CN117757640A - 根霉菌nx-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于酿酒发酵技术领域，具体涉及一株根霉菌NX‑2及其应用。针对现有白酒酿造中，具有高糖化力和发酵力的功能微生物菌株较少的问题，本发明提供一株根霉菌NX‑2及其在制备酿酒曲药和酿酒领域的应用。本发明根霉菌NX‑2的保藏编号为：CCTCC NO：M2023280。本发明的根霉菌NX‑2能够高产糖化酶，且与酿酒酵母通过固体纯培养制成菌制剂，再按比例复配混合大曲进行酿酒，能同步提高糖化力及发酵力，进而提升酿酒出酒率，缩短发酵期。

Description

根霉菌NX-2及其应用

技术领域

本发明属于酿酒发酵技术领域，具体涉及一株根霉菌NX-2及其应用。

背景技术

曲药是中国白酒酿造过程的糖化发酵剂，起着重要的糖化、发酵和产香作用。其中糖化作用主要由霉菌主导，通过代谢途径产生糖化酶，进而将淀粉转化为还原糖。因此通过现代微生物学技术在酿酒环境微生物、中温大曲、糟醅样品中筛选高糖化能力的霉菌，并将其制成曲药加以利用是目前研究的热点。

根霉(Rhizopus)属于毛霉目、毛霉科、根霉属菌株，其菌丝较粗，呈分支状，菌丝细胞内无横隔，在培养基上生长迅速，由生长成为分支的假根吸收营养，并从假根着生处产生直立的孢子囊梗不分枝，并在顶端膨大形成孢子囊孕育孢子，待孢子囊破裂时释放孢子。在酿酒过程中，霉菌通过代谢途径可产生糖化酶，进而水解淀粉转化为可利用的还原糖。再由酵母菌将糖化得到的糖类物质转化为乙醇，因此曲药的糖化力及发酵力是评价其质量的重要指标之一。

其中，曲药中，传统大曲是依靠自然网络环境中的微生物接种，存在培养后大曲糖化等指标较低现象，因此通过人工筛选接种特殊功能菌种，能更好地提升大曲品质，但目前发现的具有高糖化力及发酵力的功能菌种，尤其是霉菌还较少，有待进一步开发，才能更好地用于制备大曲并用于酿酒领域提升酒品质。

发明内容

针对现有白酒酿造中，具有高糖化力和发酵力的功能微生物菌株较少的问题，本发明提供一株根霉菌NX-2及其在制备酿酒曲药和酿酒领域的应用。

本发明首先提供根霉菌(Rhizopus sp.)新菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M2023280。保藏日期为：2023年03月09日；保藏中心为中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编为430072，分类命名为：Rhizopus sp.浓香2号(NX-2)。

其中，上述根霉菌的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1：

GACTTCAGATCATAGTTTGAAAGTTGCTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAGAAAAAGATCCTGAGACCAGCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATGCGACCCATTACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAGAGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGAAGGGTGCTCCTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAATTTTCACAGTGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGAGGTAAGGCGC。

本发明还提供一种微生物菌剂，其含有上述根霉菌的活细胞或干菌体。

本发明还提供上述根霉菌在制备酿酒曲药上的应用。优选地，所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。

本发明还提供上述根霉菌在白酒酿造上的应用。

本发明还提供一种菌种组合物，其含有上述根霉菌和酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。

其中，所述根霉菌与酿酒酵母菌质量比(w:w)8～12:1。

其中，所述酿酒酵母菌保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。记载该酵母菌文献于2022年03月08日公开，公开号为CN 114149933 A，发明名称为：酿酒酵母LJ-1及其应用。

本发明还提供上述菌种组合物在制备酿酒曲药、白酒酿造上的应用。优选地，所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。

更优选地，所述大曲为强化大曲、中温大曲或浓香型大曲。

有益效果：本发明利用现代微生物技术从泸州老窖中温大曲曲粉中，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)为培养基，分离筛选得到一株高糖化能力的根霉菌(Rhizopus sp.)新菌株NX-2，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2023280。本发明的根霉菌NX-2能够高产糖化酶，且与酿酒酵母通过固体纯培养制成菌制剂，再按比例复配后混合大曲，用于白酒发酵中，能同步提高糖化力及发酵力，进而提升酿酒出酒率，缩短发酵期。

