CN110791448A - 一株甘蔗内生芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药领域，公开了一株甘蔗内生解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株及其应用。所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株于2019年10月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60742保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株对甘蔗鞭黑粉菌、稻瘟菌、荔枝霜疫酶菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌都具有强烈的抑制作用，具有优异的生物防治作用。该菌株所得微生物制剂的制备和使用方法简单，具有广谱抗病性，对生态环境影响小，不影响作物品质，具有极好的应用前景。

Description

一株甘蔗内生芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，更具体地，涉及一株甘蔗内生芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物病害的发生是指植物在生长发育的过程中，由于遭受其他生物或者不良环境条件的影响而使其正常的生理机能受到破坏，从而对农业生产造成经济损失。目前在农作物的种植过程中常见的几种病害如香蕉枯萎病、稻瘟病、甘蔗黑穗病等给香蕉、水稻、甘蔗等作物的种植带来了严重的经济损失，其中在农作物病害中真菌病害占据了约80％，如尖孢镰刀菌可导致香蕉枯萎病、稻瘟病菌可导致稻瘟病、荔枝炭疽菌可导致荔枝炭疽病、荔枝霜疫霉菌可导致荔枝霜疫霉病、甘蔗鞭黑粉菌可导致甘蔗鞭黑穗病，在植物的真菌病害中，大部分真菌都是通过菌丝侵染从而直接或间接地危害植物的生长，因此采取有效的手段抑制相关真菌菌丝的形成是防治农作物病害发生的关键。

目前对农作物病害最常见的防治方法是化学农药防治，化学农药防治具有高效稳定，使用方便的优点，但却具有高毒性，并且农药在使用的过程中会伴随着土壤和地下水的污染，造成农业环境的严重污染，因此寻找高效低毒甚至无毒的植物病害防治方法十分迫切。基于此，生物防治病害能有效避免化学防治带来的负面效果，同时随着我国政府对生物农药产业的重视，生物防治手段将逐渐发展成为植物病害防治的最主要手段，并将对促进农业生产发展，维护生态环境起到不可替代的作用。

目前已有诸多的学者对生物防治病害菌进行了相关研究，比如芽孢杆菌对菜心炭疽病具有明显的拮抗作用(况福元,吴小丽,吕风青,曾大兴,涂国全.菜心炭疽病菌拮抗细菌的筛选及鉴定[J].微生物学通报,2009,36(09):1350-1355)；链霉菌、荧光假单孢菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷菌和荚壳布克氏菌对香蕉枯萎病菌都具有明显的抑制作用(孙建波,王宇光,赵平娟,孙海彦,彭明.拮抗菌XB16在香蕉体内的定殖及对抗病相关酶活性的影响[J].热带作物学报,2010,31(02):212-216)；芽孢杆菌对稻瘟病菌具有很好的抑制作用(王巧兰,郭刚.水稻稻瘟病生物防治研究进展[J].河南农业科学,2005(10):10-13)；枯草芽孢杆菌对荔枝炭疽菌具有很好的拮抗作用(黄曦,张荣灿,王何健,黄荣韶,黄庶识.枯草芽孢杆菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物质的初步研究[J].中国农学通报,2011,27(13):188-193)；枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉菌具有很好的抑制作用(CN109517758A)；荧光假单胞菌对甘蔗鞭黑粉病具有很好的防治作用(CN104531571A)；假单胞菌对甘蔗鞭黑粉病有很好的防治作用(CN105925498A)；甘蔗内生伯克氏菌株对甘蔗鞭黑粉菌具有很好的抑制作用(CN109452312A)。

因此，具有高效、安全、低毒、无残留等优点的生防菌在植物病害防治上的应用越来越受到重视和运用。但由于生防菌也存在菌株退化、效果不甚理想的问题。因此，更多、更优良的生防菌库的充实建设，对病原菌危害的防治意义重大。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明要解决的技术问题是开发解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在防治植物病害中的应用。针对大多数丝状真菌通过形成发达的菌丝对植物进行危害造成农作物病害，本发明从甘蔗叶片中分离出一株解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株，该菌株对不同属真菌菌丝的生长具有强烈的抑制作用，在农作物的真菌病害防治中具有潜在的应用价值。

本发明的首要目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGB15菌株。

本发明的另一个目的是提供上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在抑制丝状真菌病害病原菌中的应用。

本发明的另一个目的是提供解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在制备抑制丝状真菌病害病原菌的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害中的应用。

本发明的另一个目的是提供解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在制备防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害的药物中的应用。

本发明的再一目的是提供一种微生物制剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGB15菌株，所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株于2019年10月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60742，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

另外，上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在抑制丝状真菌病害病原菌中的应用，以及在制备抑制丝状真菌病害病原菌的药物中的应用，都在本发明的保护范围之内。

而且，上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害中的应用，以及在制备防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害的药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。

