KR20020009551A - 핵산단편, 이를 이용한 재조합 벡터 및 이를 이용한구조유전자의 발현촉진방법 - Google Patents

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Abstract

하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과가 뛰어난 신규한 핵산 단편 및 이를 이용하여 그 하류의 구조유전자 발현을 촉진하는 방법이 개시되어 있다. 서열표의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 염기서열 내에서 하나 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나 상기 염기서열에 하나 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로, 그 하류에 치환된 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편을 제공한다.

Description

핵산단편, 이를 이용한 재조합 벡터 및 이를 이용한 구조유전자의 발현촉진방법{NUCLEIC ACID FRAGMENT, RECOMBINANT VECTOR CONTAINING THE SAME AND METHOD OF PROMOTING THE EXPRESSION OF STRUCTURAL GENE BY USING THE SAME}
외래 유전자의 발현촉진은, 유전자공학의 방법을 식물에 응용하는 경우에 가장 요구되어지는 기술이다. 상기 기술의 하나로 유전자 발현의 촉진효과를 가지는 DNA 단편을 이용하는 것이 있다. 외래 유전자의 발현을 촉진하는 DNA 단편으로는, 옥수수의 알콜디히드로게나아제(Callis 등, Gene & Development 1, 1183~1200(1987))로 시작하여, 몇개의 인트론이 알려져 있으며(Simpson과 Filipowicz 1996. Plant Mol. Biol. 32:1~41), 또한, 벼의 포스포리파아제 D(이하, 「PLD」라고 한다)의 제 1 인트론(국제공개 공보 WO96/30510)도 알려져 있다. 또한, 인트론 유래의 DNA 단편의 경우, 인트론의 내부 배열을 일부 삭제하거나, 또는 인트론의 내부에 동일한 인트론을 삽입하여 발현촉진작용에 미치는 영향을 조사한 사례가 보고되어 있다(Mascarenhas 등, Plant Mol. Biol. 15, 913~920(1990),Clancy 등, Plant Sci. 98, 151~161(1994)).
그렇지만, 현재로서 이용할 수 있는 DNA 단편의 종류는 제한되어 있으며, 각각의 DNA 단편의 작용이 식물의 종류에 따라 상이하거나, 동일한 식물에서까지도 기관과 조직에 따라 상이한(Simpson 과 Filipowica 1996, Plant Mol. Biol. 32:1~41) 등의 이유로 인하여, 여러 종류의 발현촉진작용을 가지는 DNA 단편의 존재가 요구되고 있다. 그리고, 종래의 DNA 단편에서는 발현촉진효과도 불충분한 경우가 많았기 때문에, 보다 효과가 큰 DNA 단편의 존재가 요구되고 있다.
본 발명은 하류에 치환된 구조 유전자의 발현을 촉진하는 기능을 가지는 핵산단편, 이를 포함한 재조합 벡터와 이를 이용한 구조유전자의 발현방법 및 상기 방법에 의해 원하는 구조유전자의 발현이 촉진된 식물에 관한 것이다.
발명의 개시
따라서, 본 발명의 목적은 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과가 뛰어난 신규한 핵산단편 및 이를 이용하여 그 하류의 구조 유전자의 발현을 촉진하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 예의 연구의 결과, 벼 PLD의 제 2 인트론이 뛰어난 유전자 발현촉진 효과를 가지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 염기서열 내에서 하나 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나 또는 상기 염기서열에서 하나 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 핵산단편과 엄격한 조건하에서 혼성화(hybridize)되는 핵산단편으로, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 상기 본 발명의 핵산단편과, 상기 핵산단편의 하류에 위치한 구조유전자를 포함하고, 상기 핵산단편에 의해 상기 구조유전자의 발현이 촉진되는 재조합 벡터를 제공한다. 그리고, 본 발명은 구조유전자의 상류에 상기 본 발명의 핵산단편을 삽입하므로써 이루어지는 구조유전자의 발현촉진방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 원하는 구조유전자의 발현이 촉진된 식물 또는 핵형질을 유지하는 그 자손을 제공한다.
