JP3797674B2 - 遺伝子の発現調節ｄｎａ、発現カセット、発現ベクター及びトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
発明の属する技術分野
本発明は、植物の細胞内で遺伝子発現を調節する発現調節ＤＮＡ、特にオオムギＤホルデイン遺伝子由来の発現調節ＤＮＡに関する。
従来の技術
オオムギ（Hordeum vulgare）の種子には、種子において特異的に発現するタンパク質（種子貯蔵タンパク質）が多量に存在し、そのうちの３５〜５５％をアルコール可溶性のホルデインが占めている（Shewry,Barley:Chemistry and Technology.pp164:American Association of Cereal Chemists,Inc.、1993）。
このホルデインは、その遺伝子座およびアミノ酸組成等からＢ，Ｃ，Ｄ，γの４タイプに分類されている。このうちＢ、ＣおよびγホルデインについてはそのｃＤＮＡ及びゲノミックＤＮＡが単離され、これら構造遺伝子及びその発現調節ＤＮＡが明らかにされている。
一方、Ｄホルデインにおいては、翻訳領域を全て含むｃＤＮＡ（Hirota et al.,DDBJ,D82941,1996）が単離され、その構造解析が行われてはいるものの、ゲノミックＤＮＡに関しては、部分的な翻訳領域しか同定されておらず、また、遺伝子の発現に関与する５’上流領域も短いものであった（Sorensen et al.,Mol.Gen.Genet.,250,750-760,1996）。
しかし、前記５’上流領域は、実際ＤＮＡの塩基配列として４３６ ｂｐというように短い配列ではあるが、パーティクルボンバードメントに基づく定性的なプロモーター解析方法においては、プロモーター活性を有することが確認されている。
発明が解決しようとする課題
本願出願人らは、Ｄホルデイン遺伝子に関して鋭意研究を行った結果、Ｄホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域の上流に発現を制御する制御領域が存在することを見出した。
そこで、本発明は、Ｄホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域とこのプロモーター領域からの発現を制御する制御領域からなる発現調節ＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、この発現調節ＤＮＡを利用し発現調節ＤＮＡの調節下で所望の構造遺伝子を発現させるための発現カセット並びに発現ベクターを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入した新たな品種であるトランスジェニック植物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記の通り、本発明の遺伝子の発現調節ＤＮＡは、任意の構造遺伝子の発現を行わせるオオムギＤホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域と、前記プロモーター領域に基づいた前記構造遺伝子の発現を制御する制御領域と、を含むことを特徴とする。
上記構成によれば、前記オオムギＤホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域に任意の構造遺伝子を連結させることにより、連結された構造遺伝子の発現が前記制御領域により特異的に制御される。
前記制御領域は、好適には、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を活性化する活性化領域と、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を抑制する抑制領域と、から構成される。
すなわち、活性化領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させ、また、抑制領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に低減させる。
この特異性は、組織や成長時期（ステージ）などにより支配されており、活性化領域または抑制領域は、それぞれ適当な組織または成長時期などに応じて、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を上昇または低減させる。
例えば、前記オオムギＤホルデイン遺伝子は種子で多く発現していることから、前記発現調節ＤＮＡにおいて、前記活性化領域が種子において作用し前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させる。また、種子から次のステージに移行する過程で前記抑制領域により前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を低減させることができると考えられる。そのため、制御領域をオオムギＤホルデイン遺伝子の制御領域から構成することは、種子において前記構造遺伝子を特異的に発現させたい場合に有効となる。
また、上記のように制御領域を必ずしも活性化領域と抑制領域とから構成する必要はなく、目的に応じて前記制御領域を前記活性化領域のみから構成することもできる。その場合には、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現が常に高められた状態となるため、前記構造遺伝子の遺伝子産物を回収したい場合などにおいて有効な生産手段となる。
上記の発現調節ＤＮＡは、オオムギの染色体ＤＮＡ上のＤホルデイン遺伝子上流配列から得ることができる。
より具体的には、前記発現調節ＤＮＡは、好適には、配列番号１に記載された塩基配列から構成される。または、前記発現調節ＤＮＡは配列番号１に記載された塩基配列のうちプロモーター活性及び発現制御活性を有する一部の塩基配列から構成することもできる。さらには、前記発現調節ＤＮＡは配列番号１に記載された塩基配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性及び発現制御活性を有効に備えているものであれば、そのような塩基配列をも含まれる。
前記発現調節ＤＮＡのうちプロモーター領域は、好適には、配列番号１の１３０３から１７３９までの塩基配列から構成することができ、さらに好適には、１４４６から１７３９までの塩基配列から構成することができる。また、これらの配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性を有効に備えているものであれば、上記の塩基配列と実質的に同一である。
前記活性化領域は、少なくとも配列番号１における１０９６から１３０３に記載された塩基配列もしくは前記塩基配列のうち発現活性化能を有する一部の塩基配列を含む配列から構成することができる。従って、配列番号１における１０９６から１３０２に記載された塩基配列とその両側の領域とからなる発現活性化能を有する塩基配列から構成してもよい。
詳細には、配列番号１の１から１３０２を欠失させた１３０３から１７３９までの塩基配列では、連結させた構造遺伝子の発言を高めることができなかった。
一方、この配列番号１の１３０３から１７３９までの塩基配列にさらに１０９６から１３０２までの塩基配列を加えた１０９６から１７３９までの配列では、構造遺伝子の発現を高めることができた。
そのため、活性化領域は、配列番号１の１０９６から１３０２の全部もしくはその一部から構成することができる。または、前記活性化領域は配列番号１の１３０３以降にその一部が存在し、配列番号１の１０９６から１３０２の塩基配列又はその連続した一部を接続することにより残りの部分が連結されて、完全な活性化領域は形成されることも予想される。
従って、前記活性化領域は、少なくとも配列番号１の１０９６から１３０２までの塩基配列の一部を含み発現活性化能を有する塩基配列から構成することができる。なお、前記塩基配列と全く同一の配列でなくとも、発現活性化能を有効に備えた配列から構成することもできる。すなわち、前記塩基配列の一部に欠失、挿入または置換を有するものであっても発現活性化能を有効に備えていれば、実質的に本発明の塩基配列と同一である。
また、前記抑制領域は、配列番号１における１から１０９５に記載された塩基配列のうち発現抑制能を有する一部の塩基配列から構成することができる。
