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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenvorbereitung für die Analyse
von Aminosäuren
enthaltenden Proben.
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Die
Bestimmung insbesondere freier (physiologischer) Aminosäuren hat
mittlerweile eine hohe Bedeutung für die meisten Bereiche der
Bioanalytik, wie z.B. in der medizinischen Diagnostik als auch im
Bereich der Untersuchung von Lebens- und Futtermitteln, um metabolische
Prozesse in lebenden Organismen bewerten zu können. Zu diesem Zweck werden
die verschiedensten Fermenter- oder Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Urin) auf
ihre Konzentration an bestimmten Aminosäuren hin untersucht. Es werden
z.B. gaschromatographische Methoden oder Flüssigkeitschromatographie verwendet,
um Aminosäurenkonzentrationen
zu bestimmen. Da es sich bei den zu untersuchenden Proben meist
um komplexe Matrices handelt, müssen
Substanzen (z.B. Proteine, Harnstoff et c.), die eine chromatographische
Auftrennung von Aminosäurengemischen
stören
könnten,
vollständig
entfernt werden. Ferner müssen
diverse feste biologische Matrices (z.B. Pflanzen, Wurzeln, Blätter, Gehirn,
Knochen) so vorbereitet werden, dass die darin vorhandenen freien
Aminosäuren
(AS) quantitativ in eine (wässrige)
Lösung überführt und
weiter aufgereinigt werden können.
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Der
Stand der Technik zur Analyse freier Aminosäuren [Probenvorbereitung, Identifizierung
und Detektion mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)]
wird beschrieben in den Benutzerhandbüchern, EZ:faast®; easy-fast
Aminosäure-Testkit:
Aminosäurenanalysenkits
für Probenvorbereitung,
Derivatisierung und GC- oder LC-Analyse oder EZ:faast for Amino
Acid Analysis in Protein Hydrolysates by GC-MS, USER'S MANUAL, ebenfalls
von Phenomenex.
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In
diesen Handbüchern
wird beschrieben, wie mit Hilfe eines Kits ein möglichst schnelles und präzises Ergebnis
für freie
Aminosäuren
aus Bioflüssigkeiten
in 7 bis 8 Schritten erzielt werden kann. Zunächst werden durch Aufziehen
eines bestimmten Probenvolumens durch eine Festphasenextraktions-Sorptionsspitze
[Solid Phase extraction (SPE) sorption tip] freie Aminosäuren an
einem Harz (saurer Kationenaustauscher) adsorbiert und von störenden Kontaminationen
befreit. Danach erfolgen mit einem Eluenten die Flution der AS vom Harz
und eine anschließende
Derivatisierung der AS durch ein Derivatisierungsreagenz. Dieser
Schritt ist sehr wichtig, um die Aminosäuren in eine flüchtige Form
zu überführen, damit
sie mit der GC aufgetrennt werden können. Dann werden die derivatisierten
AS mittels Flüssig-/Flussig-Extraktion in eine
organische Phase überführt, eingeengt
und an einer GC-Säule
aufgetrennt. Im On-line-Mode werden sie zum Beispiel mittels Flammenionisations detektor
oder Massenspektrometrie detektiert. Als Vergleichssubstanzen dienen
mitgelieferte Standards.
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Mit
dem Verfahren nach dem Stand der Technik sind jedoch Nachteile verbunden.
- 1.) Die mitgelieferten Standards (SD, SD2,
et c.) sind nur bedingt haltbar und müssen häufig gegen frische Standards
ersetzt werden.
- 2.) Es wurde festgestellt, dass die Proben nach der Flüssig-Flüssig-Extraktion
nicht vollständig
von Wassermolekülen
befreit sind. Dies führte
dazu, dass die verwendeten GC-Säulen
zerstört
wurden.
- 4.) Die verwendeten Probenspritzen für die GC-Analytik müssen nach
jeder Probensequenz mit einem bestimmten Agens (1-Bunatnol/Aceton
mit 1:1 Volumenverhältnis)
gespült
werden, um Ablagerungen in der Spritze zu vermeiden. Ansonsten können GC-Spritzen
bei den folgenden Sequenzen mechanisch zerstört werden. Dies führt zu Zeit-
und Probenverlust.
- 5.) Eine Probenvorbereitung für feste biologische Matrices,
die dann weiter mit EZ-fasst analysiert werden können, wird nicht im Handbuch
angeboten.
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Es
ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Vorbereitung
von Proben, welche Aminosäuren
enthalten zu schaffen mit dem eine quantitative Analyse ermöglicht wird,
die im Vergleich zum Stand der Technik zu verbesserten Ergebnissen
führt.
Insbesondere soll eine Analyse aus Feststoffproben ermöglicht werden.
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Ausgehend
vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den
im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es nunmehr möglich
Aminosäuren,
insbesondere freie Aminosäuren
in festen Proben, bevorzugt biologischen Proben zu bestimmen und
genaue quantitative Ergebnisse zu erhalten, wenn eine anschließende Analysemethode
eingesetzt wird.
