CaCl250mL，PEG4000600g，加去离子水定容至1L。
本实施例所用引物序列如下表2所示：
菌体培养及保种：
(1)大肠杆菌复苏培养与保种
取-80℃超低温冰箱保存的菌种置于冰盒上缓慢解冻待溶解后用枪头吸取少量菌液在平板上划线，37℃恒温培养过夜。进行敲除表达盒质粒复苏时，在氨苄青霉素抗性平板涂布培养过夜。挑取平板上新长出来的单菌落到LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养12-16h。
保种：将LB液体培养获得的菌液与80％的灭菌后甘油混和均匀(比为4：1)，置于-80℃超低温冰箱保存。
(2)黑曲霉的复苏培养与保种
取-80℃超低温冰箱保存的菌种置于冰盒上缓慢解冻待溶解后用枪头吸取少量菌液在平板上划线，32℃恒温培养过夜。挑取平板上新长出来的单菌落到倒入察氏培养基液体培养基中，置于32℃恒温培养箱中静置培养5-7d。
筛选黑曲霉敲除表达菌株阳性转化子时，取200～500μL转化后的原生质体至含有诺尔丝菌素的平板上，涂板后培养3-5d观察阳性转化子生长情况。黑曲霉的液体培养从察氏液体培养基吸取少量菌丝球置于察氏固体平板上，32℃恒温培养箱培养5-7d。
保种：将上述液体培养获得的菌液与80％的保种甘油混和均匀(比为4：1)，置于-80℃超低温冰箱长期保存。
大肠杆菌质粒提取：质粒提取采用OMEGA质粒小量提取试剂盒说明书进行。
大肠杆菌转化：取-80℃超低温冰箱保存的感受态细胞置于冰上缓慢解冻，取50μL感受态细胞，与10μL连接产物混合，用枪轻微吸打混匀，立即冰浴30min；将EP管放入42℃热激90s后，冰浴2min；加入1mL液体LB培养基，37℃，100rpm摇床复苏1h；注意：1mL液体LB培养基中无需加入抗性物质，否则不利于复苏。5,000rpm，离心2min，去部分上清后混匀(剩余体积>200μL)，取200μL菌液涂布带有抗性的LB平板；37℃培养箱过夜培养。
菌落PCR：用枪头挑取平板上单菌落分别至装有一管有5μL灭菌水PCR管、另一管5μL液体LB的PCR管中，分别轻轻混匀。将一管装有用灭菌水溶解的菌液的PCR管按照说明书中体系混样后放入PCR仪中。以单菌落为模板进行PCR扩增，分别利用引物galA-1F、galA-MkR扩增galA-NR序列，引物galA-MkF、galA-4R扩增NR-galA2序列。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，根据若序列大小是否与预期一致，初步判断为阳性转化子。将另一管含有液体LB溶解的阳性转化子的菌液置于含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃恒温摇床过夜培养12-16h。阳性转化子过夜培养后提取质粒，送去金维智公司测序。
敲出表达盒galA1-NR、NR-galA2的扩增：对连接在pGEM-T Easy载体的galA1-NR、NR-galA2片段进行扩增。以经过验证及测序正确的质粒为模板，利用引物galA-1F、galA-MkR扩增galA-NR序列，引物galA-MkF、galA-4R扩增NR-galA2序列，PCR体系如下表3所示。
反应参数设置如下：
95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸10s，72℃延伸7min，进行30个循环；16℃保存。
PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
PCR产物切胶回收：采用TakaraDNA的切胶回收试剂盒说明书操作。
黑曲霉原生质体制备及转化：挑取察式固体平板上单菌落接种至液体培养基，32℃恒温培养3-5d。用灭菌后的纱布过滤菌液，收集菌丝体后，用1M山梨醇溶液进行洗涤一次，10mL 1M MgSO4溶液重复洗涤两次，称取菌丝体湿重。按质量比10：1加入sigma纤维素酶，如1g湿菌丝体加入100mg酶，再加入10mL 1M MgSO4，32℃，80rpm，酶解4-5h。2h后开始每0.5h镜检。采用血球计数板确定原生质体浓度，待约1.0×108个/mL。进行原生质体过滤，滤液在15℃，3,200rpm，离心20min弃上清。分别用预冷的0.6M KCl和1×STC溶液进行洗涤，15℃，3,200rpm，离心20min弃上清。用1×STC溶液重悬沉淀，轻轻混匀，置冰浴备用。