詳細には、前記プロモーター領域と活性化領域とを有する塩基配列（詳細には、配列番号１の１０９６から１７３９）にさらに配列番号１における１から１０９５までの塩基配列を接続することにより、前記プロモータ領域のみ存在する場合の発現レベルにまで抑制された。すなわち、活性化領域による発現の上昇を一定の条件の下に前記抑制領域は打ち消す作用を有している。
尚、上記の配列番号１における１から１０９５までの配列は抑制領域として十分な配列であり、例えば、この配列のうち発現抑制能を有する一部を使用することも、また、前記発現抑制能を有していれば、上記塩基配列と実質的に同一な塩基配列に置換して使用することもできる。
上記のような各領域の塩基配列は、オオムギのＤＮＡから好適に得ることができるが、ここに示した塩基配列に基づいてハイブリダイゼーション技術等によりオオムギ以外の植物から得ることも可能である。または、人工的に合成することもできる。さらに、ここで得られた塩基配列の一部を塩基置換などにより修飾した後に使用することも可能である。
上記発現調節ＤＮＡを好適に使用する場合には、前記発現調節ＤＮＡに任意の構造遺伝子を接続させた発現カセットとして使用することができる。
ここで生成された発現カセットを、直接任意の植物に導入し、染色体などに組み込みトランスジェニック植物を生成する目的で使用することができる。
または、発現カセットを任意のベクターに組み込み発現ベクターとして使用することもできる。ここで生成された発現ベクターは、植物に導入してトランスジェニック植物を作成する目的で使用することが可能であり、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの発現系等に使用することも可能である。
一方、ここで作成されたトランスジェニック植物内では、前記構造遺伝子が発現調節ＤＮＡによりその発現が調節される。前記植物としては、前記発現調節ＤＮＡが好適に機能する植物であればいかなるものでもよいが、好適にはオオムギである。
前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入する細胞としては、外来遺伝子である構造遺伝子の発現が特異的に上昇する登熟中の胚乳組織が好適であり、また、これ以外にも再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等も用いることができる。上記のように前記発現カセット、または前記発現ベクターを再分化能を有する植物細胞に導入することは、オオムギやその他の植物の種々の改良あるいは、種子での遺伝子産物の生成に有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本実施例の発現調節ＤＮＡの一部および既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域との相同性を示す。なお、シンボル（＊）は互いに相同な塩基配列を示す。
図２は、本実施例の発現調節ＤＮＡの一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域との塩基配列の比較結果を示す。
図３は、本実施例の発現調節ＤＮＡ、高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域及び既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域既知領域の制限酵素地図を比較した結果を示す。
図４は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）を作製する際の工程を示す。
図５は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）のＧＵＳ活性を示す。
図６は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）において、発現調節ＤＮＡを段階的に欠失させた際のＧＵＳ活性を比較した結果を示す。
発明の実施の形態
以下に本発明の好適な実施の形態を説明する。
１．発現調節ＤＮＡの単離
発現調節ＤＮＡはオオムギの染色体ＤＮＡ上のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域から単離することができる。この単離方法は、大別して、（１）オオムギ染色体ＤＮＡの調製工程、（２）クローニング工程及び（３）塩基配列決定工程から構成される。
（１）オオムギ染色体ＤＮＡの調製
オオムギ染色体ＤＮＡは、公知の方法で行うことができる。例えば「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、２５２頁（１９８９）等に記載の方法で行うことができる
（２）発現調節ＤＮＡの単離とクローニング
発現調節ＤＮＡの単離は、プロモーター活性が同定されている既知のＤホルデイン遺伝子５’上流領域（以下、既知領域）を用いて公知の方法により行うことができる。例えば「遺伝子工学製品ガイド１９９５−１９９６」、宝酒造株式会社、Ｆ−１６（１９９５）等の方法によりＰＣＲ法を用いて行うことができる。
上記の方法以外にも、従来の方法に従い染色体ライブラリーを作製後、Ｄホルデイン遺伝子と相同性を持つプローブを用いてスクリーニングすることによっても単離することができる。例えば、「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、１３４頁（１９８９）等に記載の方法で行うことができる。
また、本発明を実施するに当たり制限酵素消化、ＤＮＡ連結処理、大腸菌の形質転換など遺伝子クローニングに関わる操作が必要となるが、これは慣用技術によって行うことができる（MOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982)参照）。
（３）塩基配列の決定
上記において単離された発現調節ＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Gene,19,269(1982)）等により決定することができる。
尚、上記したオオムギから発現調節ＤＮＡを得る方法以外にも、上記において決定された塩基配列に基づき、サザンハイブリダイゼーション法を用いて他の植物から前記発現調節ＤＮＡまたはこれと実質的に同一なＤＮＡを回収することもできる。または、前記発現調節ＤＮＡは、上記の塩基配列に基づきＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成することもできる。
２．発現カセット及び発現ベクターの構築と細胞での発現
（１）発現カセットの作製
発現カセットは、前記発現調節ＤＮＡの下流に任意の構造遺伝子を接続し、さらに、前記構造遺伝子の下流にＮＯＳターミネーターなどの転写終結因子を連結することで作製できる。ここで、作製された発現カセットは、直鎖状のまま直接、植物の染色体に導入するか、後述する任意のプラスミドに組み込んで発現ベクターとして使用することができる。
（２）発現ベクターの作製
発現ベクターは、上述の通り、前記発現カセットを任意のプラスミドに挿入して作製することができる。または前記プラスミドに、発現調節ＤＮＡ、構造遺伝子、転写終結因子を順次連結させて作製することもできる。プラスミドとしては、例えばプラスミドｐＢＩ１０１（CLONTECH社製）など市販のものなどいかなるものを用いてもよいが使用目的に応じて選択することが好ましい。
例えば、前記発現ベクターを導入する生物に応じた複製開始点を有するプラスミドを選択することが好ましい。また、異なる生物間（例えば、大腸菌とオオムギなどの植物）の双方で複製させたい場合には、双方の複製開始点を有するシャトルベクターを使用することが好ましい。また、発現ベクターを大量に回収したときなどでは、コピー数の多いプラスミドを選択することが望ましい。
さらに、前記プラスミドとして、前記発現ベクターを生物等に導入する際の指標となる薬剤または栄養成分などに基づく選択マーカーが備えられているものを選択することができる。
尚、上記のような発現ベクターまたは発現カセットの作製は慣用技術により行うことができる（例えばMOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982)）。
（３）発現カセットまたは発現ベクターの植物への導入
前記発現カセットまたは発現ベクターを導入する細胞としては、登熟種子胚乳細胞等の植物細胞及び再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等が挙げられる。
