CN118165832A - 根霉菌nx-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酿酒发酵技术领域，具体涉及一株根霉菌NX‑1及其应用。针对现有白酒酿造中，具有高糖化力和发酵力的功能微生物菌株较少的问题，本发明提供一株根霉菌NX‑1及其在制备酿酒曲药和酿酒领域的应用。本发明根霉菌NX‑1的保藏编号为：CCTCC NO：M2023279。本发明的根霉菌产糖化酶高，且与酿酒酵母双向强化接种到传统酿酒曲中，能同步提高酿酒曲糖化力及发酵力，进而提升酿酒出酒率。
Description
技术领域
本发明属于酿酒发酵技术领域，具体涉及一株根霉菌NX-1及其应用。
背景技术
“曲为酒之骨”，曲药中包含丰富的微生物及酶系，在酿酒过程中起着重要的糖化和发酵作用。在曲药的微生物菌群结构中，霉菌、酵母菌是其重要构成，其中，霉菌中的根霉属于毛霉目、毛霉科、根霉属菌株，其菌丝较粗，呈分支状，菌丝细胞内无横隔，在培养基上生长迅速，由生长成为分支的假根吸收营养，并从假根着生处产生直立的孢子囊梗不分枝，并在顶端膨大形成孢子囊孕育孢子，待孢子囊破裂时释放孢子。酿酒酵母菌在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，其繁殖方式为出芽生殖，其细胞为球形或者卵形。在酿酒过程中，霉菌通过代谢途径可产生糖化酶，进而水解淀粉转化为可利用的还原糖。酵母菌将糖化得到的糖类物质转化为乙醇，因此曲药的糖化力及发酵力是评价其质量的重要指标之一。
曲药中，大曲是酿酒中使用最广泛的品种曲，其中，传统大曲是依靠自然网络环境微生物接种，人工接种功能菌种制作的大曲称为强化大曲，在现有酿酒工艺中，一般采用强化大曲进行酿酒发酵，能够更好地提升酒品质，但目前发现的具有高糖化力及发酵力的功能菌种，尤其是霉菌还较少，有待进一步开发，才能更好地用于制备强化大曲并用于酿酒领域提升酒品质。
发明内容
针对现有白酒酿造中，具有高糖化力和发酵力的功能微生物菌株较少的问题，本发明提供一株根霉菌NX-1及其在制备酿酒曲药和酿酒领域的应用。
本发明首先提供根霉菌(Rhizopus sp.)新菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M2023279。保藏日期为：2023年03月09日；保藏中心为中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编为430072，分类命名为：Rhizopus sp.浓香1号(NX-1)。
其中，上述根霉菌的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
ACCTGACTTCAGATCATAGTTTGAAAGTTACTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAAAAAAAGATCCTGAGACCAGCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATGCGACCCATCACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAGAGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGAAGGGTACTCCTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAATTTTCACAGTGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGGTAAGGCGCTTTAACATAATTAATGATCCTTCCGCAGGTCCCCTTAACGGAAG。
本发明还提供一种微生物菌剂，其含有上述根霉菌的活细胞或干菌体。
本发明还提供上述根霉菌在制备酿酒曲药上的应用。优选地，所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。
本发明还提供上述根霉菌在白酒酿造上的应用。
本发明还提供一种菌种组合物，其含有上述根霉菌和酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。
其中，所述根霉菌与酿酒酵母质量比(w:w)8～12:1。
其中，所述酵母菌保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。记载该酵母菌文献于2022年03月08日公开，公开号为CN 114149933 A，发明名称为：酿酒酵母LJ-1及其应用。
本发明还提供上述菌种组合物在制备酿酒曲药、白酒酿造上的应用。优选地，所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。
更优选地，所述大曲为强化大曲、中温大曲或浓香型大曲。
有益效果：本发明从泸州老窖中温大曲曲粉中，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)为培养基，分离筛选得到一株根霉菌(Rhizopus sp.)新菌株NX-1，其保藏编号为：CCTCCNO：M 2023279。本发明的根霉菌NX-1能够高产糖化酶，且与酿酒酵母双向强化接种到传统酿酒曲中，能同步提高糖化力及发酵力，进而提升酿酒出酒率。
附图说明
图1为本发明实施例1根霉菌NX-1在PDA平板上的菌落形态图；
图2为本发明实施例1根霉菌NX-1基于ITS测序序列扩增结果电泳图谱；其中，M代表marker；1代表根霉菌NX-1；
图3为本发明根霉菌NX-1基于ITS测序序列构建的根霉菌株系统发育树。
本发明根霉菌NX-1的保藏说明：根霉菌(Rhizopus sp.)，其保藏编号为：CCTCCNO：M 2023279。保藏日期为：2023年03月09日；保藏中心为中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编为430072，分类命名为：Rhizopus sp.浓香1号(NX-1)。
