CN1715412A - 一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个棉纤维发育相关基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个棉纤维发育相关基因及其编码蛋白与其在改良棉纤维品质中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的基因与纤维细胞发育密切相关，并在纤维细胞的伸长和次生壁合成中具有负调控作用，在棉花中抑制表达该基因能显著改良纤维的长度和强度品质，从而为利用基因工程的方法控制纤维生长发育和改良纤维品质提供了一个新的功能基因和表达调控元件。本发明将在棉花纤维的品质改良中发挥重要作用。

Description

一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与其在改良棉纤维品质中的应用。

背景技术

棉花是最重要的天然纤维作物。棉纤维是由胚珠外珠被表皮层分化而来的单细胞，其形成和发育可分为四个时期：起始期、伸长期(初生壁合成)、次生壁沉积期和成熟期。不同时期的发育决定着棉纤维的不同品质性状，其中，在延伸阶段的发育关系到棉纤维的长度，在次生壁合成阶段的发育则与棉纤维的强度密切相关。分离、鉴定控制纤维细胞延伸和次生壁合成的基因，是了解棉纤维细胞发育的分子机理及其调控机制的关键，也是通过基因工程方法定向改良纤维长度和强度的核心技术环节。

迄今为止，虽然已经报道了许多在纤维细胞中特异或优势表达的棉花基因，但对真正能控制纤维品质的基因还了解甚少。最近，Li等(Li et al，The cotton ACTIN1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation.Plant Cell 17：859-875，2005)报道了降低肌动蛋白基因GhACT1的表达能显著抑制纤维细胞的伸长，该研究表明微丝骨架在纤维细胞发育中起到了重要作用。因而，深入开展对微丝骨架及其结合蛋白的研究，包括分离、鉴定棉纤维品质相关微丝骨架基因及其细胞内功能的研究，有可能在阐明棉纤维发育和品质形成的分子调控机理方面取得突破。

在植物细胞中，微丝细胞骨架在细胞分裂、伸长、分化和形态建成等过程中起着重要的作用。为了执行这些功能，微丝细胞骨架不断进行着活跃的时空变化。许多微丝结合蛋白参与调控微丝骨架的动态重组，其中微丝解聚蛋白ADF(actindepolymerizing factor)是微丝动态结构的重要调控因子。现已发现，在拟南芥中改变AtADF1基因的表达，可明显影响转基因植物的细胞长度、细胞形态和开花时间，其中，降低其表达可促进细胞伸长(Dong et al，ADF proteins are involved in thecontrol of flowering and regulate F-actin organization，cell expansion，andorgan growth in Arabidopsis.Plant Cell，13(6)：1333-1346，2001)，表明ADF基因可能通过调控细胞内微丝骨架的结构来控制细胞的伸长等过程。

发明内容

本发明的目的是提供一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白。

本发明所提供的棉纤维发育相关基因，名称为GhADF1，来源于陆地棉(Gossypiumhirsutum)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为：杂交后，用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由963个碱基组成，其编码框为自5’端第172-第591位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明所提供的棉纤维发育相关基因的编码蛋白(GhADF1)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加对棉纤维发育具有调控作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由139个氨基酸残基组成。

含有上述棉纤维发育相关基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种棉纤维品质的改良方法。

本发明所提供的棉纤维品质的改良方法，是利用植物表达载体，将本发明的棉纤维发育相关基因的反义cDNA导入棉花细胞或组织，可获得棉纤维品质得到改良的转基因纤维细胞及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶NOS基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GhADF1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GhADF1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化棉花细胞或组织，并将转化的棉花细胞或组织培育成植株。

本发明所提供的GhADF1是一纤维细胞优势表达基因，该基因与纤维细胞发育密切相关，并在纤维细胞的伸长和次生壁合成中具有负调控作用，在棉花中抑制表达该基因能显著改良纤维的长度和强度。本发明为利用基因工程的方法控制纤维生长发育和改良纤维品质提供了一个新的功能基因和表达调控元件，将在棉花纤维的品质改良中发挥重要作用

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为GhADF1在棉花纤维发育不同时期及不同器官中表达水平的分析结果

图2为GhADF1反义cDNA转基因烟草悬浮细胞的表型

图3为GhADF1反义cDNA转基因烟草悬浮细胞的微丝结构

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由北京奥科生物技术有限公司合成。

实施例1、GhADF1基因全长cDNA序列的获得

GhADF1基因的全长cDNA序列的获得包括以下步骤：

1、GhADF1cDNA片段的克隆

利用RT-PCR方法，从陆地棉(Gossypium hirsutum)的总mRNA中克隆得到一个编码ADF(Actin Depolymerizing Factor)基因的cDNA片段(将该基因命名为GhADF1)。