導入方法としては、公知の方法を用いることができ（Plant Cell Reports, 10, 595 (1992)）具体的には、ポリエチレングリコール法の他に、エレクトロポレーション法（例えばNature, 319, 791 (1986)参照）、パーティクルガン法（例えばNature, 327, 70 (1987)参照）、レーザー穿孔法（例えばBarley Genetics VI, 231 (1991)参照）、アグロバクテリウム法（例えばPlant J., 6, 271 (1994)参照）などが挙げられる。
例えば、オオムギの登熟種子胚乳細胞に発現カセットまたは発現ベクターを導入する場合には、登熟種子胚乳細胞よりプロトプラストを調製し、ポリエチレングリコール法（例えばEMBO J., 3, 2717(1984)参照）などの公知の方法によって発現カセットまたは発現ベクターを導入することができる。
（４）トランスジェニック植物
上記のように外来ＤＮＡである発現カセットまたは発現ベクターを植物に導入することにより、トランスジェニック植物を創製することができる。このトランスジェニック植物は、天然の性質とは異なる性質を備えた新たな品種を形成する。
例えば、発現カセットまたは発現ベクター内の構造遺伝子が、植物の発生や成長に関与する遺伝子であれば、発芽や成長の調節を通じて、収穫期または収穫量の調節が可能となり、また、前記構造遺伝子が植物の構成成分に関与する遺伝子であれば、新たな品質の植物を得ることが可能となる。
実施例
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１． オオムギ染色体ＤＮＡの調製および制限酵素消化
試験圃場で育成したオオムギ（はるな二条）の緑葉を凍結乾燥後、染色体ＤＮＡを調製した。得られた全ＤＮＡ５μｇを５０ユニットの制限酵素ＰｓｔＩで完全消化した。このＤＮＡをエタノール沈殿後１０μｌの滅菌水に溶解した。
実施例２． アダプターＤＮＡの連結
ＰｓｔＩ消化したオオムギはるな二条ＤＮＡ２．５μｇとＰｓｔＩアダプター（宝酒造社製）５μｌをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃、３０分反応させ連結させた。連結したＤＮＡをエタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解し、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。
実施例３． Ｄホルデイン遺伝子特異的プライマーの合成
配列表２に示した配列をもとにＤホルデイン遺伝子５’末端近傍の以下に示す配列を持つプライマーＤＮＡを合成した。すなわち、これらプライマーＤＮＡは、５’-TCTCACGTTCAGCGGTGGTGAGAGCC-３’（プライマーＤＨＰ１）と、５’-GTTCCCATTGATCTCACGTTCAGCG-３’（プライマーＤＨＰ２）とである。
実施例４． Ｄホルデイン遺伝子５’上流領域のＰＣＲ法を用いた増幅
１回目の増幅は、実施例２で得た鋳型ＤＮＡを１．０μｌ、ＤＨＰ２プライマー（１００μＭ）を１．０μｌ、Ｃ１プライマー（宝酒造社製、１００μＭ）を１．０μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＮＴＰそれぞれ２．５ｍＭ）を４．０μｌ、マグネシウムを含む１０ｘＰＣＲ緩衝液（ベーリンガー社製）を５．０μｌ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity，ベーリンガー社製）を０．５μｌ、さらに滅菌水を３７．５μｌ加え反応液とした。反応は、サーマルコントローラー（MJ research社製）を用いて、最初の変性を９４℃で２分間行った後、６０℃で３０秒、６８℃で３分間、９４℃で１５秒間の反応を３０回繰り返し行った。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したが特異的なバンドは検出できなかった。
２回目の増幅は、鋳型ＤＮＡとして一回目の増幅産物を１．０μｌ，プライマーとしてＤＨＰ１プライマー（１００μＭ）を１．０μｌ、Ｃ２プライマー（宝酒造社製、１００μＭ）を１．０μｌに変更し一回目の反応と同様にして増幅を試みた。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したところ、約１．８Ｋｂの特異的に増幅されたバンドが検出された。
実施例５． ＰＣＲ増幅産物のクローニング
増幅産物をアガロース電気泳動後、１．８Ｋｂのバンドを切り出し、ガラスミルク法（バイオ１０１社製）により精製後、得られたＤＮＡ断片をブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した。この断片をクローニングベクターｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし、ＤＰＰ３クローンを得た。
実施例６． ＤＰＰ３クローンの構造解析
ＤＰＰ３クローンの構造解析は、ＤＮＡを両末端から欠失させて行うこととした。デリーションキット（宝酒造社製）の取扱説明書に従い約２００ｂｐ間隔の欠失ミュータントを両末端から作製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により構造解析した。
配列表の配列番号１に、決定されたＤホルデイン遺伝子の５’上流領域（ＤＰＰ３）の構造を示す。尚、この配列番号１に記載の塩基配列を以下、発現調節ＤＮＡという。
ここで得られた発現調節ＤＮＡは、配列番号２に示したＤホルデインのｃＤＮＡの５’末端領域と相同な配列を持つことから、得られたＤＮＡ断片が少なくともＤホルデインプロモーター領域を含んでいると考えられた。具体的には配列番号２には、Ｄホルデインの翻訳領域が含まれている。そして、この配列番号２において、翻訳開始を示すコドンＡＴＧ（３７番〜３９番に相当）の上流のプロモーター領域の一部（１番〜３６番）が、配列番号１の発現調節ＤＮＡのプロモーター領域の一部（１７０４番から１７３９番まで）と一致していた。
また前記発現調節ＤＮＡのプロモーター領域には、真核生物のプロモーター領域において広く存在するＴＡＴＡボックスが存在するほか、多くの種子貯蔵タンパク質のプロモーターに見られ登熟中種子での効果的な発現に必要とされるＧＣＮ４ボックス（GAGTCA）が確認された（配列表の配列番号１の１１５３番から１１５８番及び１１７４番から１１７９番）。
図１には、上記において得られた発現調節ＤＮＡの塩基配列番号の一部（上段）および既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域（以下、既知領域という）（下段）との相同性を示す。
ここで得られた発現調節ＤＮＡを既知のプロモーター領域の塩基配列を比較した。図２には、上記において得られた発現調節ＤＮＡの塩基配列の一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と比較した結果を示す。図２において、上段が発現調節ＤＮＡの一部（配列番号１２６１から１７３９）を示し、下段には既知の前記高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域を示す。
図３には、発現調節ＤＮＡ（Ａ）、既知領域（Ｂ）及び高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域（Ｃ）の制限酵素地図を比較した結果を示す。
実施例７． レポータープラスミド（発現ベクターの作製）
レポータープラスミドの作製の各工程を図４に模式的に示す。プラスミドｐＢＩ１０１（CLONTECH社製）のＧＵＳ遺伝子とＮＯＳターミネーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組み込みｐＢＩ１１とし、ネガティブコントロールとした（図４Ａ）。またポジティブコントロールとしてはイネやオオムギで構成的に発現するｐＡＣＴ１Ｆを用いた（図示せず）。