进一步地，上述丝状真菌病害病原菌为甘蔗鞭黑粉菌、稻瘟菌、荔枝霜疫酶菌、荔枝炭疽菌和香蕉枯萎病菌中的一种或多种。

进一步地，上述植物病害为水稻稻瘟病或甘蔗鞭黑穗病。

将上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在LB培养基上37℃培养22～26h后，CGB15菌株形成的菌落表面褶皱及边缘光滑，菌落较干燥微黄且不透明。

将上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株置于丝状真菌病害病原菌周围培养，发现其具有强烈的抑菌作用，造成了稻瘟病菌孢子和甘蔗鞭黑粉菌孢子的畸形萌发。

一种含有上述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株和/或其发酵液的微生物制剂也在本发明的保护范围之内。

进一步地，上述发酵液的制备方法是：

S1.将所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株活化培养得到菌悬液；

S2.将步骤S1所得菌悬液接种至LB培养基中，发酵培养得培养液；

S3.将步骤S2所得培养液离心取上清，即得发酵液。

优选地，步骤S1所述活化培养的条件为：LB培养基，28℃～30℃，摇床速率150～350rpm，时间22～25小时。

更优选地，步骤S1所述活化培养的条件为：LB培养基，30℃，摇床速率为200rpm下培养24h。

优选地，步骤S2所述发酵培养的温度为26℃～30℃(更优选30℃)。

将上述所得的微生物制剂直接喷施到作物表面可用于病害的防治。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明得到的解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株来自健康的甘蔗植株种，排除了菌株对植物的致病性的风险，由于与植物长期共生，避免了其代谢产物施用于植株表面时对植物生长产生的负面影响，施用之后并不会造成残留的危害。

2、本发明的解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株代谢产物粗提物对多种丝状真菌具有强烈的抑制作用，对于水稻稻瘟病或甘蔗鞭黑穗病具有优异的防治作用。

3、本发明得到的甘蔗叶片内生解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株，培养条件要求低，通过离心收集上清即可，具有很好的开发应用价值。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在LB培养基上得单菌落图；

图2为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株的系统发育树；

图3为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株对多种丝状真菌的抑制效果图；

图4为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株抑制甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发图；

图5为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株抑制稻瘟菌孢子萌发图；

图6为解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株对水稻稻瘟病的防治效果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1甘蔗叶片内生解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株的分离、纯化和保藏

1、LB培养基的配制

称取胰蛋白胨(Tryptone，Oxoid LTD LP0042，England)10g，酵母提取物(Yeastextract，Oxoid LTD LP0021，England)5g，氯化钠(NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318)10g，加水1000mL搅拌均匀，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。

2、甘蔗叶片内生解淀粉芽孢杆菌的分离、纯化

(1)叶片采集：

用于分离的甘蔗叶片于2017年11月采自广州市华南农业大学农学院沈万宽研究员的甘蔗种田，并且根据叶片的空间位置(上、中、下)粗略的分为新叶、成熟叶、老叶三组。

(2)叶片消毒：用灭菌的超纯水洗3次，用3％过氧化氢浸泡1min，100mL乙醇浸泡1min，6.15％含有吐温-20的次氯酸浸泡5min，3％过氧化氢浸泡1min，灭菌的超纯水洗5～6次，收集最后一次洗涤叶片的水。

(3)消毒检测：最后一次洗涤的水，涂在无抗生素的LB平板上，吹干封口，37℃保存三天，观察是否有菌落产生，如果有说明消毒不完全，需要重新采集叶片进行消毒。

(4)叶片研磨：取消毒成功的叶片2～3块的叶片，研磨完全，加1mL灭菌的超纯水，转移到2mL无菌的离心管，低速离心，取上清稀释，稀释倍数分别为：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。叶片研磨液加等体积的60％甘油，-80℃保存。

(5)菌落纯化：稀释后的叶片提取液，每个梯度涂3个LB平板，吹干，封口，28℃培养3～5天。根据菌落形态挑选不同的形态的菌，用LB液体培养基37℃过夜摇菌，后在LB固体培养基上划线。挑取单菌落，用LB液体培养基37℃过夜摇菌，取1mL菌液添加等体积的60％甘油，-80℃冻存，待用。

(6)菌株挑选：通过平板对峙筛选对丝状真菌具有抑制作用的菌株，并对对菌丝生长抑制活性最高的菌株(命名为菌株CGB15)进行鉴定。

(7)菌株CGB15的鉴定

如图1所示，菌株CGB15在LB培养基上37℃培养，培养24h，菌株形成的菌落表面褶皱及边缘光滑，菌落较干燥微黄且不透明。

对菌株CGB15进行16s_rDNA测序。通过美国国立生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information)Blast序列比对，构建系统发育树(见图2)，可以确定CGB15属于解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CGB15。

(8)菌株保藏

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGB15菌株于2019年10月17日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60742，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2对峙培养法测定解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株的抑制真菌活性