原生质体的转化：取200μL(1～2×108个/mL)的原生质体悬浊液，48℃孵育5min后立即至冰上冰浴30s后，室温放置5min。将原生质体与5μgDNA(galA1-NR和NR-galA2片段)混合，室温放置15min。加入2mL 60％PEG4000，轻轻混匀，室温静置15min。3,200rpm，离心10min，弃上清液。用5mL 1×STC重悬原生质体沉淀，轻轻混匀。27℃恒温静置过夜。将过夜后的5mL原生质体3,200rpm，离心15min，去上清，再与25mL原生质体再生培养基混匀，进行诺尔丝菌素硫酸盐的抗性平板培养。32℃恒温培养3-5d，可做一个阴性对照。待平板上长出白色菌丝用枪头挑取单菌落菌丝，接种至含诺尔丝菌素硫酸盐的新鲜察氏培养基平板，32℃培养3-5d。进行初步筛选。
黑曲霉突变体的鉴定：采用Takara的Lysis Buffer for Microoganism toDirect PCR试剂盒进行真菌菌体PCR。取50μLTakara Lysis Buffer for Microoganism于灭菌的PCR管中，用灭菌后的牙签挑取单菌落于溶液中。设置PCR仪温度80℃，热变性15min进行菌丝体裂解。室温下3,000～5,000rpm离心1min，取1～5μL的上清液作为PCR反应的模板以裂解后的基因组DNA为模板，以引物Ver-1F、Ver-1R进行PCR扩增阳性转化子galA1-NR片段的上下游之间约1500bp的验证序列Ver-1，引物Ver-2F、Ver-2R扩增阳性转化子NR-galA2片段的上下游之间约1500bp的验证序列Ver-2。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
结果
galA敲除表达盒重新转化大肠杆菌质粒提取：对连接在pGEM-T Easy载体的galA1-NR、NR-galA2片段的重新转化大肠杆菌过夜培养后进行提取质粒，pGEM-T Easy载体(2,867bp)，galA1-NR(2,693bp)、NR-galA2(2,782bp)，质粒是环状结构，其超螺旋结构比线性DNA的在电荷作用下泳动速度较慢，结果如图1所示。对提取到的质粒采用NanoDrop测浓度，galA1-NR质粒的浓度为132.3ng/μL，NR-galA2的质粒浓度为102.4.ng/μL。
菌落PCR验证galA敲除表达盒：将重新转化的单菌落随机挑取5个进行菌落PCR，以引物galA-1F、galA-MkR扩增galA-NR序列，引物galA-MkF、galA-4R扩增NR-galA2序列，结果只有一个单菌落阳性，获得阳性转化子进行过夜摇菌进行后续实验或保种。菌落PCR挑取重新转化的5个单菌落转化子进行PCR验证，结果如图2所示。
galA敲除表达盒扩增及纯化：对菌落PCR阳性转化子进行过夜培养后重新提取质粒送去测序结果正确后以galA1-NR、NR-galA2片段连接在pGEM-T Easy质粒为模板，高保真酶进行PCR扩增获得上下片段，galA1-NR(2,693bp)、NR-galA2(2,797bp)。结果如图3所示。
黑曲霉突变株的鉴定：对诺尔丝菌素硫酸盐的新鲜察氏培养基平板上随机挑取3个转化子进行真菌菌落PCR进行验证，结果如图4所示。Ver-1(1,767bp)、Ver-2(1,852bp)，对获得的黑曲霉突变体扩大培养后进行后续代谢组研究或保种。
【实施例2】黑曲霉galA缺失的代谢研究
本实施例使用的主要仪器与试剂：超导傅里叶核磁共振谱仪，AVANCEⅢ600MHZ，Bruker；超声破碎细胞仪，VCX500，宁波新芝生物科技股份有限公司；真空干燥机，ModulyoD，ThermoFisher；真空旋转浓缩仪，SC110A-230，ThermoFisher；荧光定量PCR仪，qTOEWN2.0，耶拿；Deuterium oxide(D2O)(99.9％atom％D)，ALDRICH；TSP(2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸)，Aflar；0.1M，pH 7.4磷酸缓冲液(10％D2O，0.02％TSP)：TRIzol试剂，100ml，Life。
本实施例使用的菌株如下表4：
菌株 特征或遗传性状 来源
HE01 产糖化酶 湖北立业公司
ΔgalA 敲除galA基因 实施例1获得
