CN108103046A

CN108103046A - 一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN108103046A
Application number: CN201810145937.6A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 王振栋
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108103046B; US20190249158A1; US10465177B2

Abstract

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一系列麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，应用于制备海藻糖，具有比较好的效果。本发明还将麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体在E.coli BL21(DE3)中进行了表达、发酵优化酶，可显著提高酶的产量。

Description

一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖，同时具有高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自1995年以来，日本、美国和欧盟等先后批准海藻糖可以用作食品添加剂。2005年，我国卫生部正式批准海藻糖为新资源食品。

1993年日本林原生化研究所首次发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作为底物，这两种酶协同作用，可以生成海藻糖，并且率先实现了海藻糖工业化生产。目前，我国已有公司开始生产海藻糖，但产品性能、产率与进口产品存在一定差距，并且生产成本一直居高不下。更为严峻的是，为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力。因此如何提升海藻糖产率，实现海藻糖低成本规模化制备，使其走向大众消费者的餐桌成为学术界和产业界关注的热点。

目前，工业化生产海藻糖主要通过两种方法：①利用海藻糖合成酶，以麦芽糖作为底物，通过分子内转糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作为底物，经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖。两种方法生产海藻糖产率相近，但是，从生产成本以及周期考虑，以淀粉作为底物制备海藻糖，工艺更为简便，成本更为低廉。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖，更具优势。

国内外双酶法生产海藻糖包括中低温酶系(来源菌包括Arthrobacter sp.Q36、Arthrobacter ramosus S34、Brevibaterium helvolum等)和高温酶系(来源菌包括Sulfolobus solfataricus KM1和Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909等)。高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖，不容易在生产过程中污染杂菌。但是，高温酶系相对于中低温酶系，蛋白表达量低，不利于其工业化应用。

发明内容

基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活，为其工业化生产创造条件。

本发明提供了具有酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的突变体，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140、202、218、323、338或404位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖水解酶相比，酶活提高。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M140L。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，突变体命名为L202P。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为L218D。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为Y323G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为F338S。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第404位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，突变体命名为I404T。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，同时将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/Y323G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/L218D/Y323G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)、将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)、将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)、将第404位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体。

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞。

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清液即为麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体的粗酶液。

所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，是pET系列、pUC系列或pGEX中的任意一种。

所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。

所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的重组大肠杆菌生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，是将携带了编码所述突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T的基因的重组菌接种至发酵培养基中，37℃培养8～14h，以0.1g L^-1h^-1的流速流加乳糖，并在30℃诱导10～20h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在30℃进行诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体如下：将在-80℃的甘油管中保藏的菌种以2‰的接种量接种到LB培养基中，并于37℃、200rpm的条件培养10小时；之后，以5％的接种量转接到发酵培养基中，37℃培养8～14h后，加入诱导剂进行诱导并改变温度，继续发酵；发酵培养结束后离心，收集菌体，破壁，离心所得上清液即为所需粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述破壁采用超声破碎仪或高压匀浆机。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：磷酸氢二铵4.0g，磷酸二氢钾13.5g，柠檬酸1.7g，七水硫酸镁1.4g，蛋白胨1.2g，酵母膏2.4g，甘油8.0g，金属离子液10mL，加氨水调pH至6.5～7.5。所述金属离子液：以5M HCl为母液，FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂40.1g/L。

本发明提供了一系列在宿主菌中酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，在适当的培养条件下，突变体M140L、L202P、L218D、Y323G、F338S、I404T、L202P/Y323G、L202P/L218D/Y323G、M140L/L202P/L218D/Y323G、M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S、M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活分别为野生酶的1.3倍、1.3倍、1.3倍、1.3倍、1.5倍、1.0倍、1.5倍、1.9倍、2.2倍、2.4倍。同时，突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T的Km值比野生酶低，说明突变体对底物的亲和性增强。

附图说明

图1：突变体MTHase的生长情况；

图2：突变体MTHase的酶活。

具体实施方式

实施例1：野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶的表达

从实验室前期保藏的甘油管中，接种TreZ/pET24a(+)/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)。大肠杆菌在25℃摇床培养发酵24h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol·L^-1pH 8.0Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液重新悬浮，混匀。用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，然后12000rpm离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