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Vorteilhafte
Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Im
Folgenden soll die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben
werden.
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Das
Verfahren ist geeignet insbesondere feste Proben einer qualitativen
und quantitativen Bestimmung von Aminosäuren, insbesondere freien Animosäuren zuzuführen.
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Als
Beispiele für
feste biologische Proben sind Pflanzen, Wurzeln Blätter Fleisch,
Gehirn, Mikroorganismen oder Knochen zu nennen, bei denen freie
Aminosäuren
durch das erfindungsgemäße Verfahren
quantitativ bestimmt werden können.
Die gemessene Konzentration an Aminosäuren stimmt dabei mit der Konzentration
an freien Aminosäuren
in der noch lebenden Zelle bzw. des frischen, festen Materials überein.
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Vorzugsweise
wird die Probe nach ihrem Bezug, beispielsweise der Entnahme aus
einer lebenden Pflanze, gekühlt.
Dies dient beispielsweise dazu einen Verlust von freien Aminosäuren durch
intrazelluläre
Reaktionen zu verhindern. Die Kühlung
findet dabei vorzugsweise auf tiefe Temperaturen statt. Die Temperaturen können beispielsweise
durch flüssigen
Stickstoff erzeugt werden. Die Probe kann entweder in den flüssigen Stickstoff
eingelagert werden oder in der sich über ihm befindlichen kalten
Gasphase, die vorzugsweise ebenfalls aus Stickstoff besteht, gekühlt werden.
Typische Temperaturen hierbei sind –190°C bis –80°C oder auch –160°C bis –130°C.
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Die
Probe wird erfindungsgemäß zunächst unter
Kühlung
grob mechanisch zerkleinert.
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Die
Zerkleinerung findet vorzugsweise bei –190°C bis –100°C oder –160°C bis –130°C statt.
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Vorzugsweise
erfolgt die Kühlung
unter Anwendung von tiefkaltem Stickstoffgas, da dieses chemisch inert
ist. Die Temperatur kann durch eine tiefkalte Gasphase des Stickstoffes
herbeigeführt
werden, wie sie durch die Gasphase über flüssigen Stickstoff entsteht.
Die Probe kann aber auch direkt oder über eine Kontaktfläche mit
dem flüssigen
Stickstoff gekühlt
werden. Bevorzugt wird die Probe unter Beimischung von flüssigem Stickstoff
zu der Probe aufgeschlossen und homogenisiert. An Stelle von Stickstoff
als Kühlmittel
kann auch ein anderes Kühlmittel
treten, welches sehr tiefe Temperaturen erreicht, wenn es gegenüber Aminosäuren und
Proteinen/Enzymen chemisch inert ist. Es sollte eine Temperatur
erreicht werden, bei der Reaktionen der Aminosäuren mit anderen Komponenten
der Probe verhindert werden und bei der Proteinhydrolysen ausgeschlossen
sind.
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Die
Homogenisierung kann beispielsweise durch Zermörsern erfolgen.
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Hierzu
kann beispielsweise der Mörser
mit flüssigem
Stickstoff auf tiefe Temperaturen vorgekühlt sein. Andere Geräte, die
mit der Probe in Kontakt kommen sollten vorzugsweise ebenfalls tiefgekühlt sein.
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Weiterhin
kann der Probe flüssiger
Stickstoff zugeführt
werden.
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Zusätzlich kann
die Probe in einem chemisch inerten Gasstrom, vorzugsweise tiefkaltem
Stickstoff geschützt
werden, beispielsweise um Kondensation von Wasser zu verhindern.
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Nach
der Homogenisierung wird die Probe mit einem Extraktionsmittel in
Kontakt gebracht.
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Das
Extraktionsmittel soll dabei die Aminosäuren aufnehmen. Hierzu wird
bevorzugt ein saures Lösungsmittel
verwendet, welches eine Säure
und ein organisches Lösungsmittel
enthält,
dass einen polaren und einen unpolaren Anteil besitzt.
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Als
Säure kann
HCl, H2SO4, H3PO4 , HNO3, Oxalsäure
oder Essigsäure
eingesetzt werden.
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Als
organische Lösungsmittel
wird Ethanol bevorzugt, es kommen jedoch auch andere Lösungsmittel in
Betracht, wie Propanol, iso-Propanol, 1-Butanol, 1,2-Ethandiol oder
Methanol. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel
für die
Probe giftig, das bedeutet, eventuell vorhandene Mikroorganismen,
die Aminosäuren
verstoffwechseln werden abgetötet,
so dass bei der später
gemessenen Konzentration an Aminosäure keine Verfälschung
stattfindet.
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Eine
bevorzugte Mischung ist Ethanol/HCl (c = 0,1 mol/l) mit 1:1 Volumenverhältnis.
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Die
Wasserlöslichkeit
der freien Aminosäuren
ist im Bereich unterhalb ihres isoelektrischen Punktes am höchsten.
