CN102643857A - 利用乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，所述乙醛脱氢酶基因从新疆极端耐旱藓类植物齿肋赤藓中克隆得到(ScALDH21)；所述齿肋赤藓乙醛脱氢酶(ScALDH21)基因的mRNA序列如Genebank号GQ245973所示；所述编码基因的DNA序列如Genebank号GQ245974所示；将ScALDH21基因重组到一个植物表达载体中，转化入棉花细胞并让其表达，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出稳定遗传的T₃代植株，培育出棉花抗旱育种新种质，进而创建出棉花抗旱育种新材料，以用于棉花的常规品种或杂交品种培育。

Description

利用乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及乙醛脱氢酶(ALDH)及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用。

背景技术

干旱是抑制植物生长和降低农作物产量的重要环境因子。我国约有二分之一的国土面积处于干旱、半干旱区，即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾的侵袭。因此，随着我国人口的增加和水资源亏缺以及耕地面积的日益减少，开发利用干旱地变得越来越重要。利用现在基因工程技术，培育优良的耐旱作物品种，大幅度提高优良育种材料的耐旱性能，使其在广阔的干旱地生长，无疑是可能解决或调解此类问题的有效策略之一。

植物对干旱的抗性或耐性不是单一机制起作用的结果，而是一个复杂的过程，其涉及细胞适应性的许多机制以及众多的代谢途径。随着植物基因工程技术的发展，克隆并转化抗旱基因，使其在目标植物中表达，可以加快抗旱新品种的培育。近年来，国内外很多科学家在干旱胁迫下诱导基因的表达、克隆、基因功能验证及遗传转化等方面做了大量的工作。已培育出具有抗旱性能的小麦、水稻、玉米、马铃薯等许多重要农作物新种质(McKersie和Leshem，1994.Stress and stress coping in cultivated plants，Kluwer Academic Publishers)。

从本土抗旱性植物中克隆得到新的独特的基因是开展农作物种质创新的源头。乙醛脱氢酶(ALDH)是一类毒性降解酶类，在动植物新陈代谢中都起着重要作用，是目前所发现的最大的基因家族(Jose et al，2010)。乙醛脱氢酶在植物体中经过长期演化发展，据报道植物体中共有11个亚家族：ALDH2，ALDH3，ALDH5，ALDH6，ALDH7，ALDH10，ALDH11，ALDH12，ALDH18，ALDH19和ALDH21。其中，ALDH11，ALDH19和ALDH21是植物中特有的，尤其ALDH21仅存在苔藓植物中(Hans-Hubert，2004)。植物中的乙醛脱氢酶(ALDH)家族按功能主要分为两大类：一类是参与植物体内正常的代谢活动，另一类是参与植物体逆境胁迫时清除乙醛毒害途径使机体免受损伤。

目前，对于植物乙醛脱氢酶家族抗逆性研究备受关注。Jose(2010)报道玉米基因组中共有24个乙醛脱氢酶基因，分别属于10个亚家族。水稻基因组中也发现很多参与干旱胁迫的乙醛脱氢酶基因(Chen，et al，2009)。大豆基因组中发现18个乙醛脱氢酶(ALDH)基因，分别属于5个乙醛脱氢酶(ALDH)亚家族，它们参与了去毒害代谢途径(Simeon et al，2012)。乙醛脱氢酶(ALDH)家族在PDH等代谢途经中的作用也有研究报道(Wei et al，2009)，与植物的抗旱性能有关的ALDH亚家族基因主要是ALDH3、ALDH7、ALDH10、ALDH11，并成功转化拟南芥和烟草进行了基因功能验证，表明它们能显著提高植物耐旱性(Hans-Hubert，2005；Simone M.，2006；Simon，2006)。在前期研究中，申请人已从荒漠极端耐旱的藓类植物-齿肋赤藓中克隆了ScALDH21基因，并通过分析基因结构、半定量RT-PCR和大肠杆菌过表达实验表明ScALDH21参与干旱胁迫响应，并且响应外源ABA诱导(杨红兰等，2010)。因此，利用从齿肋赤藓中克隆得到的ScALDH21基因遗传转化农作物并使其过表达，改良育种材料的耐旱性，进而选育出具有重大突破的新品种，具有重要意义。