实施例2：麦芽寡糖基海藻糖水解酶单突变体的制备及表达

(1)突变体的制备

根据Sulfolobus acidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因序列，分别设计并合成引入M140L、L202P、L218D、Y323G、F338S和I404T突变的引物，对麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ进行定点突变，分别测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的表达载体TreZ/pET-24a(+)为模板。

引入M140L突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GTATTGAACTGCTGCCGGTGGCGCA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TGCGCCACCGGCAGCAGTTCAATAC-3’(下划线为突变碱基)

引入L202P突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAATTATCTGCCGGGCCTGGGCCCGTATTTC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GAAATACGGGCCCAGGCCCGGCAGATAATTG-3’(下划线为突变碱基)

引入L218D突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CGCCGTGGGGCGACACCTTCAATTTTGACGAC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GTCGTCAAAATTGAAGGTGTCGCCCCACGGCG-3’(下划线为突变碱基)

引入Y323G突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAAGGAAAAGGACGGCTATTATCAGGACTTTGGTC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GACCAAAGTCCTGATAATAGCCGTCCTTTTCCTTG-3’(下划线为突变碱基)

引入F338S突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GACATTGAGAAGACGTCTAAGGATGTGTTTGTG-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-CACAAACACATCCTTAGACGTCTTCTCAATGTC-3’(下划线为突变碱基)

引入I404T突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GCGACCCTGTATACTCTGAGCCCGT-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-ACGGGCTCAGAGTATACAGGGTCGC-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mmol·L^-1)4μL，正向引物(10μmol·L^-1)1μL，反向引物(10μmol·L^-1)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入蒸馏水至50μL。

PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min 20s；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

在验证正确的PCR产物中加入Dpn I，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化E.coliJM109感受态细胞，将转化产物涂布于含有含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养10～12h，挑取阳性克隆，LB液体培养基培养8～10h。测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达突变体M140L、L202P、L218D、Y323G、F338S和I404T的重组菌株。

(2)突变体的表达

突变体表达过程如实施例1所述。

实施例3：麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力分析

酶活定义：每分钟相当于生成一微摩尔麦芽寡糖所需要的酶量。

酶活测定方法：预热：取0.45mL的2％麦芽糊精溶液(DE 9～13pH 6.0磷酸缓冲液)于试管内，置于60℃水浴锅中预热10min。反应：加入0.05mL稀释后的发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入0.1mL的NaOH溶液(4mol/L)终止反应，取0.3mL的反应液于具塞试管中，加入蒸馏水0.7mL和4mLDNS，振荡均匀，终止反应。煮沸7min，冷却。测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和突变体摇瓶培养24h OD_600nm及酶活力列于表1，结果表明，所有突变体的酶活均高于野生型。

表1野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和单突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例4：麦芽寡糖基海藻糖水解酶双突变体的制备和表达及酶活力分析

以实施例2构建的突变体L202P的质粒作为双突变的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体L202P的基因的质粒进行定点突变，构建双突变体L202P/Y323G。测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶双突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到双突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和双突变体的摇瓶培养24h的OD_600nm及酶活力列于表2，结果表明，突变体L202P/Y323G的酶活高于野生型。

表2野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和双突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例5：麦芽寡糖基海藻糖水解酶三突变体的制备和表达及酶活力分析

以实施例2和4构建的突变体L202P/Y323G的质粒作为三突变的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体L202P/Y323G的基因的质粒进行定点突变，构建三突变体L202P/L218D/Y323G。测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶三突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到三突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和三突变体的摇瓶培养24h的OD_600nm及酶活力列于表3，结果表明，突变体的酶活高于野生型。

表3野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和三突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例6：麦芽寡糖基海藻糖水解酶四突变体的制备和表达及酶活力分析

以实施例5构建的三突变体L202P/L218D/Y323G的质粒作为四突变体的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体L202P/L218D/Y323G的基因的质粒进行定点突变，构建四突变体M140L/L202P/L218D/Y323G。测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶四突变体的编码基因是否正确；并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到四突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和四突变体的摇瓶培养24h的OD_600nm及酶活力列于表4，结果表明，突变体的酶活高于野生型。

表4野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和四突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例7：麦芽寡糖基海藻糖水解酶五突变体的制备和表达及酶活力分析

