CN114410479A - 一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用。该甘蔗内生真菌属于层出镰刀菌属，名称为Fusarium proliferatum 15，保藏号为GDMCC No：62048，该菌株于2021年11月10日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明中的甘蔗内生真菌发酵后提取得到的多酚具有良好的抑菌活性，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌、单增李斯特菌等病原菌具有明显抑制作用，可用于食品、化妆品及兽药临床方面。

Description

一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用

技术领域

本发明涉及甘蔗内生真菌，特别涉及一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用。

背景技术

21世纪以来内生真菌的研究重点在于对植物内生真菌的研究与开发利用。我国的植物资源丰富多样，利用内生菌资源库，发掘出代谢产物中低毒、高效、低廉的抗癌药物、抗菌药物、杀虫剂、抗氧化剂、植物激素、免疫抑制剂等具有非常重要的意义。

我国中医自古以来就将甘蔗(Saccharum sinensis Roxb)视为清热解毒的良药，现代科学研究表明甘蔗的主要活性成分为多酚。研究表明甘蔗多酚具有促进肠胃消化、增强免疫、抗氧化、强化血管壁、防止动脉硬化、降血压和抑制癌细胞生长等多种生理药理活性，是多酚研究领域的研究热点。目前甘蔗多酚的制备主要以甘蔗为基础原料，而甘蔗的生长过程受环境因素影响较大，且周期较长，这造成甘蔗多酚的成本过高，进而限定了甘蔗多酚的规模化应用。此外，多酚类化合物结构复杂，使其很难通过一般的化学合成来完成。因此，迫切需要寻求一种替代的方式来快速获得甘蔗多酚。

近年来的研究表明植物内生真菌是各种结构新颖生物活性成分的重要资源库，能产生与其共生植物相同/类似的生物活性成分。与植物提取制备这类化合物相比，通过植物内生真菌获得具有明显的优点，如菌体生长速度快、易于培养、便于下游加工、节约成本和绿色可持续等。目前，已有多种内生真菌多酚被报道，如生姜内生真菌(Aspergillusaustroafricanus)、棕榈树根部内生真菌(Penicillium citrinum TDPEF34)等。这些研究提示甘蔗内生真菌或许是制备甘蔗多酚、克服其当前生产问题的新方向，然而以甘蔗内生真菌生产甘蔗多酚至今仍未有报道。

目前研究表明，已从植物内生真菌分离出多种的活性物质(抗病毒类、抗菌类等)，其中一些新物质具有特殊的生物活性。对植物内生真菌产生的次级代谢物质的研究表明其作用近似寄生植物，其中一部分拥有药用的潜力，一部分在经过抗菌实验后确定具有不同程度的抑制多种常见的致使动植物患病的病原菌生长的活性，可用于为病害生物防治进行微生物制剂的研发。

选取食源性甘蔗的不同组织部位筛选的内生真菌进行形态和分子生物学鉴定，并对其产生的多酚的抗菌活性进行研究。发掘甘蔗内生真菌中具有高活性的宝贵天然药物资源，以期为人类健康发展做出应用的贡献。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株甘蔗内生真菌，是采用内生真菌分离纯化技术从甘蔗植物活体中分离、纯化得到。

本发明的另一目的在于提供所述甘蔗内生真菌的培养方法。

本发明的又一目的在于提供所述甘蔗内生真菌在生产多酚方面的应用。

本发明的再一目的在于提供所述甘蔗内生真菌和/或所述甘蔗内生真菌生产多酚在抑制病原菌方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种甘蔗内生真菌，属于层出镰刀菌属，名称为Fusarium proliferatum(甘蔗内生真菌)15，保藏号为GDMCC No：62048，该菌株于2021年11月10日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的甘蔗内生真菌菌株(Fusarium proliferatum)15的核糖体内转录间隔区(ITS)和5.8S核糖体RNA编码基因(5.8SrDNA)如SEQ ID NO.1所示。

一种培养所述甘蔗内生真菌的方法，具体步骤为：将所述的甘蔗内生真菌接种于培养基中，于25±1℃条件下进行培养。

所述的培养基为常规固体培养基和液体培养基中的任意一种；优选为PDA培养基和PDB培养基中的任意一种；更PDA固体培养基优选为(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)和PDB液体培养基(马铃薯葡萄糖肉汤培养基)中的任意一种。