培养基及培养条件：
察氏培养基与实施例1相同。
种子培养基(g/L)：玉米浆20g，糊精120g，DF103为0.75g，硫酸铵20g(单独配制，121℃，20min灭菌后混合)。
产酶发酵培养基(g/L)：玉米淀粉268g，玉米浆53.6g，豆饼粉35.7g，DF103消泡剂3.57g，耐高温α-淀粉酶5g，硫酸铵10g和磷酸二氢钾9g(单独配制，121℃，20min灭菌后混合)。
菌体生物量与酶活的最适时间的确定：从种子培养基中吸取1mL菌液至100mL产酶发酵培养基中，每个样品建立3个平行样；在34℃，150rpm的恒温摇床培养菌株，每隔24h，取1ml发酵液置于一预先称重的干燥离心管中，8,000rpm，15min离心，弃去上清液；为了去除其他溶质，采用1mL去离子水洗涤沉淀三次，离心弃去上清液后放入60℃的烘箱内烘干至恒重，再减去离心管重量即为菌体干重。
酶活测定：从种子培养基中吸取1mL菌液至100mL产酶发酵培养基中，每个样品建立3个平行样。在34℃，150rpm的恒温摇床培养菌株，从第72h起，到第192h每隔24h，取发酵液2mL，10,000rpm，5min离心，上清液为待测粗酶液，保存在4℃以备分析。
本实施例中α-葡萄糖苷酶的酶活测定采用pNPG法。α-葡萄糖苷酶的酶活测量：50μL，10mM4-硝基-D-吡喃葡萄糖苷pNPG(CAS：3150-24-1，10mM溶解在pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲液)与900μL，pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲先37℃预热10min再加入50μL粗酶液混匀，50℃水浴反应15min后再立即加入预冷的1mL 1mol/L Na2CO3进行终止反应，混匀在室温静置5min后测试在405nm下的吸光值，再根据pNP稀释成不同浓度与相应的吸光度值的标准曲线(R2>0.999)计算水解后生成的pNP含量，计算出α-葡萄糖苷酶的活力大小。在上述条件下，一个酶活单位表示：在pH 5.5，60℃下每分钟水解pNPG生1μmol的pNP的酶量为标准活力单位U。α-葡萄糖苷酶的酶活(U/mL)＝(OD405-0.004)/0.013×V总/V样/T×稀释倍数
本实施例中糖化酶活使用AGI(淀粉葡萄糖糖苷酶)单位表示：在pH 4.3，60℃下每分钟水解可溶性淀粉生成1μmol葡萄糖的酶量为一个AGI。糖化酶酶活测量：将230μL，0.1g/L对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(CAS：3767-28-0，0.1g/L溶解在pH4.3醋酸-醋酸钠缓冲液)先37℃预热5min，再与20μL粗酶液混匀，37℃水浴反应20min后再立即加入预冷的100μL 3mol/LNa2CO3进行终止反应，混匀在室温静置5min后测试在405nm下的吸光值，根据上述步骤将稀释成不同浓度的糖化酶标品与相应的吸光值做标准曲线(R2>0.999)：糖化酶酶活＝稀释倍数×(OD405+0.01)/0.008
菌体培养及代谢物提取：从种子培养基中吸取1mL菌液至100mL产酶发酵培养基中，每个样品建立6个平行样。在34℃，150rpm的恒温摇床培养菌株，选取最适时间的发酵液进行快速固液分离，(离心条件：5,000rpm，20min)获得菌体菌体。菌体使用液氮迅速冷冻，于-80℃保存。将-80℃保存的菌体真空冷冻干燥8小时，干燥后的菌体等量称重(如50mg)转移到2ml离心管中，加入1.2ml甲醇/水溶液(2/1；v/v/，-20℃)，混合物冰浴超声(超声30s，间隔30s，循环10min)，离心(1,600g，4℃，10min)。取上清转移到新的5ml离心管中，剩余的固体沉淀再次冰浴超声提取，重复2次。将3次提取物上清液合并，利用旋转浓缩仪除去甲醇，其余物质真空冷冻干燥24小时以上。干燥后的提取物融入于用0.1M，pH 7.4磷酸缓冲液550μL(内含10％D2O(v/v)，0.02％TSP)离心10min后取500μL上清液转移到5mm核磁管中进行核磁共振(NMR)测试分析。