以实施例2构建的突变体M140L/L202P/L218D/Y323G的质粒作为五突变体的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体M140L/L202P/L218D/Y323G的基因的质粒进行定点突变，构建五突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S。测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶五突变体的编码基因是否正确；并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到五突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和五突变体的摇瓶培养24h的OD_600nm及酶活力列于表5，结果表明，突变体的酶活高于野生型。

表5野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和五突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例8：麦芽寡糖基海藻糖水解酶五突变体的制备和表达及酶活力分析

以实施例2构建的突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S的质粒作为六突变体的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S的基因的质粒进行定点突变，构建六突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T。测序确认麦芽寡糖基海藻糖水解酶五突变体的编码基因是否正确；并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到六突变麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶(WT)和六突变体的摇瓶培养24h的OD_600nm及酶活力列于表6，结果表明，六突变体的酶活为野生酶的2.4倍。

表6野生型麦芽寡糖基海藻糖水解酶和六突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活力

实施例9：麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T的底物亲和性和海藻糖转化率分析

测定野生酶及突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T在60℃下对麦芽六糖的底物亲和性，结果如表7所示。

结果显示，与野生酶(WT)相比，突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T的K_m值有所下降，K_m值的降低表明了突变体对底物的亲合力得到了增强。

表7麦芽糖寡糖基海藻糖水解酶突变体的Km值

在海藻糖合成过程中，以150g/L的麦芽糊精(DE值5～7)作为底物，调节初始pH为5.5，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，再分别加入MTHase 20U/g和MTSase 80U/g，比例为4：1。反应条件为60℃，150r/min，反应30～40h后煮沸样品终止反应并处理。产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算产率。HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL min^-1，柱温40℃，NH₂柱(APS-2HYPERSIL,Thermo Scientific)，示差折光检测器(RID)。经过计算分析，野生型MTHase的转化率达到76.1％，而突变体MTHase的转化率则达到73.8％，可认为其对海藻糖转化率无明显影响。

实施例10：突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T 3L发酵罐中发酵产酶实验

1)种子活化：从-80℃冰箱中取出保存的甘油管，用接种针蘸取少量菌液，划线接种于LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃，200r·min^-1，培养8-10h。

2)种子培养：从上一步活化的菌液中吸取100μL菌液接种于50mL种子发酵培养基中，37℃，200r·min^-1，培养8h。

3)3L发酵罐培养：采用NBS 3L全自动发酵罐，初始装液量为1.2L。将上步所得的种子液以8％的接种量接入发酵罐中，同时加入抗生素，设置罐内初始溶氧为100％，初始转速300r min^-1；设置pH值为7.0。接入种子后将发酵罐的溶氧与转速相偶联以控制罐内溶氧维持在30％左右，接种7～8h后发酵罐内碳源耗尽出现溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h^-1指数流加补料液进行补料。每隔3h取样一次。整个发酵过程中通过流加25％氨水调节pH，使罐内pH始终维持在6.8～7.2，当OD₆₀₀达到50时，控制诱导温度在30℃，以0.1g·L^-1·h^-1的流速流加乳糖进行诱导。

实施例11：突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T发酵生长及产酶效果

在3L罐中诱导温度为30℃，菌体浓度OD₆₀₀为50，诱导剂浓度(乳糖流加速率为0.1g·L^-1·h^-1)的条件下，对菌体进行诱导产生目的蛋白。结果如图1，OD₆₀₀在50时菌体的生长速率良好，乳糖流加速率对菌体生长无明显影响，菌体OD₆₀₀最大值为181.5。对应的酶活测定结果如图2，其中酶活最高达到444.8U·mL^-1。野生型MTHase的酶活在上述条件下最高达到82U·mL^-1，突变体MTHase的改造效果比较显著，提高约5倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种麦芽寡糖基海藻水解酶突变体及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1671