본 발명에 의하여, 구조유전자의 발현촉진 효과가 뛰어난 신규한 핵산단편이 제공된다. 아래의 실시예로부터 명백하게 되는, 본 발명의 핵산단편은 그 하류의 구조유전자 발현촉진 효과가, 동일한 기능을 가지는 공지의 벼 PLD 제 1 인트론과 비교하여도 현저히 크다. 따라서, 본 발명의 핵산단편을 구조유전자의 상류에 삽입하는 것에 의하여, 상기 구조유전자의 발현이 대폭 촉진되기 때문에, 본 발명은 예로서, 재조합 벡터를 이용한 외래유전자의 발현을 크게 촉진할 수 있고, 유전자 공학의 분야 등에 있어서 크게 공헌할 것으로도 기대된다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
상기와 같이, 본 발명의 핵산단편은 서열목록의 서열번호 1에 나타난 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 염기서열 내 하나 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나 또는 상기 염기서열에서 하나 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산 단편으로, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편이다.
상기와 같이, 서열번호 1에 나타난 염기서열 내 하나 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나 또는 상기 염기서열에서 하나 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편(이하, 경구적 「수식(修飾)핵산단편」이라고 함)도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 경우, 수식핵산단편 중의 서열번호 1 기재의 배열에 대응하는 부분은, 서열번호 1에 기재된 배열과 70% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 염기서열의 상동성은 FASTA와 같은 주지의 컴퓨터 소프트 웨어를 사용하여 용이하게 산출할 수 있다. 또한, 이러한 수식핵산은 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산과, 엄격한 조건(즉, 5×Denhardt's 시약, 6×SSC, 0.5% SDS 또는 0.1% SDS가 존재하는 일반적인 혼성화 용액을 이용하여 50~65℃에서, 바람직하게는 50℃과 60℃의 두 단계, 또는, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃의 4단계에서 반응을 수행한다)에서 혼성화하는 것이 바람직하다.
또한, 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편의 일부에 있어서, 그 하류에 위치한 구조 유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 상기한 본 발명의 핵산단편을 복수연결한 것도, 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 경우, 본 발명의 핵산단편을 직접 연결하여도 좋으며, 그 사이에 다른 배열이 삽입되는 것도 양호하다.
본 발명의 핵산은 DNA나 RNA나 모두 바람직하지만, 안정성 관점에서 DNA가 바람직하다.
본 발명의 핵산단편은 본 발명에 의해 염기서열이 명백하게 되어지며, 또한, 벼의 게놈 유래이기 때문에, 벼의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR 등의 핵산증폭법에 의하여 용이하게 제조하는 것이 가능하다. PCR은 이 분야에 있어서 이미 잘 알려져 있으며, 이를 위한 키트 및 장치도 시판되어지고 있어 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 상기 수식핵산단편은, 이와같이 하여 얻어진 핵산단편을 주지의 부위특이적 변이법으로 부착시키므로써 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산단편을 복수연결하는 경우에는, 복수의 본 발명의 핵산단편을 미리 연결하는 것도 바람직하며, 본 발명의 핵산단편을 포함하는 영역에 본 발명의 핵산단편을 삽입하는 것도 바람직하다.
구조유전자의 상류에 상기한 본 발명의 핵산단편을 삽입하는 것에 의해, 상기 구조유전자의 발현을 촉진하는 것이 가능하다. 구조유전자는 그 상류에 위치하는 프로모터에 의해 제어되어지지만, 본 발명의 핵산 단편은 프로모터와 구조유전자의 사이에 삽입되거나 프로모터의 상류에 삽입되어도 좋으며, 프로모터와 구조유전자 사이에 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 핵산단편과 구조유전자의 거리는 0bp~1000bp가 바람직하며, 또한 프로모터와 본 발명의 핵산단편과의 거리도 0bp~1000bp가 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법을 발현벡터에 적용하여 얻어지는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 시판 발현벡터의 클로닝 부위에 본 발명의 핵산단편과 발현을 촉진하는 구조유전자를 삽입하는 것에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또, 이와 같은 발현벡터는 식물용 발현벡터가 바람직하며, 각종의것들이 이 분야에서 알려져 있으며, 또한 시판되고 있다. 