CN117617355A - 一种酶解构树粉及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶解构树粉及其制备方法与应用。本发明以黑曲霉菌WZ001作为出发菌株，构建并筛选出一株高产黑曲霉单宁酶菌株，而后将其发酵获得的重组单宁酶用于酶解构树粉中的单宁，可以将构树粉单宁转化为没食子酸，这可以有效提高以构树粉作为原料之一的饲料的适口性。在此基础上，由于黑曲霉宿主具有丰富的酶系，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶等，本发明的黑曲霉单宁酶可以起到复合酶的作用，因此可以较为全面的对构树粉进行酶解，经酶解后获得的产物营养价值较高，体现出了较高的经济价值和社会效益。此外，本发明构建的黑曲霉单宁酶能够达到食品级酶制剂的要求，因此获得的酶解构树粉安全性有所保障。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶解构树粉及其制备方法与应用。
背景技术
构树别名构桃树、谷浆树、假杨梅等，广泛分布于我国华北、华中、华南、西南、西北各地区。在我国，人们将构树叶作为牲畜的饲料原料。作为牲畜饲料而言，构树叶优势十分突出：蛋白质含量高达20％至30％，氨基酸、维生素及微量元素等营养成分也十分丰富；采用以构树叶为主要原料发酵制成的饲料，绿色环保，不含农药或激素，清香味正；牲畜吃后生长速度快，抗病力强，饲养周期短。
由于构树粉中存在单宁(含量约为1.6％)，因此其饲料口感苦涩，而且单宁易于蛋白质形成络合物，影响动物的营养摄入量。需要添加额外的甜味剂(糖精)，改善饲料的口感，提高饲料的适口性以及动物对饲料的摄入量。有试验数据表明，单宁酸在仔猪小肠内不被吸收，而会在结肠部位被微生物部分分解，变成没食子酸被吸收。一般而言，仔猪采食的单宁酸会通过粪便排出70-80％。对大猪而言，也至少有30％的单宁酸随粪便而排出。
单宁酶是单宁降解过程中研究比较多的酶，可以水解单宁中的酯键。单宁酶是一种诱导酶，在单宁酸和单宁存在的情况下可以诱导生成。单宁酶在各种真菌和细菌中广泛存在。生产中常用的单宁酶生产菌主要是真菌，如米曲霉(Aspergillus oryzae)等。
黑曲霉历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种。黑曲霉具有很强的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。随着越来越多的蛋白在黑曲霉中成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶蛋白表达系统，也逐渐成为重要的工业酶制剂和有机酸的生产菌种。黑曲霉生产的工业酶在淀粉加工、发酵、酿造、饮料、动物饲料和造纸行业等领域发挥了巨大的作用。
专利CN100467586C公开了一种可同时高产柚苷酶和橙皮苷酶、并能实现工业化生产的黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)及其应用。具体而言，该种菌株产酶量高，采用液态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到14000U/g以上；采用固态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到6000U/g以上。因此本申请为解决目前以构树粉为原料的饲料中单宁含量过高，导致饲料适口性差的技术问题，针对黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)展开了进一步的应用研发。
发明内容
本发明以黑曲霉菌WZ001作为出发菌株，制备了一种新型的黑曲霉单宁酶，所述黑曲霉单宁酶可以酶解构树粉中的单宁，进而解决目前以构树粉为原料的饲料中单宁含量过高，导致饲料适口性差的技术问题。具体通过以下技术方案实现：