棉花是我国重要的经济作物。在棉花主栽区，干旱和土壤盐渍化是影响棉花产量的主要因素。在严重干旱情况下，棉花会出现生长缓慢以及落蕾落铃等现象，从而严重影响棉花的生产。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐旱棉花具有重要的战略意义。目前，棉花的转基因工作主要集中在抗鳞翅目昆虫方面，抗虫棉已在国内外大面积推广。而采用转基因技术创制耐旱棉花的工作在国内外尚处起步阶段。迄今国内外仅见几例获得耐旱性提高转基因棉花的报道，包括“New protein，being a protein composed of amino acid sequences，useful for culturing a plantwith improved anti-drought capability”(专利申请公开号：CN101481410-A)；“Generation of plant with improved drought tolerance”(专利申请号：US7968768B2)；“一种利用聚合抗逆基因提高棉花耐盐抗旱性的方法”(专利申请公开号：CN101624604A)等，其实用价值尚有待考证；但利用乙醛脱氢酶(ALDH)及其编码基因培育抗旱转基因棉花尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，所述乙醛脱氢酶基因从新疆极端耐旱藓类植物齿肋赤藓中克隆得到ScALDH21；所述齿肋赤藓乙醛脱氢酶ScALDH21基因的mRNA序列如Genebank号GQ245973所示；所述编码基因的DNA序列如Genebank号GQ245974所示；将ScALDH21基因重组到一个植物表达载体中，转化入棉花细胞并让其表达，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出稳定遗传的T₃代植株，培育出棉花抗旱育种新种质，进而创建出棉花抗旱育种新材料，以用于棉花的常规品种或杂交品种培育。

本发明所述的一种乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，按下列步骤进行：

a、将从新疆极端耐旱藓类植物齿肋赤藓中克隆得到的齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ScALDH21通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株；

b、通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T₃代转基因植株；

c、转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用，根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并结合盆栽试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料，获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。

所述齿肋赤藓乙醛脱氢酶ScALDH21基因的mRNA序列如Genebank号GQ245973所示。

所述编码基因的DNA序列如Genebank号GQ245974所示。

所述用于遗传转化的棉花品种为新农棉1号。

本发明对转基因植株进行筛选，从抗性植株及其后代中筛选出转基因T₃代植株的方法是：通过对3-4叶期转基因棉花叶片涂抹卡那霉素(5g/L)检测转基因植株，对筛选出的阳性植株利用常规的分子检测技术进行进一步验证，获得稳定转化的转基因植株T₁代；次年，将收获的T₁代种子进行大田种植，重复上述步骤，直至获得稳定转化的T₃代转基因植株。

