CN117264976A - 一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用 - Google Patents

一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用，涉及基因功能技术领域，所述棉花细胞壁强度调控基因为GhALDH7B4_A06，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该调控细胞壁强度基因，培育高细胞壁强度的植物新品种，可提高植物的抗倒伏性，保障植物高产高效；利用该基因或其突变基因，可改良棉纤维强力，对推动棉花产业健康发展、提升人民生活品质具有重要意义。

Description

一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因功能技术领域，更具体的说是涉及一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用。
背景技术
棉花是一种重要的经济作物，由于棉花产量和纤维品质性状常呈负相关，因此利用传统育种方法协同改良棉纤维品质和产量进展缓慢，严重影响了纺纱企业和人们对高端原棉的需求，阻碍了国产棉的市场竞争力。因此，改良棉纤维品质迫在眉睫、也是今后我国棉花品种选育的首要任务。而随着棉花基因组学研究的不断深入，通过生物技术方法改良棉纤维品质已成为可能。
棉纤维品质主要涉及长度、强度和细度等指标，特别是纤维强度与成纱质量有着密切的关系，其值越高、成纱的质量越好、在纺纱加工过程中棉纤维越不易断裂，制成品率高，进而大量减少用棉消耗。但因涉及的基因数量多、调控网络复杂，虽然利用各种遗传群体获得了大量与纤维强度相关的QTLs，但进一步克隆分析、功能验证的基因还比较少，远不能满足分子改良纤维品质的需求，仍需加大力度挖掘调控棉纤维强度的关键基因，助力纤维品质改良。
因此，挖掘更多改良棉花品质的基因是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种棉花细胞壁强度调控基因及其应用。本发明所述棉花细胞壁强度调控基因注释为乙醛脱氢酶的基因，醛脱氢酶(ALDHs)是NAD(P)+依赖性酶的超家族，可催化多种内源性和外源性高活性物质的氧化脂族和芳香族醛分子。在已鉴定的植物ALDHs中，大多数在植物生长和发育中发挥关键作用，参与植物育性、激素合成、生长发育以及抗逆等多方面过程。但棉花ALDH基因在细胞壁强度形成方面的功能及分子机制研究未见报道。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种棉花细胞壁强度调控基因，所述调控基因为GhALDH7B4_A06，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的是，提供一种棉花细胞壁强度调控蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是，提供一种表达盒，包含上述的调控基因。
本发明的另一目的是，提供上述的棉花细胞壁强度调控基因或上述的表达盒在棉花育种中的应用。
优选的，所述应用为提高棉花的抗倒伏性或提高棉花的棉纤维强力。
优选的，所述应用为提高SEQ ID NO.1所示调控基因表达量，提高棉花的抗倒伏性和/或提高棉纤维强力。
本发明的另一目的是，提供一种棉花细胞壁强度调控基因的突变基因，所述突变基因在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第772位碱基出现stop无义突变导致编码提前终止。
本发明的另一目的是，提供一种棉花细胞壁强度调控基因的突变蛋白质，由上述突变基因编码。
本发明的另一目的是，提供上述棉花细胞壁强度调控基因的突变基因在棉花育种中的应用。
有益效果：本发明通过QTL定位、转录组测序和重测序，发现一个编码乙醛脱氢酶的基因GhALDH7B4_A06。该基因在棉纤维发育尤其是纤维次生壁发育时期高表达，且在低比强的RIL131和高比强的RIL229中的表达差异显著。本发明进一步在植物体内过表达该基因，可提高植物茎秆强度；利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默该基因后，棉花纤维强度显著降低，证名GhALDH7B4_A06参与细胞壁强度形成发育的调控。