一方、目的の発現調節ＤＮＡ（ＤＰＰ３）を含むレポータープラスミドは、ＤＰＰ３の下流にＧＵＳ遺伝子およびＮＯＳターミネーターを連結した。具体的には、ＤＰＰ３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を欠失させて作製したプラスミドＤＰＰ３ＨＤをＢｐｕ１１０２Ｉで消化した。その後、平滑末端化し、さらにＥｃｏＲＩで消化した。この部位に、ｐＢＩ１０１のＧＵＳ遺伝子とＮＯＳターミネーターを含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を挿入して、プラスミドＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９とした。ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、欠失させたＨｉｎｄＩＩＩ断片を再び挿入することによりレポータープラスミド（ＤＰＰ３ＧＵＳ２）を作製した（図４Ｂ）。
実施例８．レポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２のプロモーター領域の欠失実施例７で得られたレポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２をデリーションキットを用いてプロモーターの５’末端より欠失させ、種々のレポータープラスミドを構築した。具体的には、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ３２は、配列番号１の２１９から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ１６は、配列番号１の１０９６から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４２は、配列番号１の１１９８から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９は、配列番号１の１３０３から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４７は、配列番号１の１４４６から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ２２は、配列番号１の１５２６から１７３９の塩基を含む配列を含む。
実施例９． 登熟種子胚乳細胞でのプロモーター活性の検出
単離されたＤホルデイン遺伝子のプロモーター領域の登熟種子胚乳細胞における活性は、実施例７において示されたレポータープラスミドを用いたトランジェントアッセイ系で確認した。
まず開花後１４日程度の大麦品種Bomiの登熟種子の穀皮を剥ぎ、７０％エタノールで１回、５倍希釈した次亜塩素酸で１回殺菌した後、水で３回洗浄した。胚乳を押し出し０．４％セルラーゼ、１１％マンニトールを含むＣＰＷ溶液（０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＫＮＯ3）で２５℃、一晩処理した。
得られたプロトプラストを１１％マンニトールを含むＣＰＷ溶液で洗った後、一形質転換系あたり１０6プロトプラストになるように分注した。分注後、それぞれにＤＮＡ ３０μｇ、Ｃ１００Ｓ溶液（７％ソルビトール，１００ｍＭ ＣａＣｌ2，４．７ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７））２００μｌを加えて懸濁し、４０％ポリエチレングリコール１５４０を含むＣ１００Ｓ溶液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを加えて、１０分間処理した。ＬＷ溶液（Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991)）１０ｍｌを加えて遠心し、沈殿にＬ１培地（Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991)）３ｍｌを加えて、２５℃で一晩培養した。培養液にＬＷ溶液２０ｍｌを加えて遠心し、沈殿をＧＵＳ抽出溶液（０．０５Ｍ ＮａＰＯ4，０．０１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％サルコシル，０．１％トリトンＸ−１００，０．１％ ２−メルカプトエタノール）２００μｌに懸濁して凍結融解を２回繰り返した。その後、遠心分離を行い、遠心上清をプロモーター活性測定のための粗酵素液として使用した。すなわち、得られた粗酵素液を４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドと反応させた後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で反応を止め、４−メチルウンベリフェリルの生成を測定し、プロモーター活性とした。またタンパク質の定量は、バイオラッド社の“プロテインアッセイ”を用いて行なった。
各区のＧＵＳ活性を図５に示す。図５より単離されたＤホルデインプロモーター領域を含むレポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２を導入した大麦登熟種子胚乳細胞区は、ｐＡＣＴ１Ｆを導入した区と比較して約１．５倍のＧＵＳ活性を示した。このことから、前記発現調節ＤＮＡはプロモーター活性を持っていることが確認された。
実施例１０． 登熟種子胚乳細胞での欠失プロモーターの活性検出
実施例９に示した方法と同様に、実施例８で得られた各欠失レポータープラスミドをオオムギの登熟種子胚乳細胞に導入しＧＵＳ活性を測定した。各区のＧＵＳ活性を図６に示す。図６から明らかなように、短いプロモーター領域しか含まないＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ２２ではほとんど活性が認められないが、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４７，ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９とプロモーターが長くなるほどＧＵＳ活性は増加した。さらに、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４２でいったんＧＵＳ活性が低下した後、再びＧＵＳ活性が増加し、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ１６で最も高い活性を示した。しかしながら、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ３２及び全長のプロモーターを含むＤＰＰ３ＧＵＳ２ではまた活性が抑えられていた。
一般にプロモーターは、生体内において、遺伝子の発現量を組織や時期、栄養状態などの植物体の状況等により調節されている。すなわち、プロモータには、制御領域が備えられ、単に発現量を増加させるだけではなく、ある状況下に置かれたときには遺伝子発現を抑制し、植物体にとって調和のとれた発現が実行されている。この点から、上述したＧＵＳ活性の結果及び開花後１４日目の胚乳組織におけるＤホルデインプロモーターの活性を分析すると、配列番号１の１３０３から１７３９の塩基配列内（ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９）にＤホルデイン遺伝子の発現を促進する領域（活性領域）が、そして配列番号１の１から１１０３の塩基配列内にＤホルデイン遺伝子の発現を抑制的に調節している領域（抑制領域）が存在していることは明らかである。このことは、これらの各領域が連結することにより生体内でのＤホルデインの調節のとれた効果的な発現が可能となることを示している。
発明の効果
本発明により、Ｄホルデイン遺伝子の発現調節ＤＮＡの塩基配列および登熟種子中での効果的な転写調節が明らかとなった。この発現調節ＤＮＡに適当な外来の構造遺伝子および転写終結因子を連結した発現カセットまたは、これをプラスミドに組み込んだ発現ベクターとして、オオムギもしくはその他の植物に導入する。ここで導入された植物では、オオムギもしくはその他の植物の種子を意図的に改良されたトランスジェニック植物が生成され、または種子において遺伝子産物を生産させるための道具として用いることにより、所望のトランスジェニック植物を創製することができる。
従って、上記の発現調節ＤＮＡは、植物の品種改良または品質の向上を通じて、植物育種の分野に貢献する。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１７３９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：
配列番号：２
配列の長さ：２２９６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：