一种酶解构树粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、以野生型黑曲霉为出发菌株，敲除pyrG基因，获得黑曲霉pyrG基因缺陷型菌株；所述野生型黑曲霉保藏编号为CCTCC NO.206047；以单宁酶基因加pyrG基因的形式回补pyrG基因，筛选得到黑曲霉高产单宁酶菌株；对黑曲霉高产单宁酶菌株进行发酵罐培养得到黑曲霉单宁酶；
S2、使用所述黑曲霉单宁酶对构树粉进行酶解，得到酶解构树粉。
作为优选，步骤S2包括以下步骤：
S2.1、将构树粉原料溶于水，得到预处理原料；
S2.2、向预处理原料中加入所述黑曲霉单宁酶的酶液，进行酶解，得到酶解产物；
S2.3、将酶解产物进行灭活处理，得到酶解构树粉。
作为优选，步骤S2.1中，构树粉原料与水的质量体积比为1：3。
作为优选，步骤S2.2中酶液添加量与预处理原料中构树粉添加量的体积质量比为1％～10％。
作为优选，步骤S2.2中酶解条件为：温度25～60℃，时间为1～6h。
作为优选，步骤S2.3中灭活处理为：将酶解产物加热至沸腾，之后冷却至室温，得到酶解构树粉。
一种使用上述任一项制备方法制得的酶解构树粉。
一种包含有上述酶解构树粉的饲料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以黑曲霉菌WZ001作为出发菌株，构建并筛选出一株高产黑曲霉单宁酶菌株，而后将其发酵获得的重组单宁酶用于酶解构树粉中的单宁，可以将构树粉单宁转化为没食子酸，这可以有效提高以构树粉作为原料之一的饲料的适口性。在此基础上，由于黑曲霉宿主具有丰富的酶系，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶等，本发明的黑曲霉单宁酶可以起到复合酶的作用，因此可以较为全面的对构树粉进行酶解，经酶解后获得的产物营养价值较高，体现出了较高的经济价值和社会效益。此外，本发明构建的黑曲霉单宁酶能够达到食品级酶制剂的要求，因此获得的酶解构树粉安全性有所保障。
附图说明
图1：敲除黑曲霉pyrG重组质粒图谱；
图2：验证敲除黑曲霉pyrG重组质粒菌落PCR产物凝胶电泳图；
图3：单宁酶基因PCR产物凝胶电泳图；
图4：黑曲霉单宁酶重组质粒图谱；
图5：标准品单宁酸HPLC图谱；
图6：标准品没食子酸HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合说明书具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下列实施例中，使用的培养基具体配方如下：
(1)LB液体培养基：0.5％酵母粉，1％NaCl，1％蛋白胨，pH 7.0，121℃，灭菌20min。
(2)LB固体培养基：以LB液体培养基为基础，再加2％琼脂粉，121℃，灭菌20min。
(3)DPY培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，2％葡萄糖，0.5％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH自然，115℃，灭菌30min。
(4)PDA固体培养基组成(W/V)：取200g已削皮的马铃薯充分煮沸，滤网过滤所得滤液中加入20g葡萄糖，冷却后定容至1L，加入2％琼脂粉，pH自然，115℃，灭菌30min。
(5)高渗2％CD固体培养基：35％蔗糖，0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，加入2％琼脂粉，121℃，灭菌20min。
(6)高渗0.5％CD软琼脂培养基：同其固体配方，仅琼脂粉改为0.5％，121℃，灭菌20min。
(7)种子液培养基组成(W/V)：2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.2％酵母浸粉，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4，溶剂为水，调节pH为6.8；
(8)发酵培养基组成(W/V)：4.2％玉米浆，3％豆饼粉，2％葡萄糖，1.5％K2HPO4，1.5％(NH4)2SO4，0.3％柠檬酸，0.25％酵母蛋白胨，0.25％酵母浸粉，0.02％CaCl2，0.5％MgSO4，溶剂为水，pH自然。