利用调控细胞壁强度基因，培育高细胞壁强度的植物新品种，可提高植物的抗倒伏性，保障植物高产高效；利用该基因或其突变基因，可改良棉纤维强力，对推动棉花产业健康发展、提升人民生活品质具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为RIL131和RIL229的纤维品质性状，其中，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)，n.s.表示无显著差异，下同。
图2为GhALDH7B4_A06等位基因变异示意图。
图3为GhALDH7B4_A06基因组织表达分析。
图4GhALDH4B4_A06蛋白保守结构域分析。
图5GhALDH7B4_A06蛋白在烟草叶片细胞中的亚细胞定位。
图6GhALDH7B4_A06蛋白在拟南芥原生质体中内质网marker共定位；其中：GFP代表绿色荧光场，ER代表内质网marker，CHI代表叶绿体自发荧光场，DIC代表明场，Merge代表叠加场。
图714-3-3蛋白在棉花不同组织中的表达及BiFC检测GhALDH7B4_A06与14-3-3蛋白的互作，其中图7A为14-3-3基因在棉花中组织性特异表达分析，颜色越深表示表达量越高；图7B为BiFC检测GhALDH7B4_A06与14-3-3蛋白的互作，其中YFP代表黄色荧光蛋白场，CHI代表叶绿体自发荧光场，DIC代表明场，Merge代表叠加场。
图8GhALDH7B4_A06在转基因拟南芥中的超表达情况及花茎表型及纤维素成分鉴定；其中图8A为过表达GhALDH7B4_A06转基因与野生型拟南芥的表型，图8B为过表达转基因纯合株系OE-3和OE-15中GhALDH7B4_A06基因的相对表达量，图8C为过表达转基因纯合株系OE-3和OE-15的纤维素、半纤维和木质素含量均高于野生型WT。
图9利用VIGS验证GhALDH7B4_A06的功能，其中图9A为基因沉默株生长外部形态上与野生型无明显差异，图9B为基因沉默株中棉纤维断裂比强度显著降低。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
实施例1GhALDH7B4_A06的等位变异、差异表达及生物信息学分析
1、RIL131和RIL229纤维品质性状分析
利用优质杂交棉冀1518的亲本构建了分离群体，并形成高代RIL群体。RIL131和RIL229是RIL群体中纤维品质性状稳定分离的两个家系。连续五年鉴定，两个家系的纤维断裂比强度和马克隆值性状稳定分离，其中断裂比强度的差值达到9.64cN/tex，形成极显著差异，而其他3个性状(纤维长度、整齐度和伸长率)无显著差异(参见附图1)。
2、GhALDH7B4_A06的克隆和等位基因变异分析
本发明通过QTL定位、转录组测序和重测序，发现一个编码乙醛脱氢酶的蛋白质，采取PCR扩增克隆法分别在RIL131和RIL229纤维中克隆了位于A06染色体的编码乙醛脱氢酶的蛋白，根据NCBI上序列比对和结构域分析，该蛋白包含1个乙醛脱氢酶家族7蛋白结构域，与拟南芥中AtALDH7B4(At1g54100)序列一致性最高，为84.84％，将编码该蛋白的基因命名为GhALDH7B4_A06。该基因ORF序列全长1527bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码508个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。该基因在父本及高比强RIL229家系中为全长型的GhALDH7B4_A06O，而在母本及低比强RIL131家系中编码区第772位碱基出现stop无义突变导致编码提前终止，为截短型GhALDH7B4_A06S(参见附图2)。
ATGGGTTTTTCAAGGAAAGAGTACGAGTTCTTGAGCGAGATCGGATTGAGTTCTGGCAATTTGGGATGTTTTGTGAATGGCACCTGGAAAGGAAGTGGCCCTGTGGTTTCTACTCTTAATCCTGCCAATAATCAGAAAATTGCCGAAGTTAGTGAGGCTTCCATCCAAGACTATGAGGAAGGGATGCAAGCTTGCAGTGAAGCAGCAAAGATTTGGATGCAGGTTCCAGCCCCTAAGAGAGGTGACATAGTTCGACAAATAGGTGATGCATTGAGATCCAAACTACAGCAGCTTGGCCACCTTGTTTCTCTTGAGATGGGAAAAATTCTTCCCGAAGGAATTGGGGAAGTTCAAGAAATCATTGACATGTGTGACTTTGCTGTGGGTTTAAGCAGGCAATTGAATGGGTCCGTAATACCTTCAGAACGTCCAAATCACATGATGTTGGAGATGTGGAATCCCCTTGGAATTGTTGGTGTAATTACGGCATTTAATTTCCCATGTGCTGTTCTTGGATGGAATGCCTGCATTGCACTGGTGTGTGGAAACTGTGTTGTTTGGAAAGGTGCTCCAACCACTCCTCTGGTTACAATAGCAATGTGTGGAAACTGTGTTGTTTGGAAAGGTGCTCCAACCACTCCTCTGGTTACAATAGCAATGTTTTGTGGCGGTGCTGAAATTGGGGAAGCAATTGCAAAAGATCGACGCATTAATCTGGTTTTTTGTGGCGGTGCTGAAATTGGGGAAGCAATTGCAAAAGATCGACGCATTAATCTGGTTGGTAAATGCTTGCTTGAACTAAGTGGAAACAATGCAATAATTGTCATGGATGATACCGACGGTAAATGCTTGCTTGAACTAAGTGGAAACAATGCAATAATTGTCATGGATGATACCGACACCACATGTCGTAGACTGCTTCTTCATGAAAGTATATATCGGACTGTAGTTGACCAGCTACTTGATGTGTACAAACAAGTTAAGATAGGGGACCCACTAGAAAAGGGTACCTTGCTTGGGCTTGATGTGTACAAACAAGTTAAGATAGGGGACCCACTAGAAAAGGGTACCTTGCTTGGGCTTGATGTGTACAAACAAGTTAAGATAGGGGACCCACTAGAAAAGGGTACCTTGCTTGGGCTTGATGTGTACAAACAAGTTAAGATAGGGGACCCACTAGAAAAGGGTACCTTGCTTGGGGTTCTTTATGTCATGAAATTTAAGACTTTGAAAGAAGCAATTGAAATAAACAACTCTGTTCCTCAAGGATTGAGCAGTTCCATCTTCACTAGTAAACCTGAATTCATTTTCAAATGGATTGGGCCACAAGGAAGTGACACTGGTATTGTCAATGTGAACATACCAACCAATGGGGCTGAAATAGGTGGTGCTTTTGGTGGTGAAAAGGCCACAGGAGGAGGCCGTGAAGCTGGCAGTGATTCTTGGAAACAATACATGCGACGGTCAACCTGCACAATAAACTACGGGAGTGAGTTACCGCTGGCCCAAGGAATCAATTTCGGCTAG，SEQ ID NO：1。
MGFSRKEYEFLSEIGLSSGNLGCFVNGTWKGSGPVVSTLNPANNQKIAEVSEASIQDYEEGMQACSEAAKIWMQVPAPKRGDIVRQIGDALRSKLQQLGHLVSLEMGKILPEGIGEVQEIIDMCDFAVGLSRQLNGSVIPSERPNHMMLEMWNPLGIVGVITAFNFPCAVLGWNACIALVCGNCVVWKGAPTTPLVTIAMTKLVAEVLEKNNLPGAIFTSFCGGAEIGEAIAKDRRINLVSFTGSSKVGVKVQQTVNERFGKCLLELSGNNAIIVMDDTDIKLAVRSVLFAAVGTAGQRCSFTGSSKVGVKVQQTVNERFGKCLLELSGNNAIIVMDDTDIKLAVRSVLFAAVGTAGQRCQGGKILTGGGIIESEGNFVQPTIVEISPDADVVKEELFAPVLYVMKFKTLKEAIEINNSVPQGLSSSIFTSKPEFIFKWIGPQGSDTGIVNVNIPTNGAEIGGAFGGEKATGGGREAGSDSWKQYMRRSTCTINYGSELPLAQGINFG，SEQ ID NO：2。
3、GhALDH7B4_A06基因表达分析
以GhHistone3为内参基因，qRT-PCR检测该基因在根、茎、叶三个组织，0DPA(Dayspostanthesis，开花后天数)胚珠及5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA六个时期的纤维组织中GhALDH7B4_A06的表达情况(参见附图3)。
GhALDH7B4_A06基因引物如下：
GhALDH7B4_A06-F：5’-CAGCTTGGCCACCTTGTTTC-3’，SEQ ID NO：3；
GhALDH7B4_A06-R：5’-ACCCACAGCAAAGTCACACA-3’，SEQ ID NO：4。
结果表明，GhALDH7B4_A06在RIL229根、茎、叶、0DPA胚珠等组织及不同发育时期纤维中的表达量始终显著或极显著高于RIL131，且在棉纤维15-25DPA中均具有特异优势表达，并在RIL131和RIL229的20DPA纤维组织中差异表达倍数最大，表明GhALDH7B4_A06可能在棉纤维次生壁发育时期发挥作用，且GhALDH7B4_A06O比GhALDH7B4_A06S在细胞壁强度形成期具有更显著的表达优势。