所述的培养的时间优选为60～80小时。

所述的甘蔗内生真菌在生产多酚方面的应用。

一种利用上述甘蔗内生真菌生产多酚的方法，包括如下步骤：将上述甘蔗内生真菌通过发酵培养，离心、取上清低温冷冻干燥、水溶、固相小柱萃取、醇洗、萃取液收集、真空干燥，得到所述的多酚；具体包括如下步骤：

(1)将所述的甘蔗内生真菌菌株活化培养后，进行种子液培养，再将得到的种子液进行发酵培养；

(2)将步骤(1)发酵培养后得到的发酵液低温离心，取发酵上清液进行低温冷冻干燥浓缩，然后将浓缩液用水溶解后获得的提取液上固相小柱，再将固相小柱进行醇洗，并收集洗脱液，最后将洗脱液进行真空干燥，得到所述的多酚。

步骤(1)中所述的活化培养为采用平板固体培养方法(平板划线培养方法)，于25±1℃条件下活化培养60～80小时，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA固体培养基)。

步骤(1)中所述的种子液培养为采用PDB液体培养基，于25±1℃、150rpm条件下培养60～80小时。

步骤(1)中所述的发酵培养为采用PDB液体培养基，于25±1℃、150rpm条件下培养5～8天，种子液接种量为体积百分比1～5％。

步骤(2)中所述的低温离心的条件为：4℃、8000～10000rpm下离心10～20min；优选为：4℃、10000rpm下离心10min。

步骤(2)中所述的真空干燥的条件为：60℃条件下真空干燥20小时。

步骤(2)中所述的固相小柱的操作步骤如下：采用甲醇5ml活化，5ml 50％(v/v)的乙醇溶液平衡后，将提取液上固相小柱，再用0.5倍体积的蒸馏水淋洗，最后用1倍体积的甲醇洗脱，并收集洗脱液。

一种甘蔗内生真菌生产的多酚，通过上述任一项所述的方法制备得到。

所述的甘蔗内生真菌和/或所述的甘蔗内生真菌生产多酚在在制备抑制病原菌的生物制剂方面的应用。

所述的病原菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；优选为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌和单增李斯特菌中的至少一种，通过甘蔗内生真菌发酵后提取得到的多酚具有良好的抑菌活性，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌等病原菌具有明显抑制作用，因此，可将所述甘蔗内生真菌产生的多酚应用于抑制病原菌；更优选为大肠杆菌和单增李斯特菌中的至少一种。

所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli K99)ATCC HB-8178。

所述的金黄色葡萄球菌优选为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26003。

所述的沙门氏菌优选为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028。

所述的单增李斯特菌优选为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111。

一种抑制病原菌的生物制剂，通过所述甘蔗内生真菌和/或所述甘蔗内生真菌生产多酚制备得到。

所述的甘蔗内生真菌、甘蔗内生真菌生产多酚以及抑制病原菌的生物制剂中的至少一种在制备食品、化妆品或兽药中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过如下流程提取所述甘蔗内生真菌多酚：菌株活化-种子液培养-发酵培养-发酵液真空冷冻干燥-浓缩液水溶-固相小柱萃取-萃取液收集-真空干燥-获取甘蔗内生真菌多酚，该甘蔗内生真菌菌株产生的多酚对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌、单增李斯特菌等病原菌具有显著抑制活性作用，能很好地应用于抑制病原菌，在食品、化妆品及兽药临床上具有广阔的推广应用价值。

2、本发明的提取方法工艺简单易行，条件温和、易于控制，为大规模提取甘蔗内生真菌产生的多酚提供了新路径，同时为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用提高多酚产量提供新的思路。

附图说明

图1是菌株15固体培养2、4、6、8、9和10天的形态学特征图；其中，A：培养时间为2天；B：培养时间为4天；C：培养时间为6天；D：培养时间为8天；E：培养时间为9天；F：培养时间为10天。

图2是菌株15的显微镜形态学特征图(倍数为100倍)；其中，A：固体培养基的菌丝图；B：液体培养基的菌丝图；C：液体培养基的孢子图。

图3是菌株15对大肠杆菌K99为大肠杆菌(Escherichia coli K99)ATCC HB-8178的抑菌结果图。

图4是菌株15对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028的抑菌结果图。

图5是菌株15对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26003的抑菌结果图。

图6是菌株15对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111的抑菌结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，本发明所用原材料、试剂等均可通过市售获得。

