CN112553268B - 一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置 - Google Patents

一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶制备领域，具体公开了一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置，包括以下步骤往反应釜中加入水、淀粉、α‑淀粉酶进行混合，然后调节pH值，接着加入无水氯化钙，启动反应釜的搅拌轴搅拌上述混合物、多个超声换能器、加热器和测温器，启动循环通路将反应釜底部的混合物先向外转移粉碎过滤，再送回反应釜之内；分阶段加热混合物以及保温；当液化DE值为15之后停止加热，混合物在搅拌和循环冷却至常温，调节混合物的pH值，然后加入普鲁兰酶、MTSase、MTHase和α/β‑CGTase，重新加热并在45℃下保温、调节混合物的pH值，最后加入糖化酶进行混合，最终得到产物。通过超声辅助酶促合成海藻糖，对提高以大米淀粉为基本原料合成海藻糖转化率效果明显。

Description

一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置
技术领域
本发明属于酶制备领域，特别涉及一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置。
背景技术
长年生活在沙漠地带的一些昆虫和植物，在中午的高温下几乎被干燥脱水，处在生理学上的假死状态，但一经降雨补充水分，数小时后就能复活。英国剑桥大学的学者对这些隐生生物的研究表明，这种复活现象是由于其体内存在高浓度的海藻糖。另外，一些蛙类等生物能在严寒条件下生存下来，其重要的原因也在于海藻糖对细胞的保护作用。许多生物在胁迫环境（如饥饿、高温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等）下表现出的抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系。酵母在脱去90％水分，复水后仍能复活，在长期饥饿条件下，酵母的存活率依赖于体内海藻糖的含量。有报道对酵母进行热休克和乙醇休克处理，可引起胞内海藻糖含量明显增加。
海藻糖是一种对于环境变化形成的应激状态具有高抗性的物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物。在各种恶劣环境下，海藻糖表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子良好的保护作用。最新的研究表明，外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用，因此有人把海藻糖称为“生命之糖”。
随着社会生活水平的提高，海藻糖的需求量在不断增大。由于海藻糖产率低、生产工艺复杂，产品价格仍然偏高，限制了海藻糖的推广应用，如何提高海藻糖产量、如何改进生产方法、如何降低生产成本是研究海藻糖的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置，提高合成海藻糖的效率。
为实现上述目的，本发明提供了一种超声辅助酶合成海藻糖的方法，包括以下步骤：
S1.往反应釜中加入水、150g/L大米淀粉、活性为15U/g的α-淀粉酶，用酸调至pH值为6.2，同时加入无水氯化钙，使最终浓度为2g/L；
S2.启动反应釜的搅拌轴搅拌上述混合物，同时，启动反应釜之中被上述混合物浸没的超声换能器，超声换能器的实际功率为100-200w、振动频率为30kHz，启动反应釜内的加热器，启动循环通路将反应釜底部的混合物先向外转移粉碎过滤，再送回反应釜之内；
S3.加热混合物至75℃，当混合物的温度等于75℃后，保温若干时间，加热混合物至90℃，保温若干时间；
S4.当液化DE值为15之后停止加热，混合物在搅拌和循环冷却至常温，同时调节混合物的pH为6；
S5.加入0.75U/ml的普鲁兰酶，加入2.4U/ml的MTSase和MTHase，加入浓度为1.4U/ml的α/β-CGTase，重新加热并在45℃下保温25-30h，调节混合物的pH值为4.5；
S6.加入糖化酶，同时升高温度至60℃并保温10-12h；
S7.得到产物。
作为上述方案的改进，所述MTSase通过B.subtilis/pHY300PLK-PgsiB-Y发酵而来，所述MTHase通过B.subtilis/pHY300PLK-Pxyl-Z发酵而来，所述α/β-CGTase是通过B.subtilis/pHY300PLK- PhpaII-PamyQ’-CGT发酵而来。