Aus diesem Grund wird zur Extraktion einer biologischen Probe, die
einen isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von 7–9 hat,
ein saures Extraktionsmittel verwendet.
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Der
pH-Wert des Extraktionsmittels liegt vorzugsweise zwischen 1 und
2.
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Das
Verhältnis
für die
Volumenanteile der Säure
und des organischen Bestandteils des Extraktionsmittels kann beispielsweise
9:1 oder 8:2 bis 1:1 für
organisches Lösungsmittel/Säure betragen.
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Bei
der Extraktion wird vorzugsweise weiterhin mechanisch zerkleinert
um einen noch besseren Aufschluss zu erhalten.
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Beim
Extraktionsschritt wird ebenfalls gekühlt. Dabei soll eine Temperatur
eingehalten werden, welche kein Festwerden des Extraktionsmittels
bewirkt. Daher kann die Kühltemperatur
von Extraktionsmittel zu Extraktionsmittel verschieden sein. Vorzugsweise überscheitet
die Temperatur bei der Extraktion 10°C nicht.
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Besonders
bevorzugt ist eine Temperatur unter 5°C besser 4°C, 3°C, 2°C, oder 1°C. Je nach Extraktionsmitteln
ist es auch denkbar, dass 0°C
unterschritten werden. Grundsätzlich
soll die Temperatur so tief wie möglich sein, jedoch soll das
Extraktionsmittel flüssig
bleiben. Die Temperatur soll aber nicht dazu führen, dass die Qualität der Extraktion
vermindert wird.
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In
einem weiteren Schritt wird die flüssige Phase des Homogenats
vom Feststoff getrennt.
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Bei
diesem Schritt soll gekühlt
werden. Die dabei herrschenden Temperaturen sollen noch so hoch sein,
dass das Extraktionsmittel, welches nunmehr die Aminosäuren enthält flüssig ist.
Vorzugsweise soll die Temperatur 10°C nicht überschreiten. Bevorzugter sind
Temperaturen unter 5°C,
insbesondere 4°C,
3°C, 2°C, 1°C oder Temperaturen
unter 0°C,
wenn dies in der flüssigen
Phase noch möglich
ist.
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Als
Trennverfahren ist die Zentrifugation bevorzugt, da sie eine schnelle
Trennung ermöglicht,
jedoch können
auch andere Trennverfahren, wie beispielsweise Filtration oder Dekantieren
eingesetzt werden.
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Der Überstand
wird nach der Zentrifugation abgeführt und dabei vorzugsweise
im Wesentlichen auf die gleichen Temperaturen gekühlt wie
bei der Zentrifugation.
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Nach
der Abtrennung kann das die Aminosäuren enthaltende Extraktionsmittel
ggf. kalt gelagert werden. Die Lagerung sollte vorzugsweise in flüssigem Stickstoff
oder in einer tiefkalten Gasphase erfolgen, die eine Temperatur
zwischen –190°C und –170°C oder auch
zwischen –160°C und –130°C haben kann.
Ein Abbau oder Einbau von Aminosäuren
durch chemische Reaktionen soll verhindert werden.
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Für die Kühlung auf
tiefe Temperaturen kann vorzugsweise, wie auch im Beispiel genannt,
flüssiger Stickstoff
oder die sich darüber
befindliche tiefkalte Gasphase verwendet werden. Die Verwendung
von Stickstoff hat den Vorteil, dass dieser recht preisgünstig zu
erwerben ist. Weiterhin können
auch andere Flüssiggase,
wie flüssiges
Argon, Helium oder Krypton zum Einsatz kommen, da sie ebenfalls
inert sind. Diese Gase sind jedoch erheblich kostspieliger in der
Anschaffung.
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In
einem weiteren Schritt findet eine Trennung der Aminosäuren aus
dem Extraktionsmittel statt.
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Hierzu
kann grundsätzlich
jedes geeignete Trennverfahren herangezogen werden, jedoch ist eine Fest/Flüssig-Extraktion
der Aminosäure über einer
Festphase bevorzugt. Alternativ dazu kann eine Flüssig/Flüssig-Extraktion
durch Ausschütteln
der Aminosäuren
erfolgen.
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Die
Trennung kann bei Raumtemperatur oder einer Kühlung erfolgen, welche eine
Trennung noch ermöglicht.
Mögliche
Temperaturen sind 10°C
oder 5°C
bzw. eine Temperatur bei der das Extraktionsmittel noch flüssig ist.
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Wird
als Trennverfahren eine Fest/Flüssig-Extraktion
verwendet, so folgt darauf hin eine Flution der Aminosäuren von
der Festphase.
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Geeignete
Elutionsmittel sind beispielsweise eine Mischung aus n-Propanol
und NaOH-Lösung
oder Methanol und KOH-Lösung.
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Die
Flution findet vorzugsweise in gleichen Temperaturbereichen wie
die Fest-Flüssig-Extraktion
statt.
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Nach
der Trennung der Aminosäuren
aus dem Extraktionsmittel findet eine Derivatisierung der Aminosäuren statt.