核磁共振NMR测试条件：样品使用AVANCEⅢ600MHz的超导核磁共振谱仪上测定，测定频率1H 600.13MHz，以重水锁场，采用noesypr1d序列预饱和水信号，测试温度298K(25℃)，扫描次数64，延迟时间5.0s；傅里叶转换线性窗函数为0.3Hz；相调节、基线调节及峰校正均为手动。内标为TSP(2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸)。
核磁共振1H NMR数据处理：利用TOPSPIN3.5(Bruker Biospin,Germany)对1H NMR谱图进行相位及基线矫正，再导入MestReNova12.0.1(Mestrelab Research,Santiago deCom-postella,Spain)进行处理。以δ0.003ppm(1.8Hz)为积间距对δ0.05～9.00ppm区间进行分段积分，其中去除δ4.532～5.153ppm(残余水峰)。每组数据都以总峰面积总和为1进行归一化处理，得到2700个积分区间和12个样品(2700×12矩阵)。再运用SIMCA-P 13.0(Umetrics,Sweden)进行多元数据分析处理。
多元数据分析：主成分分析(PCA分析)，用得分图(Scores Plot)来呈现结果，其中得分图中每一个点代表的是1HNMR谱，即一个样品的所有代谢物。得分图将不同样品间存在的差异呈现在一个主成分(PC)空间，再采用正交最小二乘(OPLS-DA)用得分图S-plot图确定对分类有显著贡献的变量。得分图S-plot中对潜在具有差异的变量位于区间顶端，根据软件内置方法判别Par(VIP>1)，即是可能具有差异的变量。根据分析结果，找出差异性代谢物。
结果
菌体生物和酶活的变化：工业生产菌株黑曲霉HE01为了后期大量合成胞外蛋白，在前期生长过程(96h)较一般野生型菌体生长(30h)长，在培养到第168h胞外蛋白酶活量最大。菌体在后期分泌大量蛋白可在培养基中被积累，但菌体在后期出现细胞降解而出现菌体干重减少。黑曲霉产酶时期发生在其生物量变化后，前期菌体处于生长，菌体中后期生长缓慢，但酶活依然在快速增加。结果如图5所示，黑曲霉ΔgalA的生物量低于HE01，但无明显差异；糖化酶和α-葡萄糖苷酶在均在168h达到最高，成为后续代谢组样品选择的最佳时期。
核磁共振谱图及信号归属和化合物指认：结合参考文献、HMDB、Chenomx NMR Suit8.1以及核磁图谱的化学位移、偶合常数和峰形等，对黑曲霉的代谢产物进行指认，一共归属出26个化合物(图6)，为初级代谢物。这些物质包括处于谱图的低场区(δH10.0～5.50ppm),包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、酪氨酸(Tyrosine)芳香族及甲酸(Formate)，延胡索酸(Fumarate)。糖区(δH5.50～3.10ppm)信号多且强，有很多重叠情况，根据文献及软件对比，鉴定出的化合物有：β-葡萄糖(β-Glucose)，4.65(d,J＝8.0Hz)；α-葡萄糖(α-Glucose)，5.24(d,J＝3.8Hz)及海藻糖(Trehalose)，由于糖类结构复杂且相近，所以糖类重叠很严重，很难鉴定出更多糖类化合物。脂肪区则位于高场区(δH3.10～0.00ppm)，主要包括氨基酸和乙醇，如亮氨酸(Leucine)、缬氨酸(Valine)、苏氨酸(Threonine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酸(Glutamate)等。代谢物编号与所对应的具体物质及相应的1H信息可以从表5得到。有些物质可能第出检测限或者存在于光谱中被其他更丰富的物质所掩盖。
表5对黑曲霉HE01和突变株ΔgalA的600MHz 1H NMR化合物的信号归属
从核磁谱图6可以看出来，糖区峰重叠峰占面积较大；其次包括甜菜碱、胆碱、磷酸胆碱、肌酸在内有关的胆碱类化合物；低场区的芳香族氨基酸峰面积都较小；氨基酸中以丙氨酸的峰面积最大且没有重叠，初步判定丙氨酸是蛋白合成的重要的物质。在galA基因缺失引起的代谢物变化来解释说明糖化酶蛋白合成减少会促进α-葡萄糖苷酶等其他酶蛋白的合成增加这个现象，将对照组6个样本和实验组6个样本的谱图数据归一化处理，先进行PCA主成分分析，反映了组内和组间的差异，为进一步突出组间差异，以便于后续寻找差异代谢物，再进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对数据进行处理。