作为上述方案的改进，步骤S4中，打开反应釜的换气口散热，混合物在搅拌和循环中自然冷却。
为实现上述目的，本发明提供了一种超声辅助酶合成海藻糖的装置，包括反应釜，所述反应釜的内侧具有搅拌桨、加热器和测温器，所述反应釜的上端具有进液口及其阀门，所述反应釜的下端具有排液口及其阀门，其特征在于：所述反应釜的下端排液口设置两条分路分别为第一分路和第二分路，所述第一分路用于将混合物排至外界，所述第二分路折返回反应釜的进液口，所述第二分路上设有泵体和粉碎器，所述反应釜的侧壁设有若干超声换能器，各个所述超声换能器的发射端朝向反应釜的内侧。
作为上述方案的改进，所述第二分路在避开粉碎器的位置设置第三分路及其阀门，用于通过不需要进一步粉碎的混合物。
作为上述方案的改进，所述第二分路上设有取样口。
作为上述方案的改进，所述搅拌桨的叶片为螺旋叶片，在所述搅拌桨旋转时，螺旋叶片带动混合物上升，混合物从反应釜靠近内侧的位置下降。
本发明具有如下有益效果：
1、采用超声波辅助酶促合成海藻糖方法，有效提高了海藻糖转化率，节约了资源，降低成本，并且海藻糖产量高，利于工业生产应用。
2、淀粉液化和酶催化合成反应，在同一反应釜中进行，省去了物料转移的麻烦，节省劳动时间，提高效率。
3、采取超微粉碎和物料循环流动条件下，淀粉液化，液化效率提高，加热、冷却均匀，浆料可上下循化流动，不存在搅拌死角。
附图说明
图1是一种实施例下反应釜及内部的结构图。
附图标记说明：10、反应釜；11、进液口；21、排液口；13、搅拌桨；14、加热器；15、测温器；16、超声换能器；21、泵体；22、粉碎器；31、第一分路；32、第二分路；33、第三分路；34、取样口。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
参照图1，本发明公开了一种超声辅助酶合成海藻糖的方法及装置。
装置以现有的反应釜10为基础，所述反应釜10的内侧具有搅拌桨13、加热器14和测温器15，所述反应釜10的上端具有进液口11及其阀门，所述反应釜10的下端具有排液口12及其阀门。进一步，所述反应釜10的下端排液口12设置两条分路分别为第一分路31和第二分路32，所述第一分路31用于将混合物排至外界，所述第二分路32折返回反应釜10的进液口11，所述第二分路32上设有泵体21和粉碎器22，所述反应釜10的侧壁设有若干超声换能器16，各个所述超声换能器16的发射端朝向反应釜10的内侧。图1中的箭头表示混合物的流动方向，混合物在反应釜10内搅拌后，被泵体21驱动沿左侧的第二分路32折返回进液口11，如此再重新投入反应釜10。
本实施例中，反应釜10的侧壁钻若干个孔用于插入若干个超声换能器16，然后反应釜10的内侧做好密封，在缝隙处设置密封圈。各个超声换能器16均匀分布，提供均匀地振动，各个超声换能器16的导线、信号线均连接计算机。加热器14为加热棒，悬置或固定在反应釜10内即可。
作为优选，所述第二分路32在避开粉碎器22的位置设置第三分路33及其阀门，用于通过不需要进一步粉碎的混合物。本实施例中，粉碎器22为盘式超微高速剪切粉碎机。如果混合物已经足够细小，则可以不经过粉碎器22；此时所述第二分路32在避开粉碎器22的位置设置第三分路33及其阀门，图1中可以看到第三分路33的起点在粉碎器22之前，第三分路33的终点在粉碎器22之后。
作为优选，所述第二分路32上设有取样口34，如此可以清楚地监测反应釜10内混合物的反应状况。
作为优选，所述搅拌桨13的叶片为螺旋叶片，在所述搅拌桨13旋转时，螺旋叶片带动混合物上升，混合物从反应釜10靠近内侧的位置下降。图1中标识的箭头表示混合物的流动状态，位于反应釜10中间的混合物被螺旋叶片牵引，而位于反应釜10边缘的混合物自然下降。如此可以保证物料与酶在反应过程中的均一性，消除物料与酶内部的温度梯度，从而提高反应速度和反应效率。
作为优选，测温器15为热电偶温度计。
方法包括以下步骤：、
S1.往反应釜10中加入水、150g/L大米淀粉、活性为15U/g的α-淀粉酶，用酸调至pH值为6.2，同时加入无水氯化钙，使最终浓度为2g/L。
S2.启动反应釜10的搅拌轴搅拌上述混合物，同时，启动反应釜10之中被上述混合物浸没的超声换能器16，超声换能器16的实际功率为100-200w、振动频率为30kHz，启动反应釜10内的加热器14，启动循环通路将反应釜10底部的混合物先向外转移粉碎过滤，再送回反应釜10之内。