所述获得的转基因T₃代植株耐旱性鉴定方法是：采用生理生化指标和盆栽鉴定相结合的策略，筛选出耐旱能力明显提高的株系，从中选择优异材料培育棉花耐旱新种质。

本发明所述获得的转基因棉花为转ScALDH21基因陆地棉新农棉1号棉花T₃代转基因植株。

本发明的实验证明，与野生型和转空载体植株相比，转ScALDH21基因棉花的抗旱性得到增强。

本发明获得的转基因植株可直接应用于棉花的常规品种或杂交品种培育。

本发明的基本思路是依据植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新进展，利用从本土抗逆植物齿肋赤藓中克隆的、与抗逆性密切相关的乙醛脱氢酶(ScALDH21)基因，采用转基因技术，将能够显著提高植物细胞中抗旱特性的ScALDH21基因导入棉花品种中，实现该基因的过表达，从而大幅度提高植株的耐旱性。转基因棉花采用花粉管通道法，转基因植株用PCR检测、RT-PCR验证；外源基因表达研究采用实时荧光定量PCR方法。植株抗逆性采用植物生理学和作物栽培学方法，其中转基因植株抗旱性测定采用盆栽干旱处理试验-生理指标测定。在棉花的遗传转化中，以我国新疆地区主载的陆地棉品种新农棉1号为受体材料，采用花粉管通道法进行转化。采用夏季在新疆育种，冬季到海南加代育种的方法，一年可继代育种2次，直至获得稳定遗传的转基因T₃代植株。转基因遗传稳定性测定采用经典的遗传学方法，结合于PCR检测。

本发明实施的具体步骤为：

将ScALDH21基因通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株。

通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T₃代转基因植株。

转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用。根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并结合盆栽试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料。获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。

附图说明

图1为本发明pCAMBIA2300-ScALDH21植物表达载体构建示意图。

图2为本发明pCAMBIA2300-ScALDH21质粒PCR电泳图。其中M：DNA marker；Lane1，2：pCAMBIA2300-ScALDH21质粒PCR。

图3为本发明转基因棉花的RT-PCR电泳图。其中Lane M：250bp marker；L1-L4：分别为转基因棉花阳性植株5-3-1，5-3-2，5-3-3和5-1-4。

图4为本发明转基因阳性植株5-3-1，5-3-2，5-3-3和5-1-4干旱处理后ScALDH21基因实时荧光定量PCR图，CK表示干旱处理前的样品，18d表示自然干旱处理18天的样品，24h表示干旱后复水24小时的样品，36h表示干旱后复水36小时的样品。

图5为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片丙二醛(MDA)含量，其中表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图6为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片游离脯氨酸含量，其中表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图7为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片可溶性蛋白含量，其中

表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图8为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片净光合速率变化，其中表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图9为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片气孔导度变化，其中

表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图10为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片蒸腾速率变化，其中

表示干旱处理前，表示自然干旱处理18天，表示复水24小时后。

图11为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性变化，其中

表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，

表示复水24小时后。

图12为本发明干旱处理前、自然干旱处理18天及复水24小时后棉花叶片过氧化物酶(POD)活性变化。其中表示干旱处理前，

表示自然干旱处理18天，表示复水24小时后。

图13为本发明自然干旱处理18天后复水，并在原花盆中培养40天后棉花形态指标及生物量变化，其中

表示对照WT植株，

表示转基因植株(4个植株平均值)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例(抗旱转基因棉花创制)