差异代谢物分析：首先进行了非监督的PCA主成分分析对黑曲霉HE01与ΔgalA代谢物进行分析，其中PC1的解释率46.2％为，PC2解释率为33.0％，再次采用有监督正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)进行数据处理，由得分图中显示出将HE01与ΔgalA能够很好地分离开来(图7)。根据SIMCA-P软件的规定的VIP﹥1，见表6，即认为是潜在的具有差异的，我们共找到11个差异代谢物，包括两种构型的葡萄糖，海藻糖；氨基酸类丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸；乙醇、醋酸盐；肌酸、胆碱、甜菜碱。
差异代谢物与α-葡萄糖苷酶的相关性：我们在黑曲霉出发株HE01和突变株ΔgalA在产α-葡萄糖苷酶达到最高峰时期(168h)快速提取胞内代谢物，在产酶最高时期，各种氨基酸代谢和能量代谢都是迅速转换的，尤其是与酶活相关的重要氨基酸，有研究发现，黑曲霉在产酶过程中会先储存一些“廉价”氨基酸，一旦获得“稀有”氨基酸就快速合成目标蛋白。通过1HNMR，我们共归属到26个代谢物，采用分段积分法的相对定量获得出发株和突变株的11种差异代谢物包括葡萄糖，海藻糖；丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸；乙醇、醋酸盐；肌酸、胆碱、甜菜碱。
缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸可被认为是“廉价”氨基酸，可由丝氨酸、甘氨酸等转化而来；丙酮酸、琥珀酸、延胡索酸参与TCA循环与能量代谢有关；芳香族氨基酸由于在胞内含量较低，采用分段积分方法可能不适用。故筛选到11种与产α-葡萄糖苷酶相关的代谢物。这11种代谢物，有研究发现，以葡萄糖为碳源时，黑曲霉产α-葡萄糖苷酶会比以淀粉或麦芽糖为碳源时产率低，是由于葡萄糖存在碳源阻遏现象，葡萄糖在突变株的相对含量升高，可能是胞内葡萄糖被利用较少而相对积累下来；海藻糖是黑曲霉在利用玉米淀粉发酵过程中产生对抗各种严酷的环境以保持有机体的生物活性的物质，作为一种防御机制；醋酸盐和乙醇是糖酵解产生丙酮酸在无氧条件下脱羧而成也是与环境相关。肌酸、胆碱、甜菜碱属于生物碱类可能与细胞膜成分相关。故11种差异代谢物中，筛选到3种差异氨基酸，丙氨酸(α-葡萄糖苷酶的蛋白序列中数量最多的氨基酸残基)、谷氨酸(可转化其他氨基酸的前体氨基酸)、甘氨酸(与胆碱类转化相关)。这3种差异代谢物可能与α-葡萄糖苷酶的活力相关。
表6差异代谢物的1H归属及变化趋势
metabolites δ1H(ppm) VIP Coefficient(r) Trend
β-Glucose(21) 4.65 1.4 0.404086 ↑
α-Glucose(22) 5.24 1.2 0.390302 ↑
Trehalose(20) 5.2 3.0 0.570563 ↑
Alanine(6) 1.48 2.4 0.490419 ↑
Glutamate(11) 2.34 1.5 0.604946 ↑
Glycine(19) 3.58 4.6 -0.834894 ↓
Ethanol(4) 1.17 8.9 -0.930913 ↓
Acetate(7) 1.92 1.3 -0.475422 ↓
Sarcosine(13) 2.74 4.1 -0.563741 ↓
Betaine(18) 3.28 1.6 0.528507 ↑
Choline(23) 3.21 2.3 0.523754 ↑
注：↑代表该代谢物在ΔgalA比HE01中含量升高；↓代表该代谢物在ΔgalA比HE01中含量降低
【实施例3】黑曲霉HE01和突变株ΔgalA的氨基酸添加发酵
本实施例对具有显著差异的3种氨基酸：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)及谷氨酸(Glu)进行验证。具体从种子培养基中吸取1mL菌液至100mL产酶发酵培养基中，每个样品建立3个平行样。添加丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)及缬氨酸(Val)这4种氨基酸的添加量为40mmol/L，至少进行三次重复实验。在34℃，150rpm的恒温摇床培养菌株，培养到第168h测α-葡萄糖苷酶的酶活和糖化酶活。