具体方法如下：

1)利用超离心方法提取开花后9天棉花纤维的总RNA，用Invitrogen公司的SuperScript III RT-PCR试剂盒并参照试剂盒说明书逆转录获得cDNAs，反应体系为：50μM oligo dT 1μl，10mM dNTPs 1μl，RNA 1μg，5x第一链缓冲液4μl，0.1MDTT 1μl，SuperScript III RT 1μl，H2O 11μl；反应条件为：65℃ 5min，50℃ 60min。

2)根据从棉花数据库中检索到的ADF EST序列设计两端引物，引物序列如下：forward：5’-CGGGATCCATGGCAAACGCGGCTTCAGG-3’；reverse：5’-ACGCGTCGACTCAATTGGCACGGCTCCT-3’)

以步骤1)获得的cDNAs为模板，在引物forward和reverse的引导下，通过PCR方法从cDNAs中扩增出cDNA片段，回收长度约400bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段克隆到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pT-GhADF1，对其进行测序，测序结果表明扩增片段长度为419bp的含有完整编码框(ORF)的GhADF1的cDNA片断。

2、GhADF1 cDNA的5’和3’UTR(非翻译区)的克隆

根据步骤1得到的cDNA序列设计特异性3’RACE引物

(5’-CGATGTCATAAGGAGCCGTGCCAATTGA-3’)和5’RACE引物

(5’-CGAGAAAGCGAGGGAAAGAGCAAGA-3’)，通过RACE进一步扩增得到GhADF1 cDNA的5’和3’端UTR片段。

1)3’UTR的克隆

首先，用BD公司的BD SMART RACE cDNA Amplification试剂盒并参照说明书进行操作，扩增GhADF1 cDNA 3’末端片段。以开花后9天的棉花纤维总RNA为模板，通过反转录获得cDNAs；具体反应体系为：RNA 1μg，3’-CDS引物A：(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀VN-3’)1μl，5x第一链缓冲液2μl，20mM DTT1μl，10mM dNTPs Mix 1μl，BD PowerScript逆转录酶1μl，H2O 6μl；反应条件为：先70℃ 2min，再42℃ 1.5h。然后，加入100μl Tricine-EDTA缓冲液稀释上述第一链反应产物，从上述cDNAs中扩增GhADF1 cDNA的3’末端片段；反应体系为：cDNA 2.5μl，10x UPM(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)5μl，10μM GhADF1 3’RACE引物1μl，Master Mix 41.5μl；反应条件为：先94℃ 30s，72℃ 3min，共5次循环；再94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，共5次循环；最后94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，共25次循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度约400bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-Teasy上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pT-ADF-3R，对其进行测序，测序结果表明扩增的GhADF1cDNA的3’UTR片段长度为400bp。

2)5’UTR的克隆

首先，用BD公司的BD SMART RACE cDNA Amplification试剂盒并参照说明书进行操作，扩增GhADF1 cDNA 5’末端片段。以开花后9天的棉花纤维RNA为模板，通过反转录获得cDNAs；反应体系为：RNA 1μg，5’-CDS引物A[5’-(T)₂₅VN-3’]1μl，12μM BD Smart II A oligonucleotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’)1μl，5x第一链缓冲液2μl，20mM DTT 1μl，10mM dNTPs Mix 1μl，BD PowerScript逆转录酶1μl，H₂O 6μl；反应条件为：70℃，2min，42℃，1.5h。然后，加入100μl Tricine-EDTA缓冲液稀释上述第一链反应产物，从上述cDNAs中扩增GhADF1基因5’UTR片段；反应体系为：cDNA 2.5μl，10xUPM(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)5μl，10μM GhADF1 5’RACE引物1μl，Master Mix 41.5μl；反应条件为：先94℃ 30s，72℃，3min，共5次循环；然后94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，共5次循环；最后94℃ 30s，68℃30s，72℃ 3min，共25次循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约150bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-Teasy上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pT-ADF-5R，对其进行测序，结果表明扩增的GhADF1 cDNA的5’UTR片段长度为162bp。