이러한 발현벡터는 적어도 숙주세포 내에서 복제를 위한 복제개시점, 프로모터, 외래유전자를 삽입하기 위한 제한효소부위를 제공하는 클로닝 부위 및 약제내성 유전자 등의 선택마커를 포함하며, 통상 전사를 안정하게 완료시키는 터미네이터를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서, 이러한 공지의 발현벡터 중 어느 것도 채용할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 사용하여 식물을 통상적인 방법에 의해 형질전환하는 것에 의해, 원하는 구조 유전자의 발현이 촉진된 식물을 얻는 것이 가능하다. 식물의 형질전환 방법 자체는 이 분야에서 주지되어 있으며, 원형질체(protoplast)를 이용한 엘렉트로포레이션(electroporation)법과 아그로박테리움(agrobacterium)법 등의 주지의 방법에 의해 수행하는 것이 가능하다.
이하에서, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
벼 PLD 유전자의 제 2 인트론 및 양단의 엑손 37 염기 각각을 포함하는 DNA 단편(그 염기서열을 서열번호 2에 나타냄)을, 다음의 프라이머를 이용하여 공지의 벼 게놈 클론(WO95/0934의 서열번호 5)을 주형으로 사용하여 PCR로 증폭하였다.
5'-aagtcccccgggccgcgccagcggaag-3'
3'-gacacccacagccgtctatagttcgta-5'
얻은 PCR 증폭단편을 Sma I과 Eco RV로 소화시키고, 35S 프로모터의 하류에β-Glucuronidase(GUS) 유전자를 배치한 CLONTECH 사 제품인 벡터 pBI221의 Sma I부위에 삽입하였다. 이 조작에 의하여, 상기 증폭단편은 35S 프로모터와 GUS 유전자의 사이에 배치되었다. 일과적인 유전자 발현을 Sheen의 방법(Sheen 1991, Plant Cell 3: 225~245)에 의하여 연구하였다. 즉, 구축된 플라스미드를 옥수수의 에티오레이트된(ethiolated) 잎으로부터 분리된 원형질체에 엘렉트로포레이션에 의해 도입하고, GUS의 일과적인 발현을 상기 방법으로 측정하였다.
또한, 비교를 위하여, 벼 PLD 유전자의 제 1 인트론(서열목록의 서열번호 3에 나타냄)을 국제공개공보 WO96/30510에 기재된 방법과 같이 PCR로 증폭하고, 상기와 동일하게 pB1221의 Sma I 부위에 삽입하고, 옥수수에 도입하여 GUS의 발현을 이루었다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
이 결과로부터 명백하게 되듯이, 본 발명의 핵산단편은 그 하류의 구조 유전자의 발현촉진 효과가 동일한 기능을 가지는 공지의 벼 PLD 제 1 인트론과 비교하여도 현저하게 크다.

Claims (9)

  1. 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 염기서열 내 하나 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나 또는 상기 염기서열에 하나 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편.
  2. 제 1항에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산단편.
  3. 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 핵산단편과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산단편으로서, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편.
  4. 제 1항에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편 또는 상기 핵산단편의 일부로서, 그 하류에 위치한 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 가지는 핵산단편.
  5. 제 4항에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편.
  6. 제 1항에 있어서, 서열목록의 서열번호 2에 나타낸 염기서열을 가지는 핵산단편.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 핵산단편과, 상기 핵산단편의 하류에 위치한 구조유전자를 적어도 포함하고, 상기 핵산단편에 의해 상기 구조유전자의 발현이 촉진되는 재조합 벡터.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 상기 핵산단편을 삽입하므로써 이루어지는 구조유전자의 발현 촉진방법.
  9. 제 7항에 기재된 방법에 의해 원하는 구조유전자의 발현이 촉진된 식물 또는 상기 형질을 유지하는 그 자손.
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