附图说明

图1为本发明实施例1根霉菌NX-2在PDA平板上的菌落形态图；

图2为本发明实施例1根霉菌NX-2基于ITS测序序列扩增结果电泳图谱；其中，M代表marker；1代表根霉菌NX-2；

图3为本发明根霉菌NX-2基于ITS测序序列构建的根霉菌株系统发育树。

本发明根霉菌NX-2的保藏说明：根霉菌(Rhizopus sp.)，其保藏编号为：CCTCCNO：M 2023280。保藏日期为：2023年03月09日；保藏中心为中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编为430072，分类命名为：Rhizopus sp.浓香2号(NX-2)。

具体实施方式

本发明从泸州老窖中温大曲中筛选分离出一株根霉菌(Rhizopus sp.)NX-2，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023280。

本发明的根霉菌NX-2是将泸州老窖中温大曲稀释后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，于30～31℃培养55～65h，筛选得到。其中，所述的PDA培养基成分包括：马铃薯浸粉6份、葡萄糖20份、琼脂20份、去离子水1000份。

本发明的根霉菌NX-2在PDA培养基表面生长着匍匐菌丝，其直立孢囊梗为米白色，成熟后顶端出现明显黑色孢子囊，经ITS测序后确定为根霉属(Rhizopus sp.)菌株。

本发明的根霉菌NX-2与酿酒酵母LJ-1通过固体纯培养制成菌制剂，再按比例复配后，混合大曲使用，能提高大曲理化指标。或与双曲混合用于白酒酿造，能显著提高出酒率，提高白酒品质。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例所用培养基：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉6份、葡萄糖20份、琼脂20份、去离子水1000份。

产糖化酶菌株初筛培养基：淀粉10g、酵母膏1.5g、磷酸氢二钾1g、硝酸钠1.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、琼脂13g定容1L，调至pH为7。

麸曲培养基：麸皮85wt％、小麦次粉10wt％、糠壳5wt％。

YEPD固体培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏20g，葡萄糖20g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，琼脂20g定容1L，pH自然。

以下实施例所用的酿酒酵母LJ-1保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。

实施例1、根霉菌NX-2的分离、筛选与鉴定

1)纯化：取泸州老窖中温大曲曲粉10g于装有无菌玻璃珠及90mL生理盐水的500mL三角瓶中打散，按梯度稀释涂布到PDA平板上，30℃恒温培养，以平板划线法将其接种到新的PDA平板中培养多代，直至肉眼观察所培养菌落无其它外观杂菌干扰。观察菌落形态特征为在PDA平板中生长具有匍匐菌丝，直立孢囊梗为米白色，成熟后顶端出现明显黑色孢子囊。并参考《真菌鉴定手册》对霉菌进行判断，最后将纯化菌种接种在PDA斜面保藏于4℃。

2)初筛：用无菌接种针挑取PDA斜面上的菌株点接于产糖化酶初筛培养基上，在30℃恒温培养55h测量菌落直径D，然后向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径d，选择d/D比值大于1的菌株进行复筛。

3)复筛：将麸曲培养基原料按配比混合均匀，称取60g于三角瓶中，加入36mL、大于85℃的热水混和均匀，润料2h后灭菌，取出冷却到30℃，无菌接入3环菌种，放入30℃培养箱培养60h，长满菌丝后取出低温(40℃)8h烘干。按照QB/T4257-2011测定麸曲的水分、糖化力、液化力，并筛选出麸曲糖化力大于1000mg/g.h、液化力大于1g/g.h的菌种。

4)菌种鉴定：将菌株寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，其中，引物为ITS1(SEQ ID NO:2)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4(SEQ ID NO:3)：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

扩增流程：PCR扩增反应体系：在0.2mL离心管中加入如表1所示成分，轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：预变性95℃，5min，变性94℃，30s，退火57℃，30s，延伸72℃，90s，终延伸72℃，10min，循环数30，反应完成后，取3uL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。

表1PCR反应体系

将测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列对比，其中一株编号为NX-2的菌株(图1)的扩增结果电泳图谱如图2所示，其ITS如SEQ ID NO:1所示，通过建立系统发育树(图3)，最终确定为根霉菌(Rhizopus sp.)，命名为根霉浓香2号(NX-2)，于2023年03月09日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2023280。