3、GhADF1全长cDNA序列的获得及其PCR鉴定

利用步骤1和步骤2获得的长度分别为598bp，400bp和162bp片段之间的重叠区，通过拼接得到GhADF1的全长cDNA序列。为验证所得到的拼接序列的正确性，根据该拼接序列的5’和3’端设计引物(ADF-5：5’ACGCGGGGAGTTATCGGCTATC 3’和ADF-3：5’GACCTTCTAACTTGATAACCAAATC 3’)，从开花后9天棉花纤维cDNAs中PCR扩增GhADF1的全长cDNA；反应结束后，将PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约900bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-Teasy上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pT-GhADF1-f；对其进行测序，结果表明PCR扩增片段的序列与拼接序列一致，证明经拼接获得的GhADF1的全长cDNA序列正确，该序列具有序列表中SEQ ID№：1的多核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №：1由963个碱基组成，其编码框为自5’端第172-第591位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、GhADF1的表达分析

采用RT-PCR方法，对GhADF1在棉花纤维及不同器官中的表达水平进行半定量分析，具体方法为：提取棉花纤维、根、茎、叶、花不同组织、器官的总RNA，分别以所提取的不同的总RNA为模板，逆转录合成第一链cDNAs，再以所合成的第一链cDNA为模板，用GhADF1 cDNA的3’UTR基因特异性引物(forward：5’-CCGATCCTTCCGAGATGGATGTCG-3’；reverse：5’-CCCAATATCAAAGCAAGTTCC-3’)进行PCR扩增，反应体系为：2mM dNTPs 2μl，10x PCR缓冲液2μl，10μM forward引物0.4μl，10μM reward引物0.4μl，cDNA 1μl，Taq 1U，H2O 13.2μl；PCR反应条件为：先94℃ 3min；再94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 1min，共25个循环。以histone为内标，扩增histone的引物序列为：5’-CCCGTAAGTCTCTACTGGTG-3’和5’-TCTAAGCGACTGATCCAC-3’。PCR反应结束后，对其产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示(泳道6、9、12、15、18、21、24分别表示GhADF1在开花后6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天在棉纤维中的表达情况，R、S、L、F分别表示GhADF1在根，茎，叶和花中的表达情况，histone为上样量参照)，表明GhADF1在棉花的根、茎、叶、花和纤维中均有表达，但在纤维细胞中的表达量相对较高，表明GhADF1基因具有纤维细胞优势表达的特点。

实施例3、GhADF1反义cDNA转基因烟草悬浮细胞的获得及其细胞形态观察

根据GhADF1的cDNA序列，经RT-PCR方法得到其反义cDNA片段(其核苷酸序列见SEQ ID №：1)，再将该片段克隆到含有35S启动子的载体pBin438(来自中科院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室)的BamHI和Sal I酶切位点之间，得到GhADF1的反义cDNA植物表达载体，命名为pBin438AA。用所构建的载体pBin438AA转化烟草悬浮细胞。将处于静止期的转化有载体pBin438AA的烟草悬浮细胞用DAPI/Calcofluor(Sigma公司)染色，置于荧光显微镜下对其细胞形态进行观察，以正常野生型烟草悬浮细胞为对照。观察结果如图2所示(A为野生型烟草悬浮细胞，B为转有GhADF1反义cDNA烟草悬浮细胞)，在此实验条件下，正常野生型烟草悬浮细胞近似球形，细胞分裂正常，而转有GhADF1反义cDNA的烟草悬浮细胞中，细胞在单一轴向上显著伸长。观察细胞核的分布和数目，每一个细胞内均有一个核，表明细胞的伸长不是由于细胞分裂不正常引起。上述结果表明抑制GhADF1的表达，能促进烟草细胞的伸长。

实施例4、GhADF1反义cDNA转基因烟草细胞的微丝结构变化

由于微丝解聚因子ADF是微丝骨架动态结构的主要调控因子之一，因此推断转GhADF1反义cDNA的烟草细胞的长度增加可能与微丝骨架的结构变化相关。用鬼笔环肽(phalloidin)对实施例3获得的GhADF1反义cDNA转基因烟草悬浮细胞的微丝进行染色后，用共聚焦显微镜(confocal)对其微丝结构进行观察，以正常野生型烟草悬浮细胞为对照。结果如图3所示(A为野生型烟草悬浮细胞，B为转有GhADF1反义cDNA烟草悬浮细胞)，与对照相比，转基因烟草细胞的微丝骨架的结构发生了显著变化，特别是束状微丝(actin bundles)含量明显增加。表明抑制GhADF1的表达可能影响了微丝的解聚，使得转基因烟草细胞内的聚合态微丝增多，最终导致细胞长度发生变化。