酶活测定：培养到第168h后取发酵液2mL，10,000rpm，5min离心，上清液为待测粗酶液，保存在4℃以备分析。
酶活测定方法与实例1中α-葡萄糖苷酶酶活与糖化酶酶活测定方法相同。
添加氨基酸后酶活结果分析：添加丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸，黑曲霉出发株HE01的α-葡萄糖苷酶活分别提升42％、50％、35％，糖化酶分别升高6％、13％、11％。黑曲霉突变株ΔgalA的α-葡萄糖苷酶活分别提升30％、8％、23％，糖化酶分别升高2％、7％、5％。说明丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸这三种氨基酸对α-葡萄糖苷酶影响更大。galA缺失会表现出α-葡萄糖苷酶活升高，但相较于出发株，整个能量代谢转化速率较慢，故添加氨基酸后，对出发株α-葡萄糖苷酶的提升效果更明显，黑曲霉出发株HE01和突变株ΔgalA添加氨基酸后具体酶活数据见表7、表8。
表7黑曲霉出发株HE01添加氨基酸后酶活变化
Trement α-Glucosidaseactivities(mU/mL) Glucoamylaseactivities(AGI/mL)
Control 117±0.5 796±15.7
Alanine 167±2.1c 846±28.4a
Glycine 176±2.5c 899±30.8c
Glutamate 159±4.8c 883±18.6c
Valine 105±0.9 782±25.3
注：a代表显著性(p<0.5)；b代表显著性(p<0.01)；c代表显著性(p<0.001)
表8黑曲霉突变株ΔgalA添加氨基酸后酶活变化
Trement α-Glucosidaseactivities(mU/mL) Glucoamylaseactivities(AGI/mL)
Control 136±0.5 828±19.7
Alanine 178±1.2c 847±8.6
Glycine 147±1.2c 889±20.6c
Glutamate 167±1.2c 869±8.6b
Valine 119±1.0 801±16.4
注：a代表显著性(p<0.5)；b代表显著性(p<0.01)；c代表显著性(p<0.001)
现在市售的α-葡萄糖苷酶产品大多数国外引进，酶活大小为30U/mL，目前国内针对黑曲霉产α-葡萄糖苷酶的研究表明，野生型黑曲霉产α-葡萄糖苷酶的酶活不到1U/mL，将来源于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的基因在毕赤酵母中异源表达，通过基因工程手段，达到摇床恒温培养条件下重组蛋白酶活达1.5U/mL。本实施例中突变株ΔgalA在恒温摇床培养168h，α-葡萄糖苷酶活达到136mU/mL，较黑曲霉出发株在相同条件下酶活达到117mU/mL，提高16％。黑曲霉HE01作为高产糖化酶工业菌株，具备了良好的胞外蛋白分泌系统。敲除galA基因，降低能量和物质流向合成糖化酶的通量，这样以淀粉为碳源时，分解淀粉的其他胞外蛋白水解酶的合成会增加，α-葡萄糖苷酶作为淀粉降解过程中另一个主要水解酶类，表现出升高的现象，本实施例中，通过基于核磁共振的筛选到影响目标酶活的代谢物，丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸是影响α-葡萄糖苷酶的关键代谢物，后续调节发酵液成分，或分子技术手段改造靶点提高目标酶活。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种基于核磁共振技术提高黑曲霉a-葡萄糖苷酶活力的方法
<130> DJCN1810135
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> galA-1F
<400> 1
cgagagcagc ttgaagaact agtgg 25
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(52)
<223> galA-MkR
<400> 2
caagggtaaa tcagggactg tctgcatcga actggatctc aacagcggta ag 52
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> galA-MkF