本発明は、植物の細胞内で遺伝子発現を調節する発現調節ＤＮＡ、特にオオムギＤホルデイン遺伝子由来の発現調節ＤＮＡに関する。
従来の技術
オオムギ（Hordeum vulgare）の種子には、種子において特異的に発現するタンパク質（種子貯蔵タンパク質）が多量に存在し、そのうちの３５〜５５％をアルコール可溶性のホルデインが占めている（Shewry,Barley:Chemistry and Technology.pp164:American Association of Cereal Chemists,Inc.、1993）。
このホルデインは、その遺伝子座およびアミノ酸組成等からＢ，Ｃ，Ｄ，γの４タイプに分類されている。このうちＢ、ＣおよびγホルデインについてはそのｃＤＮＡ及びゲノミックＤＮＡが単離され、これら構造遺伝子及びその発現調節ＤＮＡが明らかにされている。
一方、Ｄホルデインにおいては、翻訳領域を全て含むｃＤＮＡ（Hirota et al.,DDBJ,D82941,1996）が単離され、その構造解析が行われてはいるものの、ゲノミックＤＮＡに関しては、部分的な翻訳領域しか同定されておらず、また、遺伝子の発現に関与する５’上流領域も短いものであった（Sorensen et al.,Mol.Gen.Genet.,250,750-760,1996）。
しかし、前記５’上流領域は、実際ＤＮＡの塩基配列として４３６ ｂｐというように短い配列ではあるが、パーティクルボンバードメントに基づく定性的なプロモーター解析方法においては、プロモーター活性を有することが確認されている。
発明が解決しようとする課題
本願出願人らは、Ｄホルデイン遺伝子に関して鋭意研究を行った結果、Ｄホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域の上流に発現を制御する制御領域が存在することを見出した。
そこで、本発明は、Ｄホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域とこのプロモーター領域からの発現を制御する制御領域からなる発現調節ＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、この発現調節ＤＮＡを利用し発現調節ＤＮＡの調節下で所望の構造遺伝子を発現させるための発現カセット並びに発現ベクターを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入した新たな品種であるトランスジェニック植物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記の通り、本発明の遺伝子の発現調節ＤＮＡは、任意の構造遺伝子の発現を行わせるオオムギＤホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域と、前記プロモーター領域に基づいた前記構造遺伝子の発現を制御する制御領域と、を含むことを特徴とする。
上記構成によれば、前記オオムギＤホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域に任意の構造遺伝子を連結させることにより、連結された構造遺伝子の発現が前記制御領域により特異的に制御される。
前記制御領域は、好適には、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を活性化する活性化領域と、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を抑制する抑制領域と、から構成される。
すなわち、活性化領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させ、また、抑制領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に低減させる。
この特異性は、組織や成長時期（ステージ）などにより支配されており、活性化領域または抑制領域は、それぞれ適当な組織または成長時期などに応じて、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を上昇または低減させる。
例えば、前記オオムギＤホルデイン遺伝子は種子で多く発現していることから、前記発現調節ＤＮＡにおいて、前記活性化領域が種子において作用し前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させる。また、種子から次のステージに移行する過程で前記抑制領域により前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を低減させることができると考えられる。そのため、制御領域をオオムギＤホルデイン遺伝子の制御領域から構成することは、種子において前記構造遺伝子を特異的に発現させたい場合に有効となる。
また、上記のように制御領域を必ずしも活性化領域と抑制領域とから構成する必要はなく、目的に応じて前記制御領域を前記活性化領域のみから構成することもできる。その場合には、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現が常に高められた状態となるため、前記構造遺伝子の遺伝子産物を回収したい場合などにおいて有効な生産手段となる。
上記の発現調節ＤＮＡは、オオムギの染色体ＤＮＡ上のＤホルデイン遺伝子上流配列から得ることができる。
より具体的には、前記発現調節ＤＮＡは、好適には、配列番号１に記載された塩基配列から構成される。または、前記発現調節ＤＮＡは配列番号１に記載された塩基配列のうちプロモーター活性及び発現制御活性を有する一部の塩基配列から構成することもできる。さらには、前記発現調節ＤＮＡは配列番号１に記載された塩基配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性及び発現制御活性を有効に備えているものであれば、そのような塩基配列をも含まれる。
前記発現調節ＤＮＡのうちプロモーター領域は、好適には、配列番号１の１３０３から１７３９までの塩基配列から構成することができ、さらに好適には、１４４６から１７３９までの塩基配列から構成することができる。また、これらの配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性を有効に備えているものであれば、上記の塩基配列と実質的に同一である。
前記活性化領域は、少なくとも配列番号１における１０９６から１３０３に記載された塩基配列もしくは前記塩基配列のうち発現活性化能を有する一部の塩基配列を含む配列から構成することができる。従って、配列番号１における１０９６から１３０２に記載された塩基配列とその両側の領域とからなる発現活性化能を有する塩基配列から構成してもよい。
詳細には、配列番号１の１から１３０２を欠失させた１３０３から１７３９までの塩基配列では、連結させた構造遺伝子の発言を高めることができなかった。
一方、この配列番号１の１３０３から１７３９までの塩基配列にさらに１０９６から１３０２までの塩基配列を加えた１０９６から１７３９までの配列では、構造遺伝子の発現を高めることができた。
そのため、活性化領域は、配列番号１の１０９６から１３０２の全部もしくはその一部から構成することができる。または、前記活性化領域は配列番号１の１３０３以降にその一部が存在し、配列番号１の１０９６から１３０２の塩基配列又はその連続した一部を接続することにより残りの部分が連結されて、完全な活性化領域は形成されることも予想される。
従って、前記活性化領域は、少なくとも配列番号１の１０９６から１３０２までの塩基配列の一部を含み発現活性化能を有する塩基配列から構成することができる。なお、前記塩基配列と全く同一の配列でなくとも、発現活性化能を有効に備えた配列から構成することもできる。すなわち、前記塩基配列の一部に欠失、挿入または置換を有するものであっても発現活性化能を有効に備えていれば、実質的に本発明の塩基配列と同一である。
また、前記抑制領域は、配列番号１における１から１０９５に記載された塩基配列のうち発現抑制能を有する一部の塩基配列から構成することができる。
詳細には、前記プロモーター領域と活性化領域とを有する塩基配列（詳細には、配列番号１の１０９６から１７３９）にさらに配列番号１における１から１０９５までの塩基配列を接続することにより、前記プロモータ領域のみ存在する場合の発現レベルにまで抑制された。すなわち、活性化領域による発現の上昇を一定の条件の下に前記抑制領域は打ち消す作用を有している。