1、植物表达载体的构建

ScALDH21基因由本课题克隆自极端耐旱齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)。

ScALDH21基因核苷酸序列如Genebank号GQ245973所示，基因序列为：

ATGACGGGGGAAGTGAAGGAGTATCGCTTGTTGCTAGCTTCCAAACCTGTGGAAGCTGACCGTGAATTCCTGGATGTCACCAACAAGTACACAGGCGAAGTTGGTGCGAAGGTGCAGCTGGCAACCCACGATGATGTTGACAAGGCAATCGACGCAGCTGTGGCTGCAGCGCCCGCAATGGCAGCTCTGGGCGCGTTCGAACGGAAAGCCATCCTTGAGAAGACAGTGGCAGAGCTGAAGAAGCGGGCGGAGGAGATCGCTCAGATCTTGACGATGGAGTCCGGGAAGCCGATCAAGGATGCCAGAGGCGAAGTGTCGCGAACCATCGATACGTTCCAAGTCGCAGCTGAGGAGAGTGTGAGAATCTACGGCGAGCACATGCCTCTCGATATCTCTGCACGCAACAAGGGCCTCCAGGGGATAGTGAAGAAGTTTCCGATCGGGCCTGTGTCCATGGTGAGTCCCTGGAACTTCCCGCTCAACTTGGTGGCGCACAAGGTGGCCCCGGCGCTAGCTGTGGGGTGCCCTTTCGTGTTGAAACCTGCAAGCAGGACGCCGCTTTCGGCTCTCATTCTGGGGGACATTCTGTCCCGGATCGAGGAGCTGCCCAAGGGCGCGTTCTCTGTCCTTCCTGTGTCCAGAGCGGACGCTGACATGTTCACCGTCGATGAGCGCTTCAAGCTCCTCACTTTCACTGGCTCAGGCCCCGTTGGGTGGGACATGAAGGCCCGCGCTGGAAAGAAAAAGGTGGTGATGGAGCTGGGTGGGAACGCGCCATGCATTGTGGATGACTACGTTCCGGACTTGGATTACACCATCCAACGGTTGATCAACGGAGGATTCTACCAAGGTGGCCAGTCGTGCATTCACATGCAGCGTCTGTATGTGCACGAGCGTCTCTACGACGAGGTGAAGGCGGAGTTTCTAGCGCAAGTGAAGAAGCTGAAAGTGGGCAACCCATTCGAGGACGACACGTTCATCGGCCCCATGATTTCCGAGAAGGACGCGACGCGCGTCGAGGACTGGGCGAAAGAAGCTGTGGAGAAAGGCGGCAAGCTCCTCTGTGGTGGAAGCCGCAAGGGCGCTGTCATGCAGCCCACAGTCCTTGAGGATGTGCCCATGGACGCCATGGCCAGGAAAGAAGAGATCTTCGGCCCAGTGGTGCTCCTCTACAAATACAGTGATTTCAAGGAAGCTGTCAAGGAGTGCAACAACACGCATTATGGACTGCAATCCGGCATCTTCACCAAGGATCTCAACAAAGCGTTCTACGCCTTCGAACACATGGAGGTGGGAGGTGTGATCCTCAACGACTCCCCGGCGCTTCGAGTGGACAGTCAGCCGTATGGCGGCCTGAAAGGCTCCGGCATCCAGCGTGAGGGCGTCAAGTACGCCATGGAAGACATGCTGGAAACAAAAGTGCTCGTCATGCGCAACGTGGGAGTCCTCTAG；

其中，1至1452碱基序列为开放阅读框ORF；

由该基因编码的ScALDH21氨基酸序列为：

TRANSLATINMTGEVKEYRLLLASKPVEADREFLDVTNKYTGEVGAKVQLATHDDVDKAIDAAVAAAPAMAALGAFERKAILEKTVAELKKRAEEIAQILTMESGKPIKDARGEVSRTIDTFQVAAEESVRIYGEHMPLDISARNKGLQGIVKKFPIGPVSMVSPWNFPLNLVAHKVAPALAVGCPFVLKPASRTPLSALILGDILSRIEELPKGAFSVLPVSRADADMFTVDERFKLLTFTGSGPVGWDMKARAGKKKVVMELGGNAPCIVDDYVPDLDYTIQRLINGGFYQGGQSCIHMQRLYVHERLYDEVKAEFLAQVKKLKVGNPFEDDTFIGPMISEKDATRVEDWAKEAVEKGGKLLCGGSRKGAVMQPTVLEDVPMDAMARKEEIFGPVVLLYKYSDFKEAVKECNNTHYGLQSGIFTKDLNKAFYAFEHMEVGGVILNDSPALRVDSQPYGGLKGSGIQREGVKYAMEDMLETKVLVMRNVGVL；

将上述ScALDH21基因插入含有35S启动子和OCS终止子的pCAMBIA2300植物表达载体中，构建pCAMBIA2300-ScALDH21植物表达载体，ScALDH21基因的酶切位点：Sal I和Kpn I；

植物表达载体构建过程参见图1；

将上述构建的pCAMBIA2300-ScALDH21表达载体转化大肠杆菌DH5α，为了验证载体和质粒的可靠性，进行PCR检测及酶切验证，结果表明ScALDH21与pCAMBIA2300正确连接，ScALDH21引物为：F：5′-ATGACGGGGGAAGTGAAGG-3′，R：5′-CTAGAGGACTCCCACGTTGC-3′。