4、氨基酸序列理化性质分析及信号肽、跨膜结构域预测
通过ExPASy在线软件分析全长型GhALDH7B4_A06蛋白的分子式为C2423H3885N653O729S24，分子质量为54597.88D，理论等电点为5.83，不稳定指数为35.13，属于稳定性蛋白。该蛋白包含508个氨基酸，其中甘氨酸(Gly)占11.2％，比例最高，异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)均占8.3％。使用SignalP6.0和TMHMM2.0在线软件对GhALDH7B4_A06蛋白进一步分析，发现该蛋白无信号肽，无跨膜结构域。
5、氨基酸序列的蛋白结构预测
利用SOPMA预测蛋白的二级结构，GhALDH7B4_A06O和GhALDH7B4_A06S在各类结构的氨基酸数量(占比)分别为：α-螺旋215aa(42.32％)，113aa(43.97％)；延伸主链86aa(16.93％)，44aa(17.12％)；β-转角32aa(6.30％)，14aa(5.45％)；无规则卷曲175aa(34.45％)，86aa(33.46％)。根据蛋白保守结构域的分析(参见附图4)，全长型基因编码蛋白GhALDH7B4_A06O包含两个结构域，但截短型蛋白GhALDH7B4_A06S因终止子的出现造成一个结构域结构不全，另一个结构域缺失，且蛋白中谷氨酸活性位点(PS00687)缺失，从而导致该基因在RIL131中功能丧失。
实施例2GhALDH7B4_A06的亚细胞定位及互作蛋白
1、亚细胞定位
以RIL229家系的纤维cDNA为模板，采用同源重组和goldengate无缝克隆方法，将GhALDH7B4_A06编码区区段构建到带有35SCaMV启动子和GFP标签的pCAMBIA1302载体中，构建融合载体pCAMBIA1302-GhALDH7B4-GFP。瞬时转化烟草叶片，使用激光共聚焦显微镜观察，GhALDH7B4_A06蛋白主要定位在细胞质或细胞壁，使用0.8M甘露醇处理30min，进行质壁分离排除其在细胞壁上的可能性，质壁分离后白色箭头的指向为细胞壁，该边缘无荧光，说明该基因在细胞壁上无表达(参见附图5)。
载体引物：
pCAMBIA1302-GhALDH7B4-GFP-F：5’-cgatGGTCTCacaacAT GGGTTTTTCAAGGAAA-3’，SEQ ID NO：5；
pCAMBIA1302-GhALDH7B4-GFP-R：5’-cagtGGTCTCatacaGC CGAAATTGATTCCTTGG-3’，SEQ ID NO：6。
将载体瞬时转化拟南芥原生质体，并使用内质网marker标记(参见附图6)，可见目的基因没有和内质网marker完全重叠，因此GhALDH7B4_A06蛋白主要表达在细胞质内，不局限于内质网上，且细胞核内也有较弱表达。
2.BiFC验证GhALDH7B4_A06与已报道纤维发育相关的Gh14-3-3蛋白的互作
14-3-3蛋白已被报道与棉纤维发育密切相关(Zhang等,2010)，本发明通过免疫共沉淀和质谱联用的CoIP-MS方法，筛选得到GhALDH7B4_A06的互作蛋白Gh14-3-3，根据NCBI序列比对，及比回到陆地棉标准系TM-1的参考基因组(ZJUv2.1)中，调取该基因ID为GH_D05G1589，转录组测序结果表明该基因在纤维发育时期尤其是次生壁合成时期高表达(数据来源于NCBI的SRA数据库，序列号为PRJNA4906267)。以RIL229家系的纤维cDNA为模板，采用同源重组和goldengate无缝克隆方法，将GhALDH7B4_A06和GH_D05G1589编码区区段分别构建到带有35SCaMV启动子的pCAMBIA1302载体中，载体分别带有cYFP和nYFP标签，获得GhALDH7B4-cYFP和nYFP-GH_D05G1589表达载体，BiFC验证了GhALDH7B4_A06与14-3-3互作(参见附图7)，互作产生的黄色信号主要分布在细胞质和细胞膜，在细胞质中呈现明显的内质网定位，与叶绿体荧光信号无重合。
载体引物：
GhALDH7B4-cYFP-F:5’-attacaggtacccggggatcATGGGTTTTTCAAGGAAAGAGTACGAGTTCTTG-3’，SEQ ID NO：7；
GhALDH7B4-cYFP-R:5’-gccaccgccgtcgactctagGCCGAAATTG ATTCCTTGGGCCAG-3’，SEQ ID NO：8。
nYFP-GH_D05G1589-F:5’-atcgaggacgccggcggatcATGGATTTCTCCAAAGAACGTGAAAGATTCGTTTAC-3’，SEQ ID NO：9；