Genau wie bei der Fest-Flüssig
Extraktion und der Flution kann die Derivatisierung bei Raumtemperatur
oder einer Kühlung
stattfinden, welche eine Derivatisierung ermöglicht.
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Als
Derivatisierungsreagentien können
bevorzugt Chlorameisensäureester
aber auch andere dem Fachmann bekannte Derivatisierungsreagentien,
wie MBDS-TFA OPA oder TFA eingesetzt werden. (MBDSTFA: N-Methyl-N-tert-Butyldimethylsilyl-trifluor
acetamide; OPA: o-phthalaldehyd; TFA: Trifluor acetic acid.)
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Die
derivatisierten Aminosäuren
werden in eine organische Phase überführt.
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Bevorzugt
ist die organische Phase unpolar.
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Die
organische Phase kann aus einem oder mehr als einem Lösungsmittel
bestehen.
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Besonders
geeignet ist Chloroform, da dieses chemisch inert ist.
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Es
ist aber auch eine Mischung aus Chloroform und Isooktan, Chloroform
und Oktan oder Tetrachlormethan und (iso-)Heptan, (iso-)Nonan oder
(iso-)Decan möglich.
Jedenfalls sollen die derivatisierten Aminosäuren gelöst werden.
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Die Überführung der
derivatisierten Aminosäuren
in die organische Phase kann bei Raumtemperatur oder auch bei einer
Kühlung
erfolgen. Ein möglicher
Temperaturbereich liegt zwischen 1°C und 15°C wenn gekühlt wird.
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Anschließend erfolgt
die Trocknung der sich in der organischen Phase befindlichen derivatisierten Aminosäuren.
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Die
Trocknung kann bei Raumtemperatur oder einer Kühlung erfolgen, bei der die
organische Phase flüssig
bleibt.
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Hierzu
können
Trockenmittel zugegeben werden. Diese sind beispielsweise mindestens
eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus Natriumsulfat, Calciumcarbonat,
oder Calciumchlorid.
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Vorzugswiese
erfolgt die Trocknung unter luftdichten Bedingungen, besonders bevorzugt
unter einer inerten Atmosphäre
beispielsweise unter Stickstoff. Bei der Trocknung kann geschwenkt
oder gerührt
werden. Danach kann eine Abzentrifugation des Trocknungsmittels
erforderlich sein.
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Nach
der erfindungsgemäßen Probenvorbereitung
kann die Lösung
von derivatisierten Aminosäuren einem
analytischen Standardverfahren, wie der GO-MS zugeführt werden
um eine quantitative und/oder qualitative Analyse durchzuführen. Ein
geeignetes Verfahren ist die GO-MS. Bei dieser Methode kann die
Konzentration der Aminosäuren
durch den Vergleich mit internen Standards ermittelt werden. Als
weitere Verfahren können
die HPLC, LC-MS, CE-MS, ESI-MS, Ionenchromatographie, Maldi-TOF
oder FT-MS genannt werden. (LC = liquid chro matography; CE = capillary
electrophoresis; Maldi = matrix assisted laser desorption ionization;
ESI = electrospray ionization; TOF = time of flight, HPLC = high
Pressure liquid chromatography, FT = fuorier transform; MS = mass
spectrometry)
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Die
im folgenden Beispiel beschriebenen Zellaufschlüsse und Extraktionsschritte
für Feststoffe
wurden mit großem
Erfolg angewendet.
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Beispiel:
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- I. Probenvorbereitung
- Ia Erster Zellaufschluß von
Feststoffen in Flüssigstickstoff
- Ib Zweiter Zellaufschluß und
Fest-Flüssig-Extraktion
- Ic Vorbereitung der Extrakte nach erfindungsgemäß modifizierter
Vorschrift EZ-faast kit
- II. Analytik mit GC-Massenspektrometrie
- III. Auswertung der Meßergebnisse
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I. Probenvorbereitung
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Zu
Ia:
- – Benötigte Materialien
und Laborgeräte:
Styroporkarton mit Flüssigstickstoff,
Baumwollhandschuhe, Latexhandschuhe, Reibschalen, Pistille, Tiegelzange,
Spatel, Eppi-Vials, Sicherheits-Verschlüsse für die Reaktionsgefäße, Analysen-Waage.
- – Vorzerkleinerte
Blatt-Proben (Beispiel für
feste biologische Matrices), die sich in 20 mL Packard-Behältern aus
Kunststoff befinden, werden mit Hilfe einer in Flüssigstickstoff
gekühlten
Tiegelzange in einen Styropor-Behälter mit Flüssigstickstoff gelegt.
- – Reibschalen
und Pistille werden in einem Kühlschrank
vorgekühlt.
Die Eppi-Vials und zugehörigen
Sicherheitsverschlüsse
sowie Spatel und Tiegelzange werden ebenfalls in Flüssigstickstoff
gelegt.