所述pH自然是指不对发酵培养基的pH进行特殊调整，使其呈现加入培养基组分之后自然的pH值。
(9)尿嘧啶核苷溶液：称取2.442g尿嘧啶核苷溶于10mL无菌ddH2O，0.22μm滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存。
(10)5-氟乳清酸(5-FOA)：称取1g 5-FOA粉末，溶于10mL二甲基亚砜中，0.22μm滤膜过滤除菌后分装，-20℃保存。
(11)0.8M NaCl溶液：称取46.8gNaCl，加入ddH2O溶解并定容至1L。
(12)STC缓冲液：称10.93g山梨醇，0.303g Tris，0.277g无水CaCl2，加入ddH2O溶解并定容至50mL，pH 7.5，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
(13)PEG缓冲液：称30g PEG 6000，0.061g Tris，0.277g无水CaCl2，加入ddH2O溶解并定容至50mL，pH 7.5，121℃，灭菌20min，冷却后置于4℃保存。
(14)100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)：称1.37g NaH2PO4·2H2O，0.43g Na2HPO4·12H2O，加入ddH2O溶解并定容至100mL，pH 6.0，4℃保存。
(15)酶解液：称0.2g纤维素酶，0.1g蜗牛酶，0.1g溶壁酶，0.05g溶菌酶，0.468gNaCl，1mL上述磷酸钠缓冲液，加入9mL ddH2O充分溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
下列实施例中，单宁酸(图5)与没食子酸(图6)HPLC分析方法为：色谱柱为CAPCELLPAKADME柱(250mm×4.6mmI.D.)，流动相为含0.5％甲酸甲醇溶液(V/V)。检测方法：流速为0.4mL/min，进样量10μL，检测波长280nm，柱温35℃。
实施案例1黑曲霉pyrG基因缺陷型菌株的构建
以实验室保存的野生型黑曲霉(中国典型培养物保藏中心编号：CCTCCNO.206047)为出发菌株，构建黑曲霉pyrG基因缺陷型菌株。
1.1pyrG敲除质粒的构建
首先从NCBI数据库中查找黑曲霉来源的pyrG序列基因(Gene ID：4985706)。
以黑曲霉CCTCCNO.206047基因组为模板，用引物Up-pyrG-F/Up-pyrG-R、Do-pyrG-F/Do-pyrG-R(表1-1)分别扩增pyrG基因带有同源臂的上游、下游基因片段pyrGL和pyrGR。以pET-28a(+)质粒为模板，引物28ZT-F、28ZT-R(表1-1)PCR扩增载体片段ZT-1。PCR完成后，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳验证扩增出的基因条带大小。将验证正确后的PCR产物进行纯化。上游片段pyrGL与载体片段ZT-1进行一步克隆，转入E.coli DH5α感受态细胞中，构建含有pyrGL的pET-28a(+)-pyrGL重组质粒。养菌提质粒验证是否正确。若正确，将该质粒进行线性化，与下游片段pyrGR进行一步克隆，转入E.coli DH5α感受态细胞中，构建含有pyrGLR的pET-28a(+)-pyrGLR重组质粒(图1)。
表1-1引物名称及序列
注：下划线部分为克隆所需同源序列。
以构建的重组质粒pET-28a(+)-pyrGLR为扩增目的基因片段的模板，使用引物pyrG-1和pyrG-2(表1-1)扩增用于黑曲霉原生质体转化的目的基因表达片段。采用琼脂糖凝胶验证电泳验证(图2)，若验证正确，对产物进行纯化。
1.2黑曲霉原生质体制备及转化
1.2.1原生质体的制备
1)菌丝体的培养：将4℃冰箱斜面保藏的黑曲霉菌株接种至无抗PDA培养基上，30℃培养箱培养4-5天，用4mL无菌ddH2O洗下孢子制成孢子悬液，接种到50mLDPY培养基中，30℃，200rpm培养24h。