2、转基因棉花T3代植株获得

用改进的碱裂解法大量提取pCAMBIA2300-ScALDH21质粒，棉花首次于2010年1月在海南三亚中国农科院棉花基地利用花粉管通道法进行遗传转化，导入量为每朵花0.1μg质粒DNA，转化的棉花品种为新农棉1号，收获的T₀代种子于2010年5月在新疆农科院库尔勒棉花实验基地播种，至3片叶期时经田间卡那霉素检测和室内PCR检测的阳性株于2010年10月收获种子，得到T₁代种子。同样方法2011年1月在海南加代繁殖得到T₂代种子，并于2011年5月在新疆库尔勒棉花实验基地播种，种植至2-3片叶期时，将39株卡那霉素检测阳性的T₃代棉花幼苗从库尔勒棉花基地转移至乌鲁木齐中国科学院新疆生态与地理研究所植物逆境生物学实验室，进行阳性植株检测；

首先用5g/L的卡那霉素溶液涂抹叶片同一部位连续涂抹3天以进一步验证大田卡检结果，结果39株中有29株为卡那霉素检测阳性植株，7天后对30株阳性株进行室内分子检测，室内利用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA，通过PCR法确定阳性植株，最终获得5株转化阳性苗(见图3)，然后进行Southern和Northern分析，最终选择T₃代ScALDH21基因能够转录表达、单拷贝插入基因组的4个转基因植株，5-3-1，5-3-2，5-3-3，5-1-4，进行抗旱性生理检测实验，并选择转空载体的阴性株WT做为对照。

3、转基因植株的抗旱性检测

将上述T₃代4个转基因棉花植株及WT在原花盆中实时干旱胁迫处理，将4个基因转化株以及对照株WT分别放置在组培室中实施自然干旱18天处理(干旱实施18天处理后土壤含水量为6.5％)，然后复水(自来水浇透处理)，组培室条件为：温度28℃，湿度45％，关照时间14h(光照)/10h(黑暗)，光强7000Lux(TES1330A Digital Lux Meter)。分别选取干旱处理前、干旱处理18天以及复水24小时后生长状态一致的同一部位叶片进行转基因植株LEA基因转录水平表达量分析和转基因植株抗旱性生理指标测定的研究：

(1)转基因植株LEA基因转录水平表达量分析

分别提取上述材料棉花叶片总RNA，利用实时荧光定量RT-PCR分析ScALDH21基因转录水平表达量，以检测ScALDH21基因对干旱的响应情况，以UBQ7为实时荧光定量RT-PCR的内参基因；

结果如图4所示：相比较干旱处理前，转基因棉花在自然干旱18天处理后ScALDH21基因表达量显著增加，说明干旱胁迫诱导ScALDH21基因的表达及积累。

(2)转基因植株抗旱性生理指标测定：

实验重复3次。

①丙二醛(MDA)含量变化

丙二醛含量变化结果见图5，结果表明：干旱胁迫前，WT和转基因棉花MDA含量差别不显著；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的丙二醛含量都呈现上升趋势，但WT的丙二醛含量极显著高于转基因棉花(5-1-4植株除外)；复水24小时后，WT和转基因棉花的丙二醛含量较干旱处理均呈现下降趋势，但WT的丙二醛含量仍极显著高于转基因棉花(5-1-4植株除外)，结果表明：在干旱胁迫发生的情况下，转ScALDH21基因的棉花植株可以显著减少丙二醛的生成量；