具体实施方式
本发明从泸州老窖中温大曲曲粉中筛选分离出一株根霉菌(Rhizopus sp.)新菌株NX-1，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2023279。
本发明的根霉菌NX-1是将泸州老窖中温大曲稀释后涂布于PDA培养基上，于30～31℃筛选培养60～72h，得到所述根霉菌。其中，所述的PDA培养基成分包括：马铃薯浸粉6份、葡萄糖20份、琼脂20份、去离子水1000份。
本发明的根霉菌NX-1在PDA培养基表面生长着匍匐菌丝，其直立孢囊梗为灰黑色，成熟后顶端出现明显黑色孢子囊，经ITS测序后确定为根霉属(Rhizopus sp.)菌株。
本发明的根霉菌NX-1能够高产糖化酶，经茄子瓶纯种扩培后，与具有高发酵力的酿酒酵母LJ-1(Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932)混合，在酿酒曲拌料环节接种，能同时提高酿酒曲糖化力和发酵力，进而提升酿酒出酒率。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所用培养基：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉6份、葡萄糖20份、琼脂20份、去离子水1000份。
产糖化酶菌株初筛培养基：淀粉10g、酵母膏1.5g、磷酸氢二钾1g、硝酸钠1.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、琼脂13g定容1L，调至pH为7。
麸曲培养基：麸皮85wt％、小麦次粉10wt％、糠壳5wt％。
YEPD固体培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏20g，葡萄糖20g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，琼脂20g定容1L，pH自然。
以下实施例所用的酿酒酵母LJ-1保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。
实施例1根霉菌NX-1的分离、筛选与鉴定
1)纯化：取泸州老窖中温大曲曲粉10g于装有无菌玻璃珠、90mL生理盐水的500mL三角瓶中打散，按梯度稀释涂布到PDA平板上，30℃恒温培养，以平板划线法将其接种到新的PDA平板中培养多代，直至肉眼观察所培养菌落无其它外观杂菌干扰。观察菌落形态特征：该菌落在PDA平板中生长具有匍匐菌丝，直立孢囊梗为灰黑色，成熟后顶端出现明显黑色孢子囊。参考《真菌鉴定手册》对菌落进行判断，初步判断其为根霉属，最后将纯化菌种接种在PDA斜面保藏于4℃。
2)初筛：用无菌接种针挑取PDA斜面上的菌株点接于产糖化酶的菌株初筛培养基上，在30℃恒温培养3d测量菌落直径D，然后向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径d，选取霉菌的透明圈d/D值在大于1的14株进行复筛。
3)复筛：将麸曲培养基原料按配比混合均匀，称取60g于三角瓶中，加入36mL70～85℃的热水混和均匀，润料2h后灭菌，取出冷却到30℃，无菌接入3环菌种，放入30℃培养箱培养3d，长满菌丝后取出低温(40℃)8h烘干。按照QB/T4257-2011测定麸曲的水分、糖化力、液化力，筛选出糖化力、液化力相对高的菌株测序。
4)菌种鉴定：将菌株寄送上海派森诺生物科技有限公司进行测序，其中，引物为ITS1(SEQ ID NO:2)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4(SEQ ID NO:3)：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
扩增流程：PCR扩增反应体系：在0.2mL离心管中加入如表1所示成分，轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：预变性95℃，5min，变性95℃，30s，退火58℃，30s，延伸72℃，1min，终延伸72℃，7min，循环数35，反应完成后，取3uL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。
表1 PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 基因组DNA(20ng/μL) | 1.0μL |
| 10×Buffer(含2.5mM Mg2+) | 5.0μL |
| Taq聚合酶(5u/μL) | 1.0μL |
| dNTP(10mM) | 1.0μL |
| ITS1引物(10μM) | 1.5μL |
| ITS4引物(10μM) | 1.5μL |
| ddH2O | 39.0μL |
| 总体积 | 50.0μL |
将测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列对比，其中一株编号为NX-1的菌株(图1)的扩增结果电泳图谱如图2所示，其ITS如SEQ ID NO:1所示，通过建立系统发育树(图3)，确定该菌株NX-1为根霉菌(Rhizopus sp.)，命名为根霉浓香1号(NX-1)，于2023年03月09日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2023279。
实施例2根霉菌NX-1与酿酒酵母LJ-1在麸曲中的应用
1)根霉菌NX-1固态发酵菌制剂生产工艺：
a.配料：按质量比例麸皮：次粉：糠壳＝85:10:5称取原料；
b.润料：水温85℃以上，用水量55％润料；
c.蒸煮灭菌：常压下2h；带压下0.1MPa、121℃、30min蒸煮灭菌；