- – Nun
werden die vorgekühlten
Reibschalen und Pistille drei Mal kurz mit einer Tiegelzange in
Flüssigstickstoff
getaucht, die Reibschale auf die Waage gesetzt und Tara gedrückt.
- – Dann
entnimmt man mit der Tiegelzange die Proben aus dem Flüssigstickstoff, öffnet die
Probenbehälter und
schüttet
vorsichtig etwa 300 mg Blattmaterial in die Reibschale oder benutzt
ggf. einen vorgekühlten Spatel.
- – Unmittelbar
danach stellt man die Reibschale in den Abzug, gibt vorsichtig etwa
2 bis 3 ml Flüssigstickstoff zur
Probe und zerreibt das Proben-Flüssigstick stoffgemisch
mit dem vorgekühlten
Pistill etwa 30 Sekunden lang. Beendet ist dieser Vorgang, sobald
der Stickstoff verdampft ist und die Probe zu einem weißen Pulver vermahlen
worden ist.
- – Dann
entnimmt man mit der Tiegelzange ein vorgekühltes Eppi-Vial, öffnet es
und gibt in kurzer Zeit mit einem tiefgekühlten Spatel eine möglichst
große
Menge des feinkörnigen
Probenmaterials in dieses Gefäß. Es wird
daraufhin verschlossen und sofort in Flüssigstickstoff gelegt. Die
so erhaltenen Proben werden bis zur weiteren Vorbereitung bzw. zum
Transport über
Flüssigstickstoff
gelagert. Eine Probenoxidation mit Luftsauerstoff oder eine Kontamination
der Probe mit Flüssigstickstoff
ist dabei ausgeschlossen. Ebenso sind biochemische Reaktionen durch
Kryolagerung über
Flüssigstickstoff
ausgeschlossen. Inerte Bedingungen sind essentiell, um freie Aminosäuren aus
biologischen Feststoffen abzutrennen und Proteinhydrolysen zu verhindern.
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Zu
Ib:
- – Benötigte Materialien
und Laborgeräte:
Styroporkarton mit Flüssigstickstoff,
Styroporkarton mit Eis, Baumwollhandschuhe, Latexhandschuhe, Reibschalen,
Pistille, Tiegelzange, Spatel, Eppi-Vials, Sicherheits-Verschlüsse für die Reaktionsgefäße, Analysen-Waage,
Kühlzentrifuge,
2 variable Pipetten (100–1000 μL, 10–100 μL) mit Pipettenspitzen,
1 Chronometer, Pasteurpipetten, interner Standard (Solution 1: Norvalin
200 nmol/ml), Extraktionsmittel (50 qv/v Ethanol/0,1-M HCl), flaches
Rack zum Schrägstellen der
Reibschalen.
- – Reibschalen
und Pistille werden in einem Kühlschrank
vorgekühlt.
Eppi-Vials werden auf Eis gelegt und die Kühlzentrifuge wird vorgekühlt auf
4° C. Die
Tiegelzange wird in Flüssigstickstoff
vorgekühlt
und die Proben aus Schritt Ia werden ebenfalls in Flüssigstickstoff
gelegt.
- – Eine
Reibschale und ein Pistill werden kurz mit Flüssigstickstoff weiter herabgekühlt und
die Reibschale wird auf die Waage gesetzt. Dann wird eine Probe
(Punkt Ia) geöffnet
und mit der vorgekühlten
Tiegelzange festgehalten. Als Menge pro Doppelbestimmung einer individuellen
pflanzlichen Probe werden 50 bis 150 mg des vorbereiteten Pflanzenmaterials
genau eingewogen.
- – Mit
den Pipetten entnimmt man dann jeweils 500 μL Extraktionsmittel sowie 50 μL I.S. (10
nmol Norvalin) und gibt es zur Probe. Mit dem vorgekühlten Pistill
zerreibt man die Probe gründlich
bis ein Homogenat entstanden ist. Die einzuhaltende Zeit für den zweiten
Zellaufschluß beträgt exakt
3 Minuten pro Probe.
- – Danach
wird die Reibschale auf einem Rack schräg abgestellt, so dass sich
das Homogenat in einem kleinen Bereich am tiefsten Punkt der Reibschale
sammeln kann. Zusätzlich
streift man mit dem Pistill die übrige
Fläche
der Schale sorfältig
ab.
- – Dann
werden die Pistillreibfläche
und die Reibschale mit weiteren 500 μL Extraktionsmittel gespült. Mit Hilfe
einer Pasteurpipette wird das gesamte Homogenat (Cytosol und Pellet)
aufgesaugt, in ein vorgekühltes
Eppi-Vial überführt und
mit Eis gekühlt.
- – Die
Homogenate werden anschließend
in einer Kühlzentrifuge
bei 4° C
für 15
Minuten bei 14.000 rpm zentrifugiert. Die Überstände werden quantitativ mit
einer Pasteurpipette in ein neues vorgekühltes Eppi-Vial überführt und mit Eis gekühlt. Die
Pellets werden verworfen. Als Extrakte erhält man Volumina von 700 bis
900 μL.