本发明实施例中涉及的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)和马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB液体培养基)均为常规市售培养基。

本发明实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli K99)ATCC HB-8178已在专利文件(CN201410149031.3、一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用)中公开(文中名称为：致病性大肠杆菌(E.coli K99，ATCC hb-8178))，也可以通过常规市售获得。

本发明实施例中涉及的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26003和单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111均为常规市售菌株。

实施例1菌株15的筛选、分离纯化以及鉴定

一、菌株15的筛选及分离纯化

初筛：从新鲜甘蔗表皮、叶、甘蔗果茎等部位进行消杀(消毒和杀菌)处理后置于含有双抗(150mg/mL的青霉素和120mg/mL的硫酸链霉素)PDA固体培养基培养(25℃、静置5～7d)，挑取菌落转接到装有含双抗(150mg/mL的青霉素和120mg/mL的硫酸链霉素)的PDA液体培养基的摇瓶培养5～7d，对发酵液进行分析(酒石酸亚铁分光光度比色法测定：参考国标GB8313—87中的3.4.1)，初步筛选出共17株能够产多酚类物质的菌株，然后选择其中产多酚含量最高的一株(编号菌株15，多酚含量约为2g/L)进行后续的实验。菌种用50％甘油进行保藏。其中：消杀处理流程如下：①用清水清洗；②用75％乙醇淋洗1min；③用无菌水冲洗(3～5遍)；④用6％(w/v)次氯酸钠溶液浸泡(5min)；⑤用无菌水冲洗5次。

二、菌落形态特征观察

1、甘蔗内生真菌菌株Fusarium proliferatum 15的固体培养特征：

在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA固体培养基)上于25±1℃培养2～10天，培养结果如图1所示：培养2d，4d，6d，8d，9d，10d后，菌落生长速度较慢；显示基内菌丝在培养基内生长使得整个培养基变为玫红色后，气生菌丝再在培养基全部表面上生长形成菌落，单一菌落覆盖范围小，菌落成片连接遍布整个培养基，部分成累圆形凸起；呈网状，絮状，绒毛状；边缘啮齿状；浓密，不易挑起，透明度低；正面初期白色，后期呈黄褐色、粉红色，背面初期玫红色，后期棕红色、深褐色。

2、甘蔗内生真菌Fusarium proliferatum 15的液体培养特征：

(1)所用培养基为PDB液体培养基，摇瓶培养7天，培养温度为25±1℃；

(2)发酵培养特征：培养1～2天，未见明显生长现象，培养第三天，有深红色菌丝出现；培养第4～5天，菌丝增多，培养5天于100倍显微镜下观察到的菌丝形态图如图2所示；由图2可见，菌丝缠绕在一起，形成树干状菌丝簇，而孢子散落在菌丝簇周围或附着在菌丝体上；培养第6天，培养瓶瓶壁粘附有深红色菌丝，培养液中有1～2mm深红色丝球；培养第7天，菌丝球增大到2～4mm。

3、甘蔗内生真菌菌株Fusarium proliferatum 15的形态特征为：

(1)无性繁殖，菌丝体密集，成树枝状，侧生大量带梗孢子囊，孢子囊中最多可含22个孢子；

(2)有性世代，未发现。

三、菌株15的鉴定

1、DNA提取：使用TSINGKE植物(DNA提取试剂盒(通用型)，具体步骤如下：

(1)将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μL Buffer BL，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；

(2)取样本干燥组织(不大于20mg)，加入液氮充分研磨；研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μL Buffer gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；

(3)加入150μL Buffer gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min；

(4)12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；

(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000rpm/min离心30s，弃废液；

(6)向Spin Column中加入500μL Buffer Pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；

(7)向Spin Column中加入500μL Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；

(8)重复操作步骤7；

(9)将Spin Column放回Collection Tube中，12,000rpm/min离心2min，开盖晾干1min；

(10)取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μL TE Buffer(65℃预热TE Buffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm/min离心2min。

2、DNA扩增：

(1)扩增引物序列如下：

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

(2)提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系各组分如下：1×TSE101金牌mix 45uL，ITS5(10pmol)2uL，ITS4(10pmol)2uL，DNA模板1ul。

以上扩增体系按以下扩增程序扩增：预变性：98℃2min；循环阶段：98℃10s，56℃10s，72℃10s/kb 35cycles；延伸阶段：72℃5min；保存阶段：4℃。