实施例5、抑制GhADF1在陆地棉中的表达对纤维品质的影响

为了进一步了解GhADF1在纤维发育和品质形成中的功能，将实施例3构建的含GhADF1反义cDNA的植物表达载体pBin438AA转化陆地棉(Gossypium hirsutum)。对获得的转基因植株的纤维品质进行分析，分析结果如表1所示(柯312为野生型对照)，转基因棉花的纤维长度或强度都有明显增加，表明GhADF1的表达产物可能在纤维细胞的伸长和次生壁合成等过程中具有负调控作用。

表 1GhADF1在陆地棉中的表达引起的纤维品质变化

名称	长度(mm)	整齐度(％)	比强度(cN/tex)	伸长率(％)	马克隆值
						柯312(对照)	27.2	83.3	30.5	6.8	4.9
转基因植株1	30.1	86.0	34.8	6.5	4.4
						转基因植株2	27.1	84.5	35.9	6.6	4.9

注：“农业部棉花品质检测中心”HVI900检测

                                  序列表

<160>2

<210>1

<211>964

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>1

acgcggggag ttatcggcta tcgccaaccc caaaaaagaa aaaaagagaa aaaaaaaact      60

cttaagtcca tcaattatca ctacaacctc tttcccctta ttttctctcc aaagaagccc     120

taaattttct cagcctttct tgctctttcc ctcgctttct cgggaaaaaa aatggcaaac     180

gcggcttcag gaatggctgt gcatgatgat tgcaagctga agtttttaga actgaaggct     240

aaaaggactt accgcttcat agttttcaag attgaagaaa aacaaaagca agttgttgtg     300

gaaaaggttg gtgaacctac tgatagctat gaggctttca ctgctagcct tccagccgat     360

gagtgtcgat acgctgtgta tgactttgat tttgtgaccg atgagaactg ccagaagagc     420

agaatttttt tcattgcctg gtctcctgat acatcaaaag taagaagcaa gatgatctat     480

gcgagctcaa aggacaggtt caaaagggaa ttggatggca tccaggtaaa gttgcaagct     540

accgatcctt ccgagatgga tctcgatgtc ataaggagcc gtgccaattg aaatgtatgt     600

accatttctt cattgaaatg gaactttata ctatgtggtt cacataaatg taatgtctat     660

atcaactttg gatcttggaa cttgctttga tattgggtta tatctgtgga ttcttatggg     720

gtatgtgtgt gttccccctt tggggtacca aatttcataa cgatttgact attgcatgcc     780

tttcctttta tgttggatta tataaactta gctgaaatta tgtattaccg gtgcatgaaa     840

cttccatatt acttgcattt gaacaattgc aaagtattta tggccttgag ttgacttgtt     900

caaagatttg gttatcaagt tagaaggtct aaagcaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     960

aaa                                                                   963

<210>2

<211>139

<212>PRT

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>2

Met Ala Asn Ala Ala Ser Gly Met Ala Val His Asp Asp Cys Lys Leu

1               5                   10                  15

Lys Phe Leu Glu Leu Lys Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Phe Ile Val Phe

            20                  25                  30

Lys Ile Glu Glu Lys Gln Lys Gln Val Val Val Glu Lys Val Gly Glu

        35                  40                  45

Pro Thr Asp Ser Tyr Glu Ala Phe Thr Ala Ser Leu Pro Ala Asp Glu

    50                  55                  60

Cys Arg Tyr Ala Val Tyr Asp Phe Asp Phe Val Thr Asp Glu Asn Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Ser Arg Ile Phe Phe Ile Ala Trp Ser Pro Asp Thr Ser Lys

                85                  90                  95

Val Arg Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Arg Phe Lys Arg

            100                 105                 110

Glu Leu Asp Gly Ile Gln Val Lys Leu Gln Ala Thr Asp Pro Ser Glu

        115                 120                 125

Met Asp Leu Asp Val Ile Arg Ser Arg Ala Asn

    130                 135

Claims (8)

1、一种棉纤维发育相关基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的棉纤维发育相关基因，其特征在于：所述棉纤维发育相关基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、权利要求1所述棉纤维发育相关基因的编码蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加对棉纤维发育具有调控作用的蛋白质。

4、根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №：2氨基酸残基序列。

5、含有权利要求1所述棉纤维发育相关基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述棉纤维发育相关基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求1所述棉纤维发育相关基因的宿主菌。

8、一种改良棉纤维品质的方法，是利用植物表达载体，将权利要求1所述的棉纤维发育相关基因的反义cDNA导入棉花细胞或组织，获得棉纤维品质得到改良的转基因纤维及转基因植株。

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