d.打散扬冷：灭菌完成后趁热打散并冷却至30℃；
e.接种：根霉菌NX-1菌种量0.6％进行接种；
f.培养：控温培养30℃，湿度90％，培养55h，菌丝结块后须翻拌均匀，并利用通风控制升温幅度，铺料厚度≤30cm；
h.鼓风干燥：45℃，8h低温烘干；
g.按照QB/T4257-2011测定麸曲的水分、糖化力、液化力，根霉菌NX-1固态发酵菌制剂的水分8.57±0.8％，糖化力1134±100mg/g.h、液化力1.28±0.2g/g.h，还原糖含量35±1.0％。
2)酿酒酵母LJ-1固态发酵菌制剂生产工艺：
a.配料：按比例麸皮：糠壳：小麦粉＝50:1:1称取原料；
b.润料：水温85℃以上，用水量70％润料；
c.蒸煮灭菌：常压下2h；带压下0.1MPa、121℃、30min蒸煮灭菌；
d.打散扬冷：灭菌完成后趁热打散并冷却至28℃；
e.接种：酿酒酵母菌种量1.0％进行接种；
f.培养：控温培养28℃，湿度90％，培养32h，铺料厚度≤30cm；
h.鼓风干燥：40℃，8h低温烘干；
酿酒酵母固态发酵菌制剂的酵母数量为1.3*109～1.6*109个/g。
将根霉菌NX-1和酿酒酵母LJ-1菌制剂按比例(w:w)10:1混合，通过测定混合后曲药指标为水分8.62±0.5％、酸度0.8±0.2mmol/10g、糖化力1045±50mg/g.h、液化力1.15±0.2g/g.h、发酵力1.2±0.2(g/g.72h)。
实施例3根霉菌NX-1与酿酒酵母LJ-1在强化大曲中应用
将根霉菌NX-1活化培养后接种到茄子瓶PDA培养基上，30℃恒温培养56h，用无菌水洗下孢子，根霉菌NX-1孢子液接种量为培养基质的0.8％。将酿酒酵母LJ-1菌种于无菌条件下接种至茄子瓶YEPD固体培养基中，30℃恒温培养48h，用无菌水洗下茄子瓶斜面培养基上的酵母，使酿酒酵母LJ-1菌体数量接种量为培养基质的1％。在大曲拌料环节接种到麦料上，按照中温大曲培养工艺进行大曲制作，培菌发酵结束，储存90天后检测理化指标，结果如表2，强化大曲是指接种了根霉菌NX-1、酿酒酵母LJ-1的大曲，传统大曲是指常规制作方式自然接种不添加纯培养菌种。表2可知，强化大曲的酯化力、糖化力、发酵力显著优于传统大曲。
表2大曲理化指标对比
实施例4根霉菌NX-1与酿酒酵母LJ-1在白酒酿造中应用
将实施例3制备的强化大曲分别按照中温大曲常规工艺翻曲储存3个月之后，按照以下浓香型白酒生产工艺进行生产：
润粮：单甑投粮280kg，润料水温在85℃以上，润粮水总用量为投料量的60％，润粮4h。
拌糟：按照相同的粮糟比，用糠量(对粮比)≤20％，将粮食、糟醅、糠壳拌和均匀。
上甑：轻撒匀铺、探气上甑，上甑时间控制在40min。
蒸馏：缓火蒸馏，保证流酒温度30℃。
取酒：分段摘酒、计重。
出甑、打量水：量水温度要求在85℃以上，控制入窖糟水分在52％。
摊晾加曲：曲药用量(对粮比)20％，分别加入同时期制作强化大曲、传统大曲。
入窖：平地温入窖。
发酵：发酵周期为45d。采用续糟配料生产工艺，连续跟踪3排。得到强化大曲固态酿造白酒出酒率为42～45％，较普通传统大曲出酒率提高3～6％，且酒样中的香味物质含量如表3所示，采用本发明根霉菌NX-1与酿酒酵母LJ-1制备的强化大曲固态酿造的白酒风味物质成分明显优于传统大曲。
表3酒样数据对比
Claims (10)
1.根霉菌NX-1(Rhizopus sp.)菌株，其特征在于：保藏编号为：CCTCC NO：M 2023279。
2.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的根霉菌的活细胞或干菌体。
3.权利要求1所述的根霉菌在制备酿酒曲药上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。
5.权利要求1所述的根霉菌在白酒酿造上的应用。
6.一种菌种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的根霉菌和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
7.根据权利要求6所述的菌种组合物，其特征在于：所述根霉菌与酿酒酵母菌质量比(w:w)8～12:1。
8.根据权利要求6或7所述的菌种组合物，其特征在于：所述酿酒酵母菌保藏编号为：CCTCC NO：M 2020932。
9.权利要求6～8任一项所述的菌种组合物在制备酿酒曲药、白酒酿造上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述酿酒曲药包括麦曲、大曲、小曲、麸曲、红曲中至少一种。
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|---|---|---|---|
| CN202311808684.3A CN118165832A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 根霉菌nx-1及其应用 |
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Publications (1)
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| CN202311808684.3A Pending CN118165832A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 根霉菌nx-1及其应用 |
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2023
- 2023-12-26 CN CN202311808684.3A patent/CN118165832A/zh active Pending
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