<212> DNA

<213> Sulfolobus acidocaldarius

<400> 1

atgtttagct ttggcggcaa cattgagaag aataaaggca tctttaagct gtgggcaccg 60

tatgtgaata gcgtgaaact gaagctgagc aaaaagctga ttccgatgga gaaaaatgat 120

gaaggctttt ttgaggttga aattgacgat attgaagaaa atctgaccta tagctacatt 180

attgaggaca aacgtgaaat tccggatcca gccagccgtt atcagccgct gggcgtgcat 240

gataagagcc agctgatccg taccgactat caaatcctgg atctgggtaa agtgaaaatc 300

gaagatctga tcatttatga actgcatgtg ggtacgttta gccaggaggg taactttaag 360

ggcgtgatcg aaaaactgga ttacctgaaa gacctgggta tcaccggtat tgaactgatg 420

ccggtggcgc agtttccggg caatcgtgat tggggctatg atggcgtgtt tctgtacgcg 480

gtgcaaaata cctatggcgg tccatgggaa ctggcgaaac tggtgaatga agcgcataaa 540

cgtggcattg cggttattct ggacgtggtt tacaatcata ttggcccaga gggcaattat 600

ctgctgggcc tgggcccgta tttcagcgat cgttataaga cgccgtgggg cctgaccttc 660

aattttgacg accgtggctg cgatcaggtg cgtaaattca tcctggagaa tgtggaatat 720

tggtttaaaa cgttcaagat cgacggcctg cgtctggatg cagtgcatgc gatttttgat 780

aatagcccga aacatattct gcaggaaatc gcggaaaaag cgcaccaact gggcaagttt 840

gtgattgccg aaagcgatct gaatgatccg aaaattgtga aggacgattg tggctacaag 900

attgatgcgc agtgggtgga tgatttccac catgcggtgc atgcgtttat taccaaggaa 960

aaggactact attatcagga ctttggtcgt attgaagaca ttgagaagac gtttaaggat 1020

gtgtttgtgt atgatggcaa atatagccgt tatcgtggtc gcacccatgg tgcgccggtg 1080

ggcgatctgc cgccacgtaa atttgtggtg tttattcaga atcatgacca ggttggcaat 1140

cgtggcaatg gcgaacgtct gagcattctg accgataaaa ccacctatct gatggcggcg 1200

accctgtata ttctgagccc gtatatcccg ctgattttca tgggcgaaga gtattatgaa 1260

accaatccgt ttttcttctt cagcgatttt agcgacccgg ttctgatcaa aggtgtgcgt 1320

gagggccgtc tgaaagagaa taaccagatg attgatccgc agagcgagga agcctttctg 1380

aaaagcaaac tgagctggaa aatcgatgag gaagtgctgg attattacaa gcagctgatt 1440

aacatccgta aacgttacaa taattgcaaa cgtgtgaaag aagttcgtcg tgaaggtaac 1500

tgcattaccc tgattatgga gaaaattggt attattgcga gctttgatga catcgtgatt 1560

aatagcaaaa ttaccggcaa tctgctgatt ggcattggct ttccgaagaa gctgaaaaaa 1620

gatgaactga ttaaggttaa tcgcggtgtg ggcgtgtatc aactggaata a 1671

<210> 2

<211> 556

<212> PRT

<213> Sulfolobus acidocaldarius

<400> 2

Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn Ile Glu Lys Asn Lys Gly Ile Phe Lys

1 5 10 15

Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val Lys Leu Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Leu Ile Pro Met Glu Lys Asn Asp Glu Gly Phe Phe Glu Val Glu Ile

35 40 45

Asp Asp Ile Glu Glu Asn Leu Thr Tyr Ser Tyr Ile Ile Glu Asp Lys

50 55 60

Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val His

65 70 75 80

Asp Lys Ser Gln Leu Ile Arg Thr Asp Tyr Gln Ile Leu Asp Leu Gly

85 90 95

Lys Val Lys Ile Glu Asp Leu Ile Ile Tyr Glu Leu His Val Gly Thr

100 105 110

Phe Ser Gln Glu Gly Asn Phe Lys Gly Val Ile Glu Lys Leu Asp Tyr

115 120 125

Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Gly Ile Glu Leu Met Pro Val Ala Gln

130 135 140

Phe Pro Gly Asn Arg Asp Trp Gly Tyr Asp Gly Val Phe Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Gln Asn Thr Tyr Gly Gly Pro Trp Glu Leu Ala Lys Leu Val Asn

165 170 175

Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Ala Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn

180 185 190

His Ile Gly Pro Glu Gly Asn Tyr Leu Leu Gly Leu Gly Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Asp Arg Tyr Lys Thr Pro Trp Gly Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asp

210 215 220

Arg Gly Cys Asp Gln Val Arg Lys Phe Ile Leu Glu Asn Val Glu Tyr

225 230 235 240

Trp Phe Lys Thr Phe Lys Ile Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His