丙二醛是膜脂过氧化的主要产物之一，具有很强的毒性。膜脂过氧化会引起膜中蛋白质聚合、交联以及类脂的变化，使膜上的孔隙变大，通透性增加，离子大量外泄引起细胞代谢紊乱，严重时导致植物受伤或死亡，因此丙二醛含量高低可用以衡量植物在逆境胁迫下生物膜受活性氧伤害的程度，在模拟干旱胁迫试验中，转ScALDH21基因棉花植株可以有效减少丙二醛的生成量，降低膜脂的氧化程度，保护膜脂的稳定性。因此，转ScALDH21基因棉花有助于在干旱胁迫时保护膜脂稳定，进而保护细胞膜的完整性与稳定性，对于植株正常生命活动的维持发挥重要作用。

②游离脯氨酸含量变化结果

游离脯氨酸含量变化结果见图6，结果表明：干旱胁迫前，WT和转基因棉花游离脯氨酸含量差别不显著；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的游离脯氨酸含量都呈现上升趋势，并且转基因植株游离脯氨酸含量显著高于WT，增幅为WT的1.5-5倍；复水24小时后，WT和转基因棉花的游离脯氨酸含量较干旱胁迫均下降，但转基因植株游离脯氨酸含量多数显著高于WT，总体结果显示：在干旱胁迫发生的情况下，转ScALDH21基因棉花植株可以提高植株游离脯氨酸的含量；

游离脯氨酸是重要的渗透调节物质，植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程，因而能有效防止细胞脱水的作用。本研究创制的ScALDH21基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高游离脯氨酸的含量，对于增加棉花的抗旱性能有贡献。

③可溶性蛋白含量变化

可溶性蛋白含量变化结果见图7，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花可溶性蛋白含量高于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的可溶性蛋白含量都呈现上升趋势，并且转基因植株可溶性蛋白含量显著高于WT(5-3-3除外)；复水24小时后，WT和转基因棉花可溶性蛋白含量均增加，并且转基因植株可溶性蛋白含量显著高于WT(5-3-3除外)。结果表明：在干旱胁迫发生的情况下，转ScALDH21基因棉花植株可以提可溶性蛋白的含量；

如细胞内可溶性糖一样，在干旱胁迫下，可溶性蛋白浓度的提高可增强细胞的渗透吸水能力从而增强植物的抗旱性。本研究创制的转ScALDH21基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高可溶性蛋白含量和生成量，提高植株的抗旱性。

④净光合速率变化

净光合速率变化结果见图8，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花净光合速率显著高于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的净光合速率都呈现下降趋势，且下降后转基因植株净光合速率高于WT；复水24小时后，WT和转基因棉花净光合速率均增加，结果表明：转ScALDH21基因棉花具有更高效的净光合速率，并且在干旱胁迫发生的情况下，转基因棉花植株仍具有较WT高的净光合速率。

⑤气孔导度变化

气孔导度变化结果见图9，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花气孔导度显著高于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的气孔导度都呈现下降趋势，但转基因植株下降速率更快，且下降后转基因植株气孔导度均显著高于WT；复水24小时后，WT和转基因棉花气孔导度仍在缓慢下降，或者略有恢复(5-3-2)，但转基因植株气孔导度值均显著高于WT，结果表明：转ScALDH21基因棉花具有较高的气孔导度，并且在干旱胁迫发生的情况下，转基因棉花具有更为敏感和快速的气孔关闭响应，进而减少干旱带来的伤害。

⑥蒸腾速率变化

蒸腾速率变化结果见图10，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花蒸腾速率显著高于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的蒸腾速率都呈现下降趋势，但转基因植株下降速率更快，且下降后转基因植株蒸腾速率均显著高于WT；复水24小时后，WT和转基因棉花蒸腾速率仍在下降，但转基因植株蒸腾速率值均显著高于WT，结果表明：转ScALDH21基因棉花具有更高的蒸腾速率，并且在干旱胁迫发生的情况下，与更为敏感的气孔关闭响应发生一样，转基因棉花植株具有更为快速的蒸腾速率调整，以减少干旱带来的伤害。