2)收集菌丝体：使用真空抽滤泵滤除培养液后，将菌丝体全部收集起来，先用无菌ddH2O洗，再用0.8M NaCl溶液洗，抽滤直至其呈干燥状态。用无菌药勺刮取菌丝体，称取0.8g左右的菌丝体放入无菌锥形瓶，并加入10mL酶解液。
3)酶解：将锥形瓶置于水浴摇床，以30℃，100rpm条件进行酶解，3h左右酶解完全。
4)过滤：将步骤3)酶解后的菌液用装有4层神奇滤布的漏斗过滤至50mL无菌离心管中，装有原生质体的离心管于4℃，1200rpm离心15min，弃上清。在沉淀中加入3mL STC缓冲液，对沉淀进行洗涤，并使其充分重悬，4℃，1200rpm离心10min，弃上清。在原生质体沉淀中加入1mL STC缓冲液，并用去尖枪头吹打，使其充分重悬。
1.2.2原生质体转化
为了保证转化率的准确，将转化率分为阳性组、阴性组和转化组。
阳性组：在2mL的离心管内，分别加入160μL的原生质体悬液，100μL的STC缓冲液，60μL的PEG溶液，混合均匀；
阴性组：在2mL的离心管内，分别加入160μL的原生质体悬液，100μL的STC缓冲液，60μL的PEG溶液，1％的尿嘧啶核苷溶液和5-FOA，混合均匀；
转化组：在2mL的离心管内，将160μL的原生质体重量悬液，1％的尿嘧啶核苷溶液和5-FOA，30-100μL的扩增得到的片段与60μL的PEG混合液混合；
离心管置于冰上，每隔10min，进行2-3次的温和倒置，在30min后，向转化离心管中，分别添加1.5mLPEG，温和倒置混匀，在室温下放置25min。
1.2.3平板培养
阳性组下层用2％CD平板，阴性组与转化组下层用含有1％(W/V)的尿嘧啶核苷溶液与5-FOA的2％CD平板。
阳性组：取3mL0.7％CD软琼脂培养基、1.5mL的STC缓冲液，与上述转化所得对应的混合液混合并均匀地倒于高渗透的2％CD的固态培养基上。
阴性组：取3mL0.7％CD软琼脂培养基，1.5mL的STC缓冲液，以及1％(W/V)尿嘧啶核苷溶液与5-FOA与上述转化所得对应的混合液混合并均匀地倒于高渗透的2％CD的固态培养基上。
转化组：取3mL0.7％CD软琼脂培养基、1.5mL的STC缓冲液、以及1％(W/V)尿嘧啶核苷溶液与5-FOA，与上述转化所得对应的混合液混合并均匀地倒于含1％(W/V)尿嘧啶核苷溶液与5-FOA的高渗透2％CD的固态培养基上。
将实验组中2％CD平板中长出的转化子接种到含5-FOA、尿嘧啶核苷溶液的PDA培养基中，30℃恒温霉菌培养箱中正置培养3-5天，观察并比较其生长状况。
挑选培养基中长势较好的黑曲霉转化子进行提基因组PCR验证。将有正确条带的PCR产物交由公司进行测序。将目标基因序列和测序结果进行比对，序列正确的黑曲霉转化子即为pyrG缺陷型菌株，将其保藏于4℃冰箱中。
实施案例2黑曲霉高产单宁酶菌株的构建与发酵上清液单宁酶酶活力的测定
2.1单宁酶基因的获取与重组质粒的构建
NCBI搜索的源自黑曲霉(Aspergillus niger)的单宁酶基因(GenBank:XM_001401772)。以野生型黑曲霉CCTCC NO.206047基因组为模板，用CHTan-F/CHTan-R引物(表2-1)进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶，条件为预变性98℃，3min；扩增阶段30个循环，按照98℃，10s，60℃，10s，72℃，20s进行；延伸72℃，10min。将PCR产物进行消化、纯化，获得纯化片段(带有同源臂的目的基因)，记为片段tan-1。
以pCAMBIA-tan的质粒(含pyrG表达盒)为模板，用ZTN1-F/ZTN1-R引物(见表2-1)进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶，条件为预变性98℃，3min；扩增阶段30个循环，按照98℃，10s，55℃，5s，72℃，90s进行；延伸72℃，10min。将PCR产物进行消化、纯化，获得线性化载体，记为片段ZT-2。
表2-1引物名称及序列
注：下划线部分为克隆所需同源序列。