nYFP-GH_D05G1589-R:5’-gctctgcaggtcgactctagTCATTCATCTCCTTCACCCACTTTAGCAG-3’，SEQ ID NO：10。
实施例3过表达GhALDH7B4_A06的转基因拟南芥茎纤维强度鉴定
以RIL229家系的纤维cDNA为模板，采用同源重组和goldengate无缝克隆方法，将GhALDH7B4_A06编码区区段构建到带有35SCaMV启动子的pCAMBIA1302载体中，构建过表达载体pCAMBIA1302-GhALDH7B4_A06。
载体引物：
GhALDH7B4_A06-OE-F：5’-tggagagaacacgggggactttgcaacATGGGTTTTTCAAGGAAAGAGTACGAG-3’，SEQ ID NO：11；
GhALDH7B4_A06-OE-R：5’-cagtactgaagacagagctagttacaCTAGCCGAAATTGATTCCTTGGGC-3’，SEQ ID NO：12。
采用蘸花法转化拟南芥，在1/2MS+75mg/LHygromycinB的培养基中筛选阳性植株至T3代，经qRT-PCR测定目的基因相对表达量，获得了2个GhALDH7B4_A06过表达转基因纯合株系：OE-3、OE-15(参见附图8)。
纤维强度主要形成于细胞次生壁增厚期，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。一般而言，纤维素的结晶度大，植株茎秆或细胞的抗拉强度、抗弯强度、稳定性就高。对转基因拟南芥株系进行各成分鉴定，将MS培养基上生长7d的拟南芥移苗至营养土中，野生型(WT)和转基因拟南芥采用统一的生长环境和管理措施。表型结果显示(参见附图8A)，转基因拟南芥长势强于野生型，且具有更强的花茎硬度，不易倒。取成熟期约8周花茎第一茎节自下而上约10cm用于结晶化纤维素、半纤维素和木质素含量的测定，结果表明转基因后代的纤维素、半纤维和木质素含量均高于野生型WT(参见附图8C)，其中纤维素含量在过表达和野生型之前差异最为显著，说明过表达GhALDH7B4_A06可提高纤维素含量，进而提高植物的细胞壁强度。
实施例4：VIGS沉默GhALDH7B4_A06的植株纤维品质鉴定
采用VIGS技术通过双酶切(SpeI和AscI)的方法将GhALDH7B4的目标片段构建到CLCrV载体上(Gu等,2014)，该体系经多项研究证明病毒活力能够持续到棉花纤维发育的伸长和次生壁加厚等阶段(Tian等,2022；Liu等,2019)。
载体引物：
CLCrVA-GhALDH7B4-F：5’-atggcatgcctgcagactagtTGGCAATT TGGGATGTTTTGT-3’，SEQ ID NO：13；
CLCrVA-GhALDH7B4-R：5’-ttcactagacctaggggcgcgccTGAACTT CCCCAATTCCTTCG-3’，SEQ ID NO：14。
以RIL229为材料，通过阳性对照组CLCrV:PDS棉株的白化症状初步判断沉默效果，并取CLCrV:00阴性对照和CLCrV:GhALDH7B4植株25DPA棉铃纤维，利用qRT-PCR确定基因沉默效率。阳性对照出现的白化症状会持续到棉铃发育时期，使棉铃苞叶、铃壳等均出现白化现象，说明该病毒在棉铃发育时期仍具有基因沉默作用。CLCrV:00和CLCrV:GhALDH7B4植株在注射后的生长外部形态上与野生型(WT)无明显差异(参见附图9A)。qRT-PCR结果显示，GhALDH7B4_A06在沉默效率较好的植株效率为42.81％-78.30％，平均沉默效率65.16％。纤维品质检测结果中，和阴性对照相比，CLCrV:GhALDH7B4棉纤维断裂比强度显著降低，马克隆值有所降低但差异不显著，其他三个性状差异均不显著(参见附图9B)。上述结果表明，沉默GhALDH7B4_A06基因使棉花纤维断裂比强度下降，同时可能对马克隆值也有一定影响，提示GhALDH7B4_A06在植物细胞壁强度形成中具有调控作用。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明所涉及的参考文献如下：
ZHANGZT,ZHOUY,LIY,SHAOSQ,LIBY,SHIHY,LIXB.Interactomeanalysisofthesixcotton14-3-3sthatarepreferentially expressedinfibresandinvolvedincellelongation[J].Journalof experimentalbotany,2010,61(12):3331-3344.