将PCR扩增产物(片段长度：500-750bp)送擎科生物测序，菌株15核糖体内转录间隔区(ITS)和5.8S核糖体RNA编码基因(5.8S rDNA)如SEQ ID NO.1所示。并在NCBIdatabase中进行序列比对。比对结果显示，所筛选的菌株15为甘蔗内生真菌(Fusariumproliferatum)。

SEQ ID NO.1：

AACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGAGTCAAATCGCGTTCCCCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCTA。

根据菌株15的菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，菌株15属于层出镰刀属菌，将其命名为甘蔗内生真菌(Fusarium proliferatum)15，于2021年11月10日保藏于广东省微生物菌株保藏中心(广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼)，保藏号为GDMCCNo：62048。

实施例2甘蔗内生真菌菌株生产多酚

对甘蔗内生真菌菌株产生的多酚进行提取，包括如下步骤：菌株活化-种子液培养-发酵培养-低温离心-发酵上清液低温冷冻干燥-水溶-固相小柱萃取-萃取液收集-真空干燥-粉末，即为所述多酚；具体提取过程包括如下步骤：

(1)取甘蔗内生真菌菌株Fusarium proliferatum 15菌种，在无菌条件下，用接种环挑取菌丝，接入已灭菌的PDA固体培养基平板，于25±1℃活化培养84小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的PDB液体培养基中于25±1℃，150rpm培养84小时，得到种子液；

(3)在无菌条件下，将种子液按10％(v/v)接种量接入1L PDB液体培养基中，于25±1℃，150rpm培养7天；

(4)将发酵液在4℃，10000rpm，10min低温离心；

(5)将步骤(4)中离心后的上清液冷冻干燥浓缩；

(6)将步骤(5)中的浓缩液用水溶解后上固相小柱；

表1固相小柱萃取的具体操作

(7)对步骤(6)的固相小柱进行醇洗，并收集洗脱液；

(8)将步骤(7)的洗脱液在60℃真空干燥箱中进行真空浓缩和干燥(总时间约20小时)，真空干燥得到的固体粉末即为甘蔗内生真菌菌株Fusarium proliferatum 15产生的多酚。

实施例3甘蔗内生真菌菌株产生的多酚的抑菌效果测试

(1)取选用的4种常见病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌菌种，在无菌条件下，用接种环挑取少量病原菌菌落，接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板(固体LB培养基)，于37±1℃活化20小时；其中，大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli K99)ATCC HB-8178，金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26003，沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC14028，单增李斯特菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111。

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基(液体LB培养基)中，于37±1℃，200rpm培养20小时，得到种子液；

(3)在无菌条件下，将种子液涂布于LB固体平板中，于37±1℃培养2小时；

(4)将实施例2获取的甘蔗内生真菌Fusarium proliferatum 15产生的多酚干粉采用无菌去离子水配成32ug/mL的多酚溶液；

(5)实验组吸取100uL的多酚溶液加入到牛津杯(7.8mm×6.0mm，直径为10mm)中，而阳性对照则分别加入25ug/mL的卡纳抗生素(卡那霉素)和50ug/mL的多酚酚酸类标准样溶液(酚酸类按等质量比混合：没食子酸，原儿茶酸，对羟基苯甲酸，咖啡酸，香草酸，绿原酸，丁香酸，香豆酸，阿魏酸，芥子酸；均购自上海麦克林生物公司和阿拉丁试剂公司)；

(6)将步骤(5)中获得的平板置于37±1℃的培养箱中恒温培养24～48小时观察，测其抑菌效果和抑菌圈的大小。

抑菌效果分别如图3～6所示(图中，1：浓度为25ug/mL的卡纳抗生素，2：甘蔗内生真菌产生的多酚，其浓度为32ug/mL，3：浓度为50ug/mL酚酸类多酚的混合物)，其中图3是菌株15对大肠杆菌K99为大肠杆菌(Escherichia coli K99)ATCC HB-8178抑菌结果，多酚溶液的抑菌效果显著好于2个阳性对照；图4是菌株15对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC14028的抑菌结果，多酚溶液的抑菌效果显著好于多酚酚酸类对照，而略小于卡那抗生素的抑菌效果；图5为菌株15对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26003的抑菌结果，多酚溶液有抑菌效果，但抑菌效果略小于多酚酚酸类溶液；图6为菌株15对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111的抑菌结果，多酚溶液的抑菌效果显著好于2个阳性对照。抑菌圈的观察结果如表2所示。