<400> 3
cctaatgtctc gtccgttcac aagcggttca gggcagggtc gttaaatag 50
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> galA-4R
<400> 4
cgaagcagtg tccataccat aagg 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> Ver-1F
<400> 5
tagactacac cgacttcctc aatgc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
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ccagcatttg cgtgtattgt gtc 23
<210> 7
<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
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<400> 7
gagaagaaga gacgaggaga tggag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> Ver-2R
<400> 8
ccttctcctt catcacatcc gtagt 25

Claims (9)

1.一种提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法，其特征在于，通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的酶活力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种代谢物包括：葡萄糖、海藻糖、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙醇、醋酸盐、肌酸、胆碱、甜菜碱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品；
2)对待测样品进行1H NMR分析，获得所述黑曲霉菌体的核磁共振分析谱图；
3)以2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸为内标，采用分段积分方法，根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量；
4)通过比较获得影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品的步骤为：取待测黑曲霉菌体，用液氮冷却后干燥，加入甲醇水溶液进行冰水浴超声提取，离心后取上清，浓缩、冷冻干燥并用缓冲液溶解，离心取上清于核磁管中备用。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量包括利用TOPSPIN3.5对1H NMR谱图进行相位及基线矫正，经MestReNova12.0.1分段积分后再导入SIMCA-P13.0进行多元数据分析处理的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品包括黑曲霉出发菌株和黑曲霉galA缺失突变株的待测样品。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述一种或多种代谢物包括：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法在提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力中的应用。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节黑曲霉的发酵培养液成分包括在产酶发酵培养基中外源添加丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸中的一种或多种。
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