尚、上記の配列番号１における１から１０９５までの配列は抑制領域として十分な配列であり、例えば、この配列のうち発現抑制能を有する一部を使用することも、また、前記発現抑制能を有していれば、上記塩基配列と実質的に同一な塩基配列に置換して使用することもできる。
上記のような各領域の塩基配列は、オオムギのＤＮＡから好適に得ることができるが、ここに示した塩基配列に基づいてハイブリダイゼーション技術等によりオオムギ以外の植物から得ることも可能である。または、人工的に合成することもできる。さらに、ここで得られた塩基配列の一部を塩基置換などにより修飾した後に使用することも可能である。
上記発現調節ＤＮＡを好適に使用する場合には、前記発現調節ＤＮＡに任意の構造遺伝子を接続させた発現カセットとして使用することができる。
ここで生成された発現カセットを、直接任意の植物に導入し、染色体などに組み込みトランスジェニック植物を生成する目的で使用することができる。
または、発現カセットを任意のベクターに組み込み発現ベクターとして使用することもできる。ここで生成された発現ベクターは、植物に導入してトランスジェニック植物を作成する目的で使用することが可能であり、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの発現系等に使用することも可能である。
一方、ここで作成されたトランスジェニック植物内では、前記構造遺伝子が発現調節ＤＮＡによりその発現が調節される。前記植物としては、前記発現調節ＤＮＡが好適に機能する植物であればいかなるものでもよいが、好適にはオオムギである。
前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入する細胞としては、外来遺伝子である構造遺伝子の発現が特異的に上昇する登熟中の胚乳組織が好適であり、また、これ以外にも再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等も用いることができる。上記のように前記発現カセット、または前記発現ベクターを再分化能を有する植物細胞に導入することは、オオムギやその他の植物の種々の改良あるいは、種子での遺伝子産物の生成に有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本実施例の発現調節ＤＮＡの一部および既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域との相同性を示す。なお、シンボル（＊）は互いに相同な塩基配列を示す。
図２は、本実施例の発現調節ＤＮＡの一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域との塩基配列の比較結果を示す。
図３は、本実施例の発現調節ＤＮＡ、高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域及び既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域既知領域の制限酵素地図を比較した結果を示す。
図４は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）を作製する際の工程を示す。
図５は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）のＧＵＳ活性を示す。
図６は、本実施例の発現ベクター（レポータープラスミド）において、発現調節ＤＮＡを段階的に欠失させた際のＧＵＳ活性を比較した結果を示す。
発明の実施の形態
以下に本発明の好適な実施の形態を説明する。
１．発現調節ＤＮＡの単離
発現調節ＤＮＡはオオムギの染色体ＤＮＡ上のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域から単離することができる。この単離方法は、大別して、（１）オオムギ染色体ＤＮＡの調製工程、（２）クローニング工程及び（３）塩基配列決定工程から構成される。
（１）オオムギ染色体ＤＮＡの調製
オオムギ染色体ＤＮＡは、公知の方法で行うことができる。例えば「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、２５２頁（１９８９）等に記載の方法で行うことができる
（２）発現調節ＤＮＡの単離とクローニング
発現調節ＤＮＡの単離は、プロモーター活性が同定されている既知のＤホルデイン遺伝子５’上流領域（以下、既知領域）を用いて公知の方法により行うことができる。例えば「遺伝子工学製品ガイド１９９５−１９９６」、宝酒造株式会社、Ｆ−１６（１９９５）等の方法によりＰＣＲ法を用いて行うことができる。
上記の方法以外にも、従来の方法に従い染色体ライブラリーを作製後、Ｄホルデイン遺伝子と相同性を持つプローブを用いてスクリーニングすることによっても単離することができる。例えば、「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、１３４頁（１９８９）等に記載の方法で行うことができる。
また、本発明を実施するに当たり制限酵素消化、ＤＮＡ連結処理、大腸菌の形質転換など遺伝子クローニングに関わる操作が必要となるが、これは慣用技術によって行うことができる（MOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982)参照）。
（３）塩基配列の決定
上記において単離された発現調節ＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Gene,19,269(1982)）等により決定することができる。
尚、上記したオオムギから発現調節ＤＮＡを得る方法以外にも、上記において決定された塩基配列に基づき、サザンハイブリダイゼーション法を用いて他の植物から前記発現調節ＤＮＡまたはこれと実質的に同一なＤＮＡを回収することもできる。または、前記発現調節ＤＮＡは、上記の塩基配列に基づきＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成することもできる。
２．発現カセット及び発現ベクターの構築と細胞での発現
（１）発現カセットの作製
発現カセットは、前記発現調節ＤＮＡの下流に任意の構造遺伝子を接続し、さらに、前記構造遺伝子の下流にＮＯＳターミネーターなどの転写終結因子を連結することで作製できる。ここで、作製された発現カセットは、直鎖状のまま直接、植物の染色体に導入するか、後述する任意のプラスミドに組み込んで発現ベクターとして使用することができる。
（２）発現ベクターの作製
発現ベクターは、上述の通り、前記発現カセットを任意のプラスミドに挿入して作製することができる。または前記プラスミドに、発現調節ＤＮＡ、構造遺伝子、転写終結因子を順次連結させて作製することもできる。プラスミドとしては、例えばプラスミドｐＢＩ１０１（CLONTECH社製）など市販のものなどいかなるものを用いてもよいが使用目的に応じて選択することが好ましい。
例えば、前記発現ベクターを導入する生物に応じた複製開始点を有するプラスミドを選択することが好ましい。また、異なる生物間（例えば、大腸菌とオオムギなどの植物）の双方で複製させたい場合には、双方の複製開始点を有するシャトルベクターを使用することが好ましい。また、発現ベクターを大量に回収したときなどでは、コピー数の多いプラスミドを選択することが望ましい。
さらに、前記プラスミドとして、前記発現ベクターを生物等に導入する際の指標となる薬剤または栄養成分などに基づく選択マーカーが備えられているものを選択することができる。
尚、上記のような発現ベクターまたは発現カセットの作製は慣用技術により行うことができる（例えばMOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982)）。
（３）発現カセットまたは発現ベクターの植物への導入
前記発現カセットまたは発現ベクターを導入する細胞としては、登熟種子胚乳細胞等の植物細胞及び再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等が挙げられる。
導入方法としては、公知の方法を用いることができ（Plant Cell Reports, 10, 595 (1992)）具体的には、ポリエチレングリコール法の他に、エレクトロポレーション法（例えばNature, 319, 791 (1986)参照）、パーティクルガン法（例えばNature, 327, 70 (1987)参照）、レーザー穿孔法（例えばBarley Genetics VI, 231 (1991)参照）、アグロバクテリウム法（例えばPlant J., 6, 271 (1994)参照）などが挙げられる。