实施例2、根霉菌NX-2和酿酒酵母LJ-1在麸曲上的应用

1)根霉菌NX-2固态发酵菌制剂生产工艺

a.配料：按比例麸皮:糠壳(w:w)＝50:1称取原料；

b.润料：水温85℃以上，用水量55％润料；

c.蒸煮灭菌：常压下2h；带压下0.1MPa、121℃、30min蒸煮灭菌；

d.打散扬冷：灭菌完成后趁热打散并冷却至30℃；

e.接种：根霉菌NX-2菌种量0.5％进行接种；

f.培养：控温培养30℃，湿度90％，培养55h，菌丝结块后须翻拌均匀，并利用通风控制升温幅度，铺料厚度≤30cm；

h.鼓风干燥：40℃，8h低温烘干；

g.按照QB/T4257-2011测定麸曲的水分、糖化力、液化力，根霉菌NX-2固态发酵菌制剂的水分8.21±0.5％，糖化力1068±80mg/g.h、液化力1.16±0.2g/g.h，试饭还原糖含量34±1.5％。

2)酿酒酵母LJ-1固态发酵菌制剂生产工艺

a.配料：按比例麸皮:糠壳:小麦粉(w:w:w)＝50:1:1称取原料；

b.润料：水温85℃以上，用水量70％润料；

c.蒸煮灭菌：常压下2h；带压下0.1MPa、121℃、30min蒸煮灭菌；

d.打散扬冷：灭菌完成后趁热打散并冷却至28℃；

e.接种：酿酒酵母菌种量1.0％进行接种；

f.培养：控温培养28℃，湿度90％，培养32h，铺料厚度≤30cm；

h.鼓风干燥：40℃，8h低温烘干；

酿酒酵母固态发酵菌制剂的酵母数量为1.3*10⁹～1.6*10⁹个/g。

将根霉菌NX-2和酿酒酵母LJ-1菌制剂按比例(w:w)10:1混合，混合后酒曲指标为水分8.12±0.5％、酸度0.7±0.2mmol/10g、糖化力1013±50mg/g.h、液化力1.08±0.2g/g.h、发酵力1.14±0.2(g/g.72h)。

实施例3、根霉菌NX-2和酿酒酵母LJ-1的菌制剂复配双曲在固态酿造白酒中的应用

将实施例2制备的根霉菌NX-2和酿酒酵母LJ-1菌制剂按比例(w:w)10:1混合后，再按照以下双曲发酵固态白酒酿造工艺进行生产应用：

润粮：单甑投粮280kg，润料水温在85℃以上，润粮水总用量为投料量的60％，润粮4h。

蒸粮：润粮后进行蒸粮，蒸粮时间为55min，结束后打入45％量水，量水温度为85℃以上。

配料：按照粮糟比(w:w)1:2.5、用糠量(对粮比)20％，将粮食、糟醅(上排蒸馏取酒后的糟醅)、糠壳拌和均匀。

加曲入窖：双曲(麸曲0.5％(实施例2制备的根霉菌NX-2和酿酒酵母LJ-1菌制剂按比例(w:w)10:1混合得到的麸曲)+大曲5％)混合均匀后或单独加大曲5.5％，平地温入窖。

发酵：发酵周期为15d，结束后蒸馏取酒，连续跟踪3排次。

最终得到双曲发酵固态酿造白酒出酒率为43～46％，较单独加大曲出酒率提高4～7％。

Claims (10)

1.根霉菌NX-2(Rhizopus sp.)菌株，其特征在于：保藏编号为：CCTCC NO：M 2023280。

2.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的根霉菌的活细胞或干菌体。

3.权利要求1所说的根霉菌在制备酿酒曲药上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。

5.权利要求1所述的根霉菌在白酒酿造上的应用。

6.一种菌种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的根霉菌和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

7.根据权利要求6所述的菌种组合物，其特征在于：所述根霉菌与酿酒酵母菌质量比(w:w)8～12:1。

8.根据权利要求6或7所述菌种组合物，其特征在于：所述酿酒酵母菌保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。

9.权利要求6～8任一项所述菌种组合物在制备酿酒曲药、白酒酿造上的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。