1、培养基的准备

(1)LB液体培养基的配制：除不加琼脂，其他与实施例1中LB固体培养基的配方相同，将称得的配方药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(2)胡萝卜培养基的制备：称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(3)PDA培养基的制备：PDA肉汤(购自鼎国昌盛)，用法见其说明书。

(4)CM培养基的配制：硝酸钙(10g/100mL)10mL，盐溶液(2g磷酸二氢钾、2.5g七水合硫酸镁、1.5g氯化钠溶于100mL水)10mL，酵母浸粉1.0g，酪蛋白水解物0.5g，酸性酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖10g，水980mL。

(5)YEPSA培养基的配制：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，蔗糖20g/L，琼脂4g/L，加1000mL水混匀后121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

2、解淀粉芽孢杆菌CGB15单菌落的制备

将芽孢杆菌CGB15划线接种至LB培养基平板上活化24h后，挑取单菌落进行划线保存。

3、解淀粉芽孢杆菌CGB15发酵液的制备

取步骤2中制备得到的解淀粉芽孢杆菌CGB15单菌落接入步骤1中制备的LB液体培养基中，置于30℃，摇床速率为200rpm下培养24h，即可得到解淀粉芽孢杆菌CGB15菌悬液；将获得的菌悬液添加到装有LB培养基的500mL锥形瓶中，置于30℃，摇床速率为200rpm下培养12h，离心取上清液，即得所需发酵液。

4、抑制真菌活性的测定

(1)解淀粉芽孢杆菌CGB15对6种丝状真菌的抑制作用测定：将步骤2制得的解淀粉芽孢杆菌CGB15接种到菌饼周围，与菌饼距离约2cm左右，实验中以不接种芽孢杆菌为对照，3个重复，置于28℃下恒温培养，当约三天后观察实验结果，结果如图3所示。

(2)对甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发的影响：倒好的PDA平板铺上一层玻璃纸，按照步骤3中摇菌方法，待芽孢杆菌&大肠杆菌(大肠杆菌为负对照)到OD600≈0.8时，取细菌菌液小心涂于玻璃纸上(注意不要涂到未被玻璃纸覆盖的区域)，吹干封板，28℃培养约一天，小心揭掉玻璃纸，涂甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于平板上，于28℃培养约一天，观察孢子萌发情况，并拍照(显微镜、体视镜)，结果见图4所示。

(3)对稻瘟菌孢子萌发的影响：取接稻瘟菌菌饼于倒好的CM培养基平板中，28℃培养约一周左右，取无菌水于平板中清洗孢子制成孢子悬浮液(镜检调节孢子浓度到约每毫升10⁷个孢子)。按照步骤3中摇菌方法，待芽孢杆菌到OD600≈0.8时，取菌液于平板中洗孢子制成孢子悬液。孢子悬浮液均取20μL点在疏水玻片上，28℃培养6h后镜检观察孢子附着孢形成情况如图5所示。

5、结果分析

由图3、图4和图5可以看出甘蔗叶片内生解淀粉芽孢杆菌CGB15对五种丝状真菌的生长具有强烈的抑制作用，且造成了稻瘟病菌孢子和甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发畸形，其中解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株的发酵液对稻瘟菌孢子和甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发具有显著的抑制作用。

实施例3解淀粉芽孢杆菌CGB15对稻瘟病的防治效果

1、LB培养基的制备同实施例1；CM、PDA培养基的制备同实施例2。

2、芽孢杆菌平板菌悬液和粗提物的制备同实施例2。

3、挑选长势均一的大麦叶片及水稻叶片，取稻瘟病菌菌饼覆盖在叶片上，设置清水组与发酵液组(提取过程同实施例2中步骤3操作)，每组取5μL添加到菌饼与叶片之间。28℃避光培养一天后转移至28℃光照(12h黑暗：12h光照)培养箱培养3天，观察发病情况并记录，结果如图6所示。

4、结果分析

由图6可以看出发酵液对稻瘟病病斑的形成具有抑制作用，抑制率约为100％，与清水对照组比起来，CGB15发酵液在稻瘟菌的防治上作用显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGB15菌株，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株于2019年10月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60742。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在抑制丝状真菌病害病原菌中的应用。

3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在制备抑制丝状真菌病害病原菌的药物中的应用。

4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害中的应用。

5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株在制备防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害的药物中的应用。

6.根据权利要求2～5任一所述应用，其特征在于，所述丝状真菌病害病原菌为甘蔗鞭黑粉菌、稻瘟菌、荔枝霜疫酶菌、荔枝炭疽菌和香蕉枯萎病菌中的一种或多种。

7.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述植物病害为水稻稻瘟病或甘蔗鞭黑穗病。

8.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株和/或其发酵液。

9.根据权利要求8所述微生物制剂，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGB15菌株活化培养得到菌悬液；

S2.将步骤S1所得菌悬液接种至LB培养基中，发酵培养得培养液；

S3.将步骤S2所得培养液离心取上清，即得发酵液。

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