用一步克隆连接试剂盒将片段tan-1与片段ZT-2进行重组转入转入E.coli DH5α感受态细胞中，构建pCAMBIA-tan重组质粒(图3)。养菌提质粒，从质粒P出单宁酶基因的表达盒，送擎科测序，比对正确后提取重组质粒，将含有单宁酶基因与pyrG表达盒基因P下，记为TAN-1用于黑曲霉原生质体转化。
2.2原生质体制备与转化
以黑曲霉营养缺陷型菌株为出发菌株，构建黑曲霉单宁酶菌株。(同上述实施案例1.2步骤)
其中阳性对照组的上下层均加入1％(W/V)尿嘧啶核苷溶液与5-FOA。阴性组和实验组均不加1％(W/V)尿嘧啶核苷溶液与5-FOA。
将转化后各菌株放入30℃恒温霉菌培养箱中，培养3-4天，以观察其在细胞内的生长状况。
2.3黑曲霉单宁酶菌株筛选
2.3.1黑曲霉转化子基因组的提取
将2％CD板上生长良好的黑曲霉转化子的孢子接种到PDA培养基并记为第1代阳性转化子，于30℃恒温霉菌培养箱中培养3-4天，生长出的菌丝体可用于全基因组的提取。
2.3.2单宁酶转化子基因组的验证
以黑曲霉转化子基因组为模板，使用验证引物进行基因组PCR鉴定。对PCR产物进行电泳检测，将条带大小鉴定正确的转化子基因组保留，PCR液送测，与序列一致的，则确定为黑曲霉阳性转化子。将第1代阳性转化子分别转移至相应的PDA平板上，视作第2代转化子，之后将遗传稳定性好的第1代阳性转化子接至PDA固体斜面，4℃保藏。
将第2代转化子在PDA平板上划板，30℃活化5d，制成孢子悬液接种至种子液培养基中，30℃、220rpm条件下培养24h，再将此种子液转接至发酵培养基，30℃、220rpm条件下发酵培养5d，12000rpm离心10min，收集上清液。
2.3.3黑曲霉单宁酶上清液酶活力的检测
使用采用保玉心的绕丹宁法测单宁酶酶活。该法以没食子酸丙酯(PG)作为反应的底物，单宁酶分解PG产生的没食子酸可与绕丹宁在碱性条件下形成红色复合物，该复合物在520nm处有最大吸收，据此可通过测定A520的变化量来计算生成的没食子酸的量，从而计算酶活力。
测定单宁酶酶活力步骤如下：
(1)反应开始前，将PG溶液和待测酶液于30℃水浴中保温5-10min；
(2)取4支洁净的试管，1支为空白管、3支测试管。向各管中加入0.25mLPG溶液，然后向测定管中分别加入0.25mL待测酶液，30℃水浴下反应5min；
(3)向所有试管中加入0.3mL甲醇绕丹宁溶液(0.667％，W/V)，保温5min；
(4)向所有试管中加入4.2ml KOH(0.5M)溶液，向空白管中加入0.25mL酶液，在30℃条件下放置10min后，以空白管归零，于520nm处测定各管溶液吸光值。
将构建获得的不同转化子的黑曲霉单宁酶菌株进行摇瓶发酵，其酶活力情况见表2-2，表2-2结果表明菌株Tan-5的摇瓶发酵单宁酶酶活力最高，酶活力为5.92U/mL。
表2-2菌株发酵单宁酶的酶活力
实施例3 5L发酵罐发酵制备黑曲霉单宁酶
选择高酶活力的菌株Tan-5进行5L发酵罐培养。将菌株Tan-5在PDA平板上划板，30℃活化5d，制成孢子悬液接种至种子液培养基中，在30℃、220rpm条件下培养24h。
将5L发酵罐罐体内装入少量ddH2O后于高压蒸汽灭菌锅内115℃灭菌30min完成空消。
称取126g玉米浆，90g豆饼粉，60g葡萄糖，45gK2HPO4，45g(NH4)2SO4，9g柠檬酸，7.5g酵母蛋白胨，7.5g酵母浸粉，0.06gCaCl2，15gMgSO4，加水定容至3L，混合均匀后装入发酵罐内，同时需额外加入0.05％的消泡剂，检查发酵罐气密性并连接好空气过滤膜，放入pH电极和溶氧电极后将发酵罐于115℃的高压蒸汽灭菌锅内灭菌30min完成实消。将实消后的发酵罐与温度探头、冷凝水、空气压缩机、补料瓶连接好，设定温度与pH，搅拌转速设为600rpm，通气量设为1VVM。待发酵罐参数均达到设定值并保持稳定后再进行种子液的接种。采用火焰封口接种法将种子液按6％的接种量接种至发酵罐内，将此时的发酵周期设定为0h，以便之后每隔12h进行取样。发酵过程中使用磷酸和20％氨水使其pH恒定于最佳值，发酵36h后菌体进入快速产酶阶段，即开始进行间歇补料并将转速调为400rpm。72h后连续补料，连续发酵5天，直至不能进行不补料，结束发酵，酶活力达到20.16U/mL，利用纱布过滤除去黑曲霉菌体，10000rpm离心10min，除去其余物质，获得单宁酶酶液，4℃冰箱保存备用。