Dieser Überstand
wird vollständig
für die
weitere umgehende Aufarbeitung mit dem EZ-faast-Kit verwendet. Alternativ werden
die Blattextrakte über
Nacht z.B. bei –80° C in einer
Tiefkühltruhe
gelagert.
-
Zu
Ic:
- – Verlauf
der Probenvorbereitung für
die Gaschromatographie gemäß EZ-faast-Vorschrift,
im Folgenden beschrieben:
- – Zunächst werden
alle benötigten
Chemikalien des EZ-faast
kits auf Raumtemperatur gebracht. Dazu zählen: Standards SD und SD 2,
Reagent 3A und 3B, Reagent 1 (Internal Standard, I.S.), Reagent
4, vier Blattextrakte aus Schritt Ib (Proben).
- – Dann
stellt man das Flutions- und Derivatisierungsreagenz her: 3A : 3B
(3:2 v/v). Für
7 Proben einschließlich
Standards z.B. 900 μL
3A + 600 μL
3B.
- – 7
Glas-Vials werden in das EZ-faast Rack im Abzug gesetzt und entsprechend
beschriftet (Standards S1–S3,
Proben I–IV).
In aufsteigender Reihenfolge gibt man nun zunächst die Standardlösungen in
die Vials (50, 100, 200 μL
SD und 50, 100, 200 μL
SD 2). Dies entspricht jeweils 10, 20 und 40 nmol einer einzelnen
Aminosäure
(Ausnahme: Für
Tryptophan gilt die doppelte Menge, da sie sowohl in SD als auch
in SD 2 vorhanden ist.). Pro Standardvial werden 50 μL Solution
1 als interner Standard zugegeben (10 nmol Norvalin).
- – In
die Probenvials (I–IV)
gibt man jeweils 200 μL
Probenlösung.
Auf alle Vials werden die Sorbent Tips gesetzt. Mit Hilfe einer
1,5 mL-Spritze werden gemäß Vorschrift
die Lösungen
innerhalb von 1 Minute angesaugt.
- – In
Schritten von jeweils 200 μL
werden die Proben nach dem beschriebenen Schema im Harz angereichert
und zum Schluss werden die Probengefäße mit 200 μL Wasser gespült. Zwischendurch
muss die Lösung
einmal verworfen werden.
- – Nach
dem Entleeren der Spritzen werden diese umgehend mit Wasser gereinigt.
Pro Probenvial werden nun 200 μL
Eluent zugegeben. Dann setzt man eine 0,6 mL Spritze auf das Sorbent
Tip, deren Stempel vorher etwa bis zur Hälfte aufgezogen wurde, um ein
ausreichendes Luftpolster zu haben.
- – Der
Eluent wird langsam bis in Höhe
der Fritte, die sich im Sorbent Tip befindet, angesaugt. Darauf
wird der Stempel gleichmäßig bis
zum Anschlag gedrückt,
woraufhin das beladene Harz in das Glasvial fällt. Bei diesem Prozess werden
die adsorbierten Aminosäuren
vom Harz eluiert. Da die Spritzen nicht mit Eluent in Kontakt kommen,
werden sie umgehend mit Wasser gereinigt.
- – Die
freien Aminosäuren
liegen in einer wässrigen
Phase vor und müssen
für eine
Trennung mittels GC vorher derivatisiert und in ein organisches
Lösemittel überführt werden.
Zur Derivatisierung versetzt man die Proben mit je 50 μL Derivatisierungsreagenz.
Dazu werden mit einer Glaspipette (Microdispenser) 50 μL Reagent
4 zu jeder Probe zugegeben. Dann wird jede Probe für 15 Sekunden
auf dem Vortex bei 2200 U/min gerüttelt. Darauf müssen die
Proben 1 Minute ruhen und werden erneut für 15 Sekunden gerüttelt.
- – Dann
erfolgt mit Hilfe einer Flüssig-Flüssig-Extraktion
die Überführung der
derivatisierten Aminosäuren
in die organische Phase. Mit dem Microdispenser werden 50 μL Reagent
5 zugegeben, gerüttelt
(s.o.) und 1 Minute gewartet. Dann werden erneut 50 μL Reagent
5 pipettiert und ebenfalls für
15 Sekunden bei 2200 U/min gerüttelt.
Nach
diesem Schritt der Extraktion der Aminosäurederivate aus der wässrigen
Phase in die organische Phase muss letztere getrocknet werden. Zu
diesem Zweck werden spezielle Glasgefäße (im Kit vorhanden) mit einer
gestrichenen Spatelspitze (≈ 15
mg) getrockneten Natriumsulfats (5 h bei 550° C im Muffelofen) gefüllt und
verschlossen.