S3.加热混合物至75℃，当混合物的温度等于75℃后，保温15min，加热混合物至90℃，保温等待液化DE值变化。为了确保加热过程的稳定，在75℃以下，按2℃/min的速率加热，在75℃以上，按3℃/min的速率加热。
S4.当液化DE值为15之后停止加热，混合物在搅拌和循环冷却至常温（混合物冷却时可以采用敞开自然冷却，也可以插入制冷棒），同时调节混合物的pH为6.0。
S5.加入0.75U/ml的普鲁兰酶，加入2.4U/ml的MTSase和MTHase，加入浓度为1.4U/ml的α/β-CGTase，重新加热并在45℃下保温25-30h，调节混合物的pH值为4.5。
S6.加入糖化酶，同时升高温度至60℃并保温10-12h。
S7.得到产物。
上文提到的B.subtilis/pHY300PLK-PgsiB-Y、B.subtilis/pHY300PLK-Pxyl-Z和B.subtilis/pHY300PLK- PhpaII-PamyQ’-CGT均来之江南大学食品科学与技术国家重点实验室。
MTSase、MTHase、α/β-CGTase的发酵方法为：
挑取单菌落于液体LB(含新霉素20ug/ml)培养 8-10h，按5%接种量将种子液转接到TB培养基(含新霉素20ug/ml)中，在37℃摇床中培养2.5h后，继续在33℃摇床培养48h左右。将发酵液于4℃、8000r/min 离心15min收集菌体，浓缩破壁得到粗酶液。
对于培养基：
LB液体培养基：酵母粉为5.0g，蛋白胨为10.0g，氯化钠为10.0g；
LB固体培养基：将1.5～2.0g 的琼脂糖加入到100ml的LB液体培养基中；
TB培养基：蛋白胨为12.0g，酵母粉为24.0g，甘油为5.0g，KH2PO4 为2.31g，K2HPO4•3H2O为16.43g。
以上述步骤为基础，对比实例取消超声换能器16，其他地方未做变动，得到产物的转换率为71.4%。
以上述步骤为基础，实施例1将超声换能器16的实际频率定为100w，其他地方未做变动，得到产物的转换率为81.6%。
以上述步骤为基础，实施例2将超声换能器16的实际频率定为150w，其他地方未做变动，得到产物的转换率为82.1%。
以上述步骤为基础，实施例2将超声换能器16的实际频率定为150w，其他地方未做变动，得到产物的转换率为82.3%。
由此可知，通过超声辅助酶促合成海藻糖，对提高以大米淀粉为基本原料合成海藻糖转化率效果明显。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.一种超声辅助酶合成海藻糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.往反应釜中加入水、150g/L大米淀粉、活性为15U/g的α-淀粉酶，用酸调至pH值为6.2，同时加入无水氯化钙，使最终浓度为2g/L；
S2.启动反应釜的搅拌轴搅拌上述混合物，同时，启动反应釜之中被上述混合物浸没的超声换能器，超声换能器的实际功率为100-200w、振动频率为30kHz，启动反应釜内的加热器，启动循环通路将反应釜底部的混合物先向外转移粉碎过滤，再送回反应釜之内；
S3.加热混合物至75℃，当混合物的温度等于75℃后，保温若干时间，加热混合物至90℃，保温若干时间；
S4.当液化DE值为15之后停止加热，混合物在搅拌和循环冷却至常温，同时调节混合物的pH为6；
S5.加入0.75U/ml的普鲁兰酶，加入2.4U/ml的MTSase和MTHase，加入浓度为1.4U/ml的α/β-CGTase，重新加热并在45℃下保温25-30h，调节混合物的pH值为4.5；
S6.加入糖化酶，同时升高温度至60℃并保温10-12h；
S7.得到产物；
MTSase、MTHase、α/β-CGTase的发酵方法为：
挑取单菌落于液体LB含新霉素20ug/ml培养8-10h，按5％接种量将种子液转接到TB培养基含新霉素20ug/ml中，在37℃摇床中培养2.5h后，继续在33℃摇床培养48h；将发酵液于4℃、8000r/min离心15min收集菌体，浓缩破壁得到粗酶液；
对于培养基：
LB液体培养基：酵母粉为5.0g，蛋白胨为10.0g，氯化钠为10.0g；
LB固体培养基：将1.5～2.0g的琼脂糖加入到100ml的LB液体培养基中；
TB培养基：蛋白胨为12.0g，酵母粉为24.0g，甘油为5.0g，KH2PO4为2.31g，K2HPO4·3H2O为16.43g。
2.根据权利要求1所述超声辅助酶合成海藻糖的方法，其特征在于：步骤S4中，打开反应釜的换气口散热，混合物在搅拌和循环中自然冷却。
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