245 250 255

Ala Ile Phe Asp Asn Ser Pro Lys His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu

260 265 270

Lys Ala His Gln Leu Gly Lys Phe Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn

275 280 285

Asp Pro Lys Ile Val Lys Asp Asp Cys Gly Tyr Lys Ile Asp Ala Gln

290 295 300

Trp Val Asp Asp Phe His His Ala Val His Ala Phe Ile Thr Lys Glu

305 310 315 320

Lys Asp Tyr Tyr Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Arg Tyr Arg

340 345 350

Gly Arg Thr His Gly Ala Pro Val Gly Asp Leu Pro Pro Arg Lys Phe

355 360 365

Val Val Phe Ile Gln Asn His Asp Gln Val Gly Asn Arg Gly Asn Gly

370 375 380

Glu Arg Leu Ser Ile Leu Thr Asp Lys Thr Thr Tyr Leu Met Ala Ala

385 390 395 400

Thr Leu Tyr Ile Leu Ser Pro Tyr Ile Pro Leu Ile Phe Met Gly Glu

405 410 415

Glu Tyr Tyr Glu Thr Asn Pro Phe Phe Phe Phe Ser Asp Phe Ser Asp

420 425 430

Pro Val Leu Ile Lys Gly Val Arg Glu Gly Arg Leu Lys Glu Asn Asn

435 440 445

Gln Met Ile Asp Pro Gln Ser Glu Glu Ala Phe Leu Lys Ser Lys Leu

450 455 460

Ser Trp Lys Ile Asp Glu Glu Val Leu Asp Tyr Tyr Lys Gln Leu Ile

465 470 475 480

Asn Ile Arg Lys Arg Tyr Asn Asn Cys Lys Arg Val Lys Glu Val Arg

485 490 495

Arg Glu Gly Asn Cys Ile Thr Leu Ile Met Glu Lys Ile Gly Ile Ile

500 505 510

Ala Ser Phe Asp Asp Ile Val Ile Asn Ser Lys Ile Thr Gly Asn Leu

515 520 525

Leu Ile Gly Ile Gly Phe Pro Lys Lys Leu Lys Lys Asp Glu Leu Ile

530 535 540

Lys Val Asn Arg Gly Val Gly Val Tyr Gln Leu Glu

545 550 555

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtattgaact gctgccggtg gcgca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcgccaccg gcagcagttc aatac 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caattatctg ccgggcctgg gcccgtattt c 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaatacggg cccaggcccg gcagataatt g 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgccgtgggg cgacaccttc aattttgacg ac 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcgtcaaaa ttgaaggtgt cgccccacgg cg 32

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaggaaaag gacggctatt atcaggactt tggtc 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaccaaagtc ctgataatag ccgtcctttt ccttg 35

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacattgaga agacgtctaa ggatgtgttt gtg 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cacaaacaca tccttagacg tcttctcaat gtc 33

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgaccctgt atactctgag cccgt 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgggctcag agtatacagg gtcgc 25

Claims

1.一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶的突变体，其特征在于，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140、202、218、323、338或404位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。

2.根据权利要求1所述的一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶的突变体，其特征在于，

所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M140L；

或，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，突变体命名为L202P；

或，所述突变体是将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为L218D；

或，所述突变体是将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为Y323G；

或，所述突变体是将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为F338S；

或，所述突变体是将第404位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，突变体命名为I404T；

或，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，同时将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/Y323G；

或，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/L218D/Y323G；

或，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G；

或，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)、将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S。

或，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)、将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)、将第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)、将第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)、将第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)、将第404位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体或重组细胞。

5.制备权利要求1或2所述突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清液即为突变体麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。

6.一种生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，将表达权利要求1或2所述突变体的重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，37℃培养8～14h，以0.1g L^-1h^-1的流速流加乳糖，并在30℃诱导10～20h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每L含有：磷酸氢二铵4.0g，磷酸二氢钾13.5g，柠檬酸1.7g，七水硫酸镁1.4g，蛋白胨1.2g，酵母膏2.4g，甘油8.0g，金属离子液10mL，调pH至6.5～7.5。

8.权利要求1或2所述突变体在生产海藻糖中的应用。

9.权利要求3所述基因或权利要求4所述载体或重组细胞在生产海藻糖中的应用。

10.用于生产海藻糖的酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述突变体。