GUZH,HUANGCJ,LIFF,ZHOUXP.Aversatilesystemfor functionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton.Plant BiotechnologyJournal,2014,12(5):638-649.
TIANZL,ZHANGYZ,ZHULP,JIANGB,WANGHQ,GAOR X,FRIMLJ,XIAOGH.Strigolactonesactdownstreamofgibberellinstoregulatefibercellelongationandcellwallthicknessincotton(Gossypiumhirsutum).ThePlantCell,2022,34(12):4816-4839.
LIUGY,LIUJ,PEIWF,LIXH,WANGNH,MAJJ,ZANGXS,ZHANGJF,YUSX,WUM,YUJW.AnalysisoftheMIR160genefamilyandtheroleofMIR160a_A05inregulatingfiberlengthincotton.Planta,2019,250(6):2147-2158.

Claims (9)

1.一种棉花细胞壁强度调控基因，其特征在于，所述调控基因为GhALDH7B4_A06，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种棉花细胞壁强度调控蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求1所述的调控基因。
4.权利要求1所述的棉花细胞壁强度调控基因或权利要求3所述的表达盒在棉花育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为提高棉花的抗倒伏性或改良棉花的棉纤维强力。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，提高SEQ ID NO.1所示调控基因表达量，提高植株的抗倒伏性和/或提高棉纤维强力。
7.一种棉花细胞壁强度调控基因的突变基因，其特征在于，所述突变基因在SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的第772位碱基出现stop无义突变导致编码提前终止。
8.一种棉花细胞壁强度调控基因的突变蛋白质，其特征在于，由权利要求7所述突变基因编码。
9.权利要求7所述棉花细胞壁强度调控基因的突变基因在棉花育种中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597718A (en) * 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
WO2005047472A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Boyce Thompson Institute For Plant Research Increasing seed threonine content through alteration of threonine aldolase activity
CN1715412A (zh) * 2005-07-20 2006-01-04 中国科学院微生物研究所 一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与应用
CN101210250A (zh) * 2007-12-24 2008-07-02 浙江大学 茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh及其应用
CN102643857A (zh) * 2012-04-25 2012-08-22 中国科学院新疆生态与地理研究所 利用乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用
CN105950632A (zh) * 2016-05-25 2016-09-21 华中师范大学 棉花纤维发育相关的GhFSN1基因鉴定及应用
WO2018010513A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 中国科学院上海生命科学研究院 棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用
CN109593875A (zh) * 2019-01-11 2019-04-09 华中农业大学 棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用
CA3141340A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-17 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants that express a polyhydroxyalkanoate synthase seed specifically with cytosolic localization

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597718A (en) * 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
WO2005047472A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Boyce Thompson Institute For Plant Research Increasing seed threonine content through alteration of threonine aldolase activity
CN1715412A (zh) * 2005-07-20 2006-01-04 中国科学院微生物研究所 一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与应用
CN101210250A (zh) * 2007-12-24 2008-07-02 浙江大学 茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh及其应用
CN102643857A (zh) * 2012-04-25 2012-08-22 中国科学院新疆生态与地理研究所 利用乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用
CN105950632A (zh) * 2016-05-25 2016-09-21 华中师范大学 棉花纤维发育相关的GhFSN1基因鉴定及应用
WO2018010513A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 中国科学院上海生命科学研究院 棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用
CN109593875A (zh) * 2019-01-11 2019-04-09 华中农业大学 棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用
CA3141340A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-17 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants that express a polyhydroxyalkanoate synthase seed specifically with cytosolic localization

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨红兰;张大伟;李海燕;张道远;: "转ScALDH21基因棉花植株能提高棉花抗盐能力", 分子植物育种, no. 01, 28 January 2015 (2015-01-28), pages 71 - 5 *

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