- – Die
organische Phase (ca. 50 bis 150 μL)
wird vorsichtig z.B. mit einer 250 μL Hamilton-Spritze entnommen,
die nach jedem Probenkontakt 3–4
Mal mit Chloroform gespült
wird. Diese Lösung
wird in das Glasvial mit Natriumsulfat gegeben und sofort luftdicht
verschlossen. Auf einem Rüttler
wird das Trocknungsmittel in der organischen Phase für 60 Minuten
suspendiert, wobei vorhandene Wassermoleküle der Probenlösung entzogen
werden.
- – Zur
Trennung der organischen Phase vom Trocknungsmittel müssen folgende
Vorbereitungen getroffen werden. Pro Probe wird eine Pasteurpipette
mit hochreiner Glaswolle im Trichterbereich der Pipette verstopft.
Die auf diese Weise vorbereiteten Pipetten werden in die beschrifteten
Autosamplervials für
die GC-Analytik gestellt.
- – Die
getrockneten Extrakte werden mit einer Glasspritze fast vollständig entnommen,
in die vorbereiteten Pasteurpipetten überführt und mit Hilfe eines Latexhütchens wird
die Lösung
durch die Glaswolle leicht in das Autosamplervial gedrückt. Nach
dem Verschließen
mit einer Bördelkappe
und kurzem Rütteln auf
dem Vortex sind die Proben fertig für die GC-Analytik.
Vorzugsweise sollte auf
eine Einengung der Proben im Gasstrom verzichtet werden, um Verluste
an bestimmten Aminosäuren,
wie beispielsweise Glycin oder Alanin zu verhindern. Die Proben
sollen nach Möglichkeit
direkt nach der Vorbereitung mit dem EZ-faast-kit vermessen werden,
weil ihre Stabilität
zeitlich eng begrenzt ist.
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Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:
-
Reagent
1: Norvaline (Norv). SD: Alanine (Ala), Glycine (Gly), Valine (Val),
Leucine (Leu), Ileucine (Ileu), Threonine (Thr), Serine (Ser), Proline
(Pro), Aspartic acid (Asp), Methionine (Met), Hydroxyproline (Hyp),
Glutamic acid (Glu), Phenylalanine (Phe), Lysine (Lys), Histidine
(His), Hydroxylysine (Hyl), Tyrosine (Tyr), Tryptophan (Trp), Cystine
(C-C). SD2: Aspargine (Asn), Glutamine (Gin) and Tryptophan (Trp).
Alle Konzentrationen der einzelnen AS betragen 200 μM. Reagent
3A: NaOH (1.32%), Reagent 3B: n-propanol, Reagent 4: chloroform
and chlorine formic acid ester, Reagent 5: isooctane (81%) and CHCl3 (19%).
-
II. Analytik mit GC-Massenspektrometrie
-
GC-MS-Bedingungen
-
- Software: Xcalibur von Thermoelectron
- Method Set Up: Aminosaeuren-15m.meth
-
a)
Autosampler A200S
b)
Finnigan Q-GC
| Trägergas: | Helium
6.0 |
| Split: | 1:
10 |
| Säule: | ZB-AAA
(0.25 mm / 15 m) Phenomenex |
Oven:
| Rate [°C/min] | Final
value [°C] | Hold
time [min] | Total
time [min] |
| Initial | | 110 | 0.00 | 17.67 |
| Ramp
1 | 15 | 300 | 5.00 | |
| Ramp
2 | 0 | 0 | 0.00 | |
- Maximum oven temperature: 320 °C
Injector: | Final
value [°C]:
250 | | Injector: | Right |
| ("Fin-Injector") | | | |
Pressure: | Final
value [psi] [min] | Hold
time [min] | Total
time |
| 4 | 17.67 | 17.67 |
| | | |
- Flow control: Pressure program
- End run:
after 17.67 minutes
Start time [min]: 0.00
Multiplier
Offset: o
Total scan time [sec] : 0.50
Ion Mode: +
EI
Heated
zones: Ion Source [°C]:
175
| Transfer
Line [°C]: | 275 |
| Scan
mode: | Full
Scan |
| Mass
range: | 50–650 |
| Ions: | Positive |
| Tune
file: | autotune
(use for entire Segment) |
| Microscans: | 3 |
| Max
Ion Time [ms]: | 25 |
| Mass
defect [mmu/100 amu]: | 0 |
d)
Injector-Controller Optic 2 | Method
Name: | AS |
| Equilibration
time: | 1:00
M:S |
| Injection
Mode: | Split |
| Initial
temperature: | 250 °C |
| Ramp
rate: | 0° C/s |
| Final
Pressure: | 0.0
PSI |
| Initial
Pressure: | 0.0
PSI |
| Transfer
time: | 0:10
M:S |
| Transfer
Pressure: | 0.0
PSI |
| Splitless
time: | 3:00
M:S |
| End
time: | 17:40
M:S |
| Final
temperature: | 250 °C |
- e) Sonstige verwendete Mittel für die GC:
GC-Liner:
SGE-Liner Agilent 4 mm ID, Tapfocus
Injektor-Septum: CS Chromatographie-Service,
CS Septa BTO, rot, 9.5
Bördelkappe
für Autosamplervials:
CS R 8-1.0
Autosamplervials: CS R 07s, braun
-
III. Auswertung der Meßergebnisse
-
Internes
Processing der Rohdaten durch Xcalibur und anschließende Berechnung
der tatsächlichen Konzentrationen
der einzelnen Aminosäuren
in den Pflanzenproben mittels Microsoft Excel unter Berücksichtigung
von statistischen Verfahren.