表2实施例2提取得到的菌株产生的多酚的抗菌活性结果

注：“-”表示无抑制效果。

由表1结果知，甘蔗内生真菌菌株产生的多酚对包括大肠杆菌和单增李斯特菌的两种病原菌的抑菌圈半径菌大于阳性对照组，说明甘蔗内生真菌菌株Fusariumproliferatum 15产生的多酚具有明显的抑制大肠杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的作用。而所产生的多酚对于沙门氏菌有较弱的抑制作用。

应该理解，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不用于限制本发明的范围。此外，应该理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些各种改动或修改的等价形式同样落后于本申请所附权利要求所限定的范围。

序列表

<110> 广东省科学院生物与医学工程研究所

<120> 一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 甘蔗内生真菌（Fusarium proliferatum）15

<400> 1

aacaaggtct ccgttggtga accagcggag ggatcattac cgagtttaca actcccaaac 60

ccctgtgaac ataccaattg ttgcctcggc ggatcagccc gctcccggta aaacgggacg 120

gcccgccaga ggacccctaa actctgtttc tatatgtaac ttctgagtaa aaccataaat 180

aaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcaaaa 240

tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 300

cgcccgccag tattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc tcaagcccag 360

cttggtgttg ggactcgcga gtcaaatcgc gttccccaaa ttgattggcg gtcacgtcga 420

gcttccatag cgtagtagta aaaccctcgt tactggtaat cgtcgcggcc acgccgttaa 480

accccaactt ctgaatgttg acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcta 539

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS5

<400> 2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1.一种甘蔗内生真菌，其特征在于：属于层出镰刀菌属，名称为Fusariumproliferatum 15，保藏号为GDMCC No：62048，该菌株于2021年11月10日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

2.一种培养权利要求1所述甘蔗内生真菌的方法，其特征在于：将甘蔗内生真菌接种于培养基中，于25±1℃条件下进行培养；

所述的培养基为PDA培养基和PDB培养基中的任意一种；

所述的培养的时间为60～80小时。

3.权利要求1所述的甘蔗内生真菌在生产多酚方面的应用。

4.一种利用权利要求1所述的甘蔗内生真菌生产多酚的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将甘蔗内生真菌菌株活化培养后，进行种子液培养，再将得到的种子液进行发酵培养；

(2)将步骤(1)发酵培养后得到的发酵液低温离心，取发酵上清液进行低温冷冻干燥浓缩，然后将浓缩液用水溶解后获得的提取液上固相小柱，再将固相小柱进行醇洗，并收集洗脱液，最后将洗脱液进行真空干燥，得到所述的多酚；

步骤(2)中所述的固相小柱的操作步骤如下：采用甲醇5ml活化，5ml 50％(v/v)的乙醇溶液平衡后，将提取液上固相小柱，再用0.5倍体积的蒸馏水淋洗，最后用1倍体积的甲醇洗脱，并收集洗脱液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的活化培养为采用平板固体培养方法，于25±1℃条件下活化培养60～80小时，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

步骤(1)中所述的种子液培养为采用PDB液体培养基，于25±1℃、150rpm条件下培养60～80小时；

步骤(1)中所述的发酵培养为采用PDB液体培养基，于25±1℃、150rpm条件下培养5～8天，种子液接种量为体积百分比1～5％；

步骤(2)中所述的低温离心的条件为：4℃、8000～10000rpm下离心10～20min；

步骤(2)中所述的真空干燥的条件为：60℃条件下真空干燥20小时。

6.一种甘蔗内生真菌生产的多酚，其特征在于：通过权利要求4或5所述的方法制备得到。

7.权利要求1所述的甘蔗内生真菌和/或权利要求6所述的甘蔗内生真菌生产的多酚在制备抑制病原菌的生物制剂方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的病原菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；进一步为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌和单增李斯特菌中的至少一种。

9.一种抑制病原菌的生物制剂，其特征在于：通过权利要求1所述的甘蔗内生真菌和/或权利要求6所述的多酚制备得到。

10.权利要求1所述的甘蔗内生真菌、权利要求6所述的甘蔗内生真菌生产的多酚以及权利要求9所述的抑制病原菌的生物制剂中的至少一种在制备食品、化妆品或兽药中的应用。

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