实施例4酶解处理构树粉的(不同酶添加量)工艺
(1)构树粉(单宁含量1.49％)预处理：将构树粉原料加入自来水(料液比1:3)，加热至60℃后搅拌3h；
(2)加单宁酶酶液处理：待步骤(1)的构树粉物料冷却至室温，加入一定量的实施例3中制备的黑曲霉发酵单宁酶酶液，在一定温度(30℃)下进行酶解一段时间(6h)，过程中可以实现单宁的水解；
(3)单宁酶的灭活：将步骤(2)物料加热至沸腾(20min)实现单宁酶的灭活，冷却至室温，即得适口性改善的构树粉饲料原料。
本实施例探究不同酶添加量(v/w)对发酵液酶解构树粉单宁的影响。本实施例中酶量分别为1％、2％、3％、4％、5％、8％、10％。该酶解反应的转化率见表4-1，结果表明当酶添加量高于5％时，单宁转化率可以达到80％以上。
表4-1不同酶添加量(v/w)对发酵液酶解构树粉单宁的影响
实施例5酶解处理构树粉的(不同酶解温度)工艺
本实施例探究酶解温度对发酵液酶解构树粉中单宁的影响。按照实施案例4方法，加酶添加量为5％，酶解温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，其他条件不变，对饲料中可水解单宁进行酶解，转化率见表5-1。结果表明酶解温度30℃，单宁转化率最高。
表5-1不同酶解温度对发酵液酶解构树粉单宁的影响
实施例6酶解处理构树粉的(不同酶解时间)工艺
本实施例探究酶解时间对发酵液酶解构树粉中单宁的影响。按实施案例4方法，加酶量为5％，酶解温度为30℃，本实施例中酶解时间分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h、15h，其他条件不变，对饲料中可水解单宁进行酶解，转化率见表6-1。结果表明酶解时间高于6h，单宁转化率超过80％。
表6-1不同酶解时间对发酵液酶解构树粉单宁的影响
Claims (8)
1.一种酶解构树粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以野生型黑曲霉为出发菌株，敲除pyrG基因，获得黑曲霉pyrG基因缺陷型菌株；所述野生型黑曲霉保藏编号为CCTCC NO.206047；以单宁酶基因加pyrG基因的形式回补pyrG基因，筛选得到黑曲霉高产单宁酶菌株；对黑曲霉高产单宁酶菌株进行发酵罐培养得到黑曲霉单宁酶；
S2、使用所述黑曲霉单宁酶对构树粉进行酶解，得到酶解构树粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
S2.1、将构树粉原料溶于水，得到预处理原料；
S2.2、向预处理原料中加入所述黑曲霉单宁酶的酶液，进行酶解，得到酶解产物；S2.3、将酶解产物进行灭活处理，得到酶解构树粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2.1中，构树粉原料与水的质量体积比为1：3。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2.2中酶液添加量与预处理原料中构树粉添加量的体积质量比为1％～10％。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2.2中酶解条件为：温度25～60℃，时间为1～6h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2.3中灭活处理为：将酶解产物加热至沸腾，之后冷却至室温，得到酶解构树粉。
7.一种使用权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的酶解构树粉。
8.一种包含有权利要求7所述的酶解构树粉的饲料。
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