-
Die
Vorteile des optimierten Verfahrens ergeben sich wie folgt:
- 1.) Es wurde ein neues Extraktionverfahren
für feste
Proben entwickelt, das an das EZ-faast-Verfahren adaptiert wurde
und somit eine Erweiterung dieses Systems darstellt. Es können mehr
Proben unter standardisierten Bedingungen mit dem EZ-faast-Kit analysiert
werden, die zu genauen und reproduzierbaren Resultaten für freie
Aminosäuren
führen.
Das
verwendete Extraktionsmittel (50 % v/v Ethanol/0,1-M HCl) hat eine
chemische Zusammensetzung, die es ermöglicht, dass sowohl unpolare
als auch polare Aminosäuren
aus einer komplexen biologischen Matrix vollständig extrahiert werden können, weil
das Extraktionsmittel sowohl polare (Salzsäure) als auch unpolare Komponenten
enthält.
Gleichzeitig bewirkt die Salzsäure,
dass freie Aminosäuren
im sauren Milieu (pH 2 bis 4) gelöst vorliegen. Da die Proben
ausschließlich
unter gekühlten
Bedingungen aufgeschlossen und im Sauren extrahiert werden und die
entstehende Reibungswärme
zwischen Pistill und Reibschale durch Kühlung kompensiert wird, findet
keine chemische Veränderung
freier Aminosäuren
statt. Ebenso finden keine Proteinhydrolysen statt. Eine Dauer von
3 Minuten für
die Fest-Flüssig-Extraktion sowie
ein zweifacher Zellaufschluss der Proben führen zu einem vollständigen Zellaufschluss
und einer quantitativen Ausbeute an freien Aminosäuren mit
einfachen Mitteln. Der pH-Wert eines gewonnenen Extrakts wird durch dieses
Verfahren so eingestellt, dass die Probe ohne eine zeitliche Verzögerung mit
dem EZ-faast-Kit weiter für
die Gaschromatographie vorbereitet werden kann. Beispielsweise ist
der natürliche
pH-Wert in manchen Pflanzenblättern
bei ungefähr
pH 7–8.
Nach Zellaufschluss und Extraktion entspricht der pH-Wert des Extraktes
ungefähr
dem geforderten pH-Wert von 2 bis 4 gemäß EZ-faast-Vorschrift. Ob dieser
pH-Bereich auch
für andere
feste Matrices mit diesem Verfahren erreicht werden kann, lässt sich
leicht feststellen, in dem man pH-Teststäbchen einsetzt. Das Mischungsverhältnis von
Probe zu Extraktionsmittel von ungefähr 1:10 (m/m) hat sich als
optimal für
eine quantitative Ausbeute an freien AS als auch für alle weiteren
Probenvorbereitungsschritte erwiesen, weil das jeweilige Probenvolumen
gut mit dem EZ-faast-Kit zu handhaben ist. Durch die Zugabe des
internen Standards (Norvalin) zusammen mit dem Extraktionsmittel
werden bereits bei diesem Schritt entstehende Probenverluste beim
Abpipettieren der Homogenate (vgl. 1b) sowie beim Abnehmen des Überstands
nach Zentrifugation (vgl. 1b) vollständig kompensiert.
- 2.) Nach der beschriebenen Probentrocknung sind die Proben garantiert
wasserfrei und können
die GC-Säule und
das System nicht schädigen.
Zusätzlich
wurden alle anderen GC-MS-Parameter optimiert. Dies führt zu einer
verbesserten Peakauflösung
im Chromatogramm, was bessere relative Standardabweichungen und
Responsefaktoren für
die einzelnen Aminosäuren
zur Folge hat. Dabei muss stets berücksichtigt werden, dass ein
solches Ergebnis nicht nur durch die Optimierung der GC-MS-oder
EZ-faast-Parameter erreicht werden kann, sondern dass der Probenaufschluss-
und Extraktionsschritt für
feste biologische Matrices entscheidend für das Endergebnis unter den
gegebenen Bedingungen ist.
- 3.) Durch die beschriebene Optimierung und Ausweitung des EZ-faast-kits
auf feste Proben lassen sich neue Märkte für die Aminosäurenanalytik
erschließen.
Insbesondere im Bereich der Humandiagnostik, wo es oft darauf ankommt,
sehr präzise
Ergebnisse in relativ kurzer Zeit zu erzielen, besteht ein großer Bedarf an
zuverlässigen
und standardisierten Analysensystemen, die universell einsetzbar
sind. Das gleiche trifft u.a. auch auf Prozesstechnologien zu, z.B.
bei Fermentierungsprozessen.