⑦超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

超氧化物歧化酶活性变化结果见图11，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花超氧化物歧化酶活性低于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的超氧化物歧化酶活性都呈现上升趋势，但转基因植株超氧化物歧化酶活性显著高于WT；复水24小时后，WT和转基因棉花超氧化物歧化酶活性均出现下降，但转基因植株超氧化物歧化酶活性值均显著高于WT，结果表明：在干旱胁迫发生的情况下，转ScALDH21基因棉花可在体内迅速积累超氧化物歧化酶；

干旱胁迫可促使植物中活性氧的产生，从而伤害细胞，活性氧含量随干旱胁迫的加剧而增加。在此情况下，植物能产生不同的保护酶和非酶保护物质，以解除增加的O^2-和H₂O₂的伤害。超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除O^2-和H₂O₂的重要保护酶，SOD的活性与含量与棉花的抗旱性呈正相关关系。此外，超氧化物歧化酶(SOD)也是一类与植物抗旱性相关的重要渗透调节物质，在植物受胁迫时，可起到稳定生物大分子的结构和功能的作用。本研究创制的ScALDH21基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高超氧化物歧化酶的含量，对于增加棉花的抗旱性能有贡献。

⑧过氧化物酶(POD)活性变化

过氧化物酶活性变化结果见图11，结果表明：干旱胁迫前，转基因棉花过氧化物酶活性高于WT；自然干旱胁迫18天后，WT和转基因棉花的过氧化物酶活性都呈现上升趋势，但转基因植株过氧化物酶活性显著高于WT；复水24小时后，WT和转基因棉花过氧化物酶活性均出现下降，结果表明：在干旱胁迫发生的情况下，转ScALDH21基因棉花可在体内迅速积累过氧化物酶；

与超氧化物歧化酶(SOD)相同，过氧化物酶(POD)也是植物体内清除O^2-和H₂O₂的重要保护酶，POD的活性与含量与棉花的抗旱性呈正相关关系。通过过氧化物酶(POD)活性变化的检测，得到与超氧化物歧化酶(SOD)相类似的活性变化规律，进一步验证实验结果的准确性，同时也说明与清除氧自由基有关的代谢酶类在转ScALDH21基因棉花抗旱性能提高过程中发挥重要作用。

(3)转基因植株生物量及抗旱性形态指标测定

自然干旱18天处理棉花，棉花植株表现不同程度的萎蔫现象。WT植株呈现较严重的萎蔫现象，基部叶片变黄并部分脱落；转基因植株仅基部叶片出现萎蔫，上部叶片依然绿色并保持挺立。复水24小时后，WT和转基因植株叶片重新舒展。相比较而言，转基因棉花植株表现出受干旱胁迫影响较小，可见，在干旱胁迫处理下，转基因棉花植株表现出更强的抗旱性；

自然干旱处理棉花18天后，进行复水处理，并继续每周浇水2次保持土壤湿润，继续在原花盆中培养40天后，至棉花开花前测定它们的生物量指标以及抗旱性形态指标，如图13所示。结果表明，转基因植株的高度、叶片数、根长、茎干粗以及鲜重、干重生物量均高于非转基因的对照植株，并且侧根数量显著高于对照株。说明本研究创制的转ScALDH21基因棉花植株抵御干旱的能力得到增强，且相比对照植株，干旱胁迫下植株能够维持较高生物量。

Claims (4)

1.一种利用乙醛脱氢酶及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，其特征在于按下列步骤进行：

a、将从新疆极端耐旱藓类植物齿肋赤藓中克隆得到的齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ScALDH21通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株；

b、通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T₃代转基因植株；

c、转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用，根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并结合盆栽试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料，获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述齿肋赤藓乙醛脱氢酶ScALDH21基因的mRNA序列如Genebank号GQ245973所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述编码基因的DNA序列如Genebank号GQ245974所示。

4.根据权利要求书1所述的应用，其特征在于所述用于遗传转化的棉花品种为新农棉1号。

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