例えば、オオムギの登熟種子胚乳細胞に発現カセットまたは発現ベクターを導入する場合には、登熟種子胚乳細胞よりプロトプラストを調製し、ポリエチレングリコール法（例えばEMBO J., 3, 2717(1984)参照）などの公知の方法によって発現カセットまたは発現ベクターを導入することができる。
（４）トランスジェニック植物
上記のように外来ＤＮＡである発現カセットまたは発現ベクターを植物に導入することにより、トランスジェニック植物を創製することができる。このトランスジェニック植物は、天然の性質とは異なる性質を備えた新たな品種を形成する。
例えば、発現カセットまたは発現ベクター内の構造遺伝子が、植物の発生や成長に関与する遺伝子であれば、発芽や成長の調節を通じて、収穫期または収穫量の調節が可能となり、また、前記構造遺伝子が植物の構成成分に関与する遺伝子であれば、新たな品質の植物を得ることが可能となる。
実施例
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１． オオムギ染色体ＤＮＡの調製および制限酵素消化
試験圃場で育成したオオムギ（はるな二条）の緑葉を凍結乾燥後、染色体ＤＮＡを調製した。得られた全ＤＮＡ５μｇを５０ユニットの制限酵素ＰｓｔＩで完全消化した。このＤＮＡをエタノール沈殿後１０μｌの滅菌水に溶解した。
実施例２． アダプターＤＮＡの連結
ＰｓｔＩ消化したオオムギはるな二条ＤＮＡ２．５μｇとＰｓｔＩアダプター（宝酒造社製）５μｌをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃、３０分反応させ連結させた。連結したＤＮＡをエタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解し、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。
実施例３． Ｄホルデイン遺伝子特異的プライマーの合成
配列表２に示した配列をもとにＤホルデイン遺伝子５’末端近傍の以下に示す配列を持つプライマーＤＮＡを合成した。すなわち、これらプライマーＤＮＡは、５’-TCTCACGTTCAGCGGTGGTGAGAGCC-３’（プライマーＤＨＰ１）と、５’-GTTCCCATTGATCTCACGTTCAGCG-３’（プライマーＤＨＰ２）とである。
実施例４． Ｄホルデイン遺伝子５’上流領域のＰＣＲ法を用いた増幅
１回目の増幅は、実施例２で得た鋳型ＤＮＡを１．０μｌ、ＤＨＰ２プライマー（１００μＭ）を１．０μｌ、Ｃ１プライマー（宝酒造社製、１００μＭ）を１．０μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＮＴＰそれぞれ２．５ｍＭ）を４．０μｌ、マグネシウムを含む１０ｘＰＣＲ緩衝液（ベーリンガー社製）を５．０μｌ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity，ベーリンガー社製）を０．５μｌ、さらに滅菌水を３７．５μｌ加え反応液とした。反応は、サーマルコントローラー（MJ research社製）を用いて、最初の変性を９４℃で２分間行った後、６０℃で３０秒、６８℃で３分間、９４℃で１５秒間の反応を３０回繰り返し行った。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したが特異的なバンドは検出できなかった。
２回目の増幅は、鋳型ＤＮＡとして一回目の増幅産物を１．０μｌ，プライマーとしてＤＨＰ１プライマー（１００μＭ）を１．０μｌ、Ｃ２プライマー（宝酒造社製、１００μＭ）を１．０μｌに変更し一回目の反応と同様にして増幅を試みた。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したところ、約１．８Ｋｂの特異的に増幅されたバンドが検出された。
実施例５． ＰＣＲ増幅産物のクローニング
増幅産物をアガロース電気泳動後、１．８Ｋｂのバンドを切り出し、ガラスミルク法（バイオ１０１社製）により精製後、得られたＤＮＡ断片をブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した。この断片をクローニングベクターｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし、ＤＰＰ３クローンを得た。
実施例６． ＤＰＰ３クローンの構造解析
ＤＰＰ３クローンの構造解析は、ＤＮＡを両末端から欠失させて行うこととした。デリーションキット（宝酒造社製）の取扱説明書に従い約２００ｂｐ間隔の欠失ミュータントを両末端から作製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により構造解析した。
配列表の配列番号１に、決定されたＤホルデイン遺伝子の５’上流領域（ＤＰＰ３）の構造を示す。尚、この配列番号１に記載の塩基配列を以下、発現調節ＤＮＡという。
ここで得られた発現調節ＤＮＡは、配列番号２に示したＤホルデインのｃＤＮＡの５’末端領域と相同な配列を持つことから、得られたＤＮＡ断片が少なくともＤホルデインプロモーター領域を含んでいると考えられた。具体的には配列番号２には、Ｄホルデインの翻訳領域が含まれている。そして、この配列番号２において、翻訳開始を示すコドンＡＴＧ（３７番〜３９番に相当）の上流のプロモーター領域の一部（１番〜３６番）が、配列番号１の発現調節ＤＮＡのプロモーター領域の一部（１７０４番から１７３９番まで）と一致していた。
また前記発現調節ＤＮＡのプロモーター領域には、真核生物のプロモーター領域において広く存在するＴＡＴＡボックスが存在するほか、多くの種子貯蔵タンパク質のプロモーターに見られ登熟中種子での効果的な発現に必要とされるＧＣＮ４ボックス（GAGTCA）が確認された（配列表の配列番号１の１１５３番から１１５８番及び１１７４番から１１７９番）。
図１には、上記において得られた発現調節ＤＮＡの塩基配列番号の一部（上段）および既報のＤホルデイン遺伝子の５’上流領域（以下、既知領域という）（下段）との相同性を示す。
ここで得られた発現調節ＤＮＡを既知のプロモーター領域の塩基配列を比較した。図２には、上記において得られた発現調節ＤＮＡの塩基配列の一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と比較した結果を示す。図２において、上段が発現調節ＤＮＡの一部（配列番号１２６１から１７３９）を示し、下段には既知の前記高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域を示す。
図３には、発現調節ＤＮＡ（Ａ）、既知領域（Ｂ）及び高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域（Ｃ）の制限酵素地図を比較した結果を示す。
実施例７． レポータープラスミド（発現ベクターの作製）
レポータープラスミドの作製の各工程を図４に模式的に示す。プラスミドｐＢＩ１０１（CLONTECH社製）のＧＵＳ遺伝子とＮＯＳターミネーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組み込みｐＢＩ１１とし、ネガティブコントロールとした（図４Ａ）。またポジティブコントロールとしてはイネやオオムギで構成的に発現するｐＡＣＴ１Ｆを用いた（図示せず）。
一方、目的の発現調節ＤＮＡ（ＤＰＰ３）を含むレポータープラスミドは、ＤＰＰ３の下流にＧＵＳ遺伝子およびＮＯＳターミネーターを連結した。具体的には、ＤＰＰ３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を欠失させて作製したプラスミドＤＰＰ３ＨＤをＢｐｕ１１０２Ｉで消化した。その後、平滑末端化し、さらにＥｃｏＲＩで消化した。この部位に、ｐＢＩ１０１のＧＵＳ遺伝子とＮＯＳターミネーターを含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を挿入して、プラスミドＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９とした。ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、欠失させたＨｉｎｄＩＩＩ断片を再び挿入することによりレポータープラスミド（ＤＰＰ３ＧＵＳ２）を作製した（図４Ｂ）。
実施例８．レポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２のプロモーター領域の欠失実施例７で得られたレポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２をデリーションキットを用いてプロモーターの５’末端より欠失させ、種々のレポータープラスミドを構築した。具体的には、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ３２は、配列番号１の２１９から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ１６は、配列番号１の１０９６から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４２は、配列番号１の１１９８から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９は、配列番号１の１３０３から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４７は、配列番号１の１４４６から１７３９の塩基配列を含む。ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ２２は、配列番号１の１５２６から１７３９の塩基を含む配列を含む。
実施例９． 登熟種子胚乳細胞でのプロモーター活性の検出
単離されたＤホルデイン遺伝子のプロモーター領域の登熟種子胚乳細胞における活性は、実施例７において示されたレポータープラスミドを用いたトランジェントアッセイ系で確認した。
まず開花後１４日程度の大麦品種Bomiの登熟種子の穀皮を剥ぎ、７０％エタノールで１回、５倍希釈した次亜塩素酸で１回殺菌した後、水で３回洗浄した。胚乳を押し出し０．４％セルラーゼ、１１％マンニトールを含むＣＰＷ溶液（０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＫＮＯ3）で２５℃、一晩処理した。
得られたプロトプラストを１１％マンニトールを含むＣＰＷ溶液で洗った後、一形質転換系あたり１０6プロトプラストになるように分注した。分注後、それぞれにＤＮＡ ３０μｇ、Ｃ１００Ｓ溶液（７％ソルビトール，１００ｍＭ ＣａＣｌ2，４．７ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７））２００μｌを加えて懸濁し、４０％ポリエチレングリコール１５４０を含むＣ１００Ｓ溶液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを加えて、１０分間処理した。ＬＷ溶液（Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991)）１０ｍｌを加えて遠心し、沈殿にＬ１培地（Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991)）３ｍｌを加えて、２５℃で一晩培養した。培養液にＬＷ溶液２０ｍｌを加えて遠心し、沈殿をＧＵＳ抽出溶液（０．０５Ｍ ＮａＰＯ4，０．０１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％サルコシル，０．１％トリトンＸ−１００，０．１％ ２−メルカプトエタノール）２００μｌに懸濁して凍結融解を２回繰り返した。その後、遠心分離を行い、遠心上清をプロモーター活性測定のための粗酵素液として使用した。すなわち、得られた粗酵素液を４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドと反応させた後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で反応を止め、４−メチルウンベリフェリルの生成を測定し、プロモーター活性とした。またタンパク質の定量は、バイオラッド社の“プロテインアッセイ”を用いて行なった。
各区のＧＵＳ活性を図５に示す。図５より単離されたＤホルデインプロモーター領域を含むレポータープラスミドＤＰＰ３ＧＵＳ２を導入した大麦登熟種子胚乳細胞区は、ｐＡＣＴ１Ｆを導入した区と比較して約１．５倍のＧＵＳ活性を示した。このことから、前記発現調節ＤＮＡはプロモーター活性を持っていることが確認された。
実施例１０． 登熟種子胚乳細胞での欠失プロモーターの活性検出
実施例９に示した方法と同様に、実施例８で得られた各欠失レポータープラスミドをオオムギの登熟種子胚乳細胞に導入しＧＵＳ活性を測定した。各区のＧＵＳ活性を図６に示す。図６から明らかなように、短いプロモーター領域しか含まないＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ２２ではほとんど活性が認められないが、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４７，ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９とプロモーターが長くなるほどＧＵＳ活性は増加した。さらに、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ４２でいったんＧＵＳ活性が低下した後、再びＧＵＳ活性が増加し、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ１６で最も高い活性を示した。しかしながら、ＤＰＰ３ＧＵＳ２Δ３２及び全長のプロモーターを含むＤＰＰ３ＧＵＳ２ではまた活性が抑えられていた。
一般にプロモーターは、生体内において、遺伝子の発現量を組織や時期、栄養状態などの植物体の状況等により調節されている。すなわち、プロモータには、制御領域が備えられ、単に発現量を増加させるだけではなく、ある状況下に置かれたときには遺伝子発現を抑制し、植物体にとって調和のとれた発現が実行されている。この点から、上述したＧＵＳ活性の結果及び開花後１４日目の胚乳組織におけるＤホルデインプロモーターの活性を分析すると、配列番号１の１３０３から１７３９の塩基配列内（ＤＰＰ３ＨＤＧＵＳ９）にＤホルデイン遺伝子の発現を促進する領域（活性領域）が、そして配列番号１の１から１１０３の塩基配列内にＤホルデイン遺伝子の発現を抑制的に調節している領域（抑制領域）が存在していることは明らかである。このことは、これらの各領域が連結することにより生体内でのＤホルデインの調節のとれた効果的な発現が可能となることを示している。
発明の効果
本発明により、Ｄホルデイン遺伝子の発現調節ＤＮＡの塩基配列および登熟種子中での効果的な転写調節が明らかとなった。この発現調節ＤＮＡに適当な外来の構造遺伝子および転写終結因子を連結した発現カセットまたは、これをプラスミドに組み込んだ発現ベクターとして、オオムギもしくはその他の植物に導入する。ここで導入された植物では、オオムギもしくはその他の植物の種子を意図的に改良されたトランスジェニック植物が生成され、または種子において遺伝子産物を生産させるための道具として用いることにより、所望のトランスジェニック植物を創製することができる。
従って、上記の発現調節ＤＮＡは、植物の品種改良または品質の向上を通じて、植物育種の分野に貢献する。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１７３９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：
配列の長さ：２２９６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：
Claims (1)
- 構造遺伝子の発現を調節するＤＮＡであって、
（１）配列番号１の１３０３から１７３９までの塩基配列からなる、オオムギＤ−ホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域と、
（２）（ａ）配列番号１の１０９６から１３０２までの塩基配列を含む活性化領域と、
を有し、前記プロモータ領域と前記制御領域とは作動可能連結され、さらに、前記構造遺伝子と作動可能に連結させた際に構造遺伝子の発現を調節することを特徴とするＤＮＡ。
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