JP3797674B2 - 遺伝子の発現調節dna、発現カセット、発現ベクター及びトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
本発明は、植物の細胞内で遺伝子発現を調節する発現調節DNA、特にオオムギDホルデイン遺伝子由来の発現調節DNAに関する。
従来の技術
オオムギ(Hordeum vulgare)の種子には、種子において特異的に発現するタンパク質(種子貯蔵タンパク質)が多量に存在し、そのうちの35〜55%をアルコール可溶性のホルデインが占めている(Shewry,Barley:Chemistry and Technology.pp164:American Association of Cereal Chemists,Inc.、1993)。
このホルデインは、その遺伝子座およびアミノ酸組成等からB,C,D,γの4タイプに分類されている。このうちB、CおよびγホルデインについてはそのcDNA及びゲノミックDNAが単離され、これら構造遺伝子及びその発現調節DNAが明らかにされている。
一方、Dホルデインにおいては、翻訳領域を全て含むcDNA(Hirota et al.,DDBJ,D82941,1996)が単離され、その構造解析が行われてはいるものの、ゲノミックDNAに関しては、部分的な翻訳領域しか同定されておらず、また、遺伝子の発現に関与する5’上流領域も短いものであった(Sorensen et al.,Mol.Gen.Genet.,250,750-760,1996)。
しかし、前記5’上流領域は、実際DNAの塩基配列として436 bpというように短い配列ではあるが、パーティクルボンバードメントに基づく定性的なプロモーター解析方法においては、プロモーター活性を有することが確認されている。
発明が解決しようとする課題
本願出願人らは、Dホルデイン遺伝子に関して鋭意研究を行った結果、Dホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域の上流に発現を制御する制御領域が存在することを見出した。
そこで、本発明は、Dホルデイン遺伝子の発現を実行させるプロモーター領域とこのプロモーター領域からの発現を制御する制御領域からなる発現調節DNAを提供することを目的とする。また、本発明は、この発現調節DNAを利用し発現調節DNAの調節下で所望の構造遺伝子を発現させるための発現カセット並びに発現ベクターを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入した新たな品種であるトランスジェニック植物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記の通り、本発明の遺伝子の発現調節DNAは、任意の構造遺伝子の発現を行わせるオオムギDホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域と、前記プロモーター領域に基づいた前記構造遺伝子の発現を制御する制御領域と、を含むことを特徴とする。
上記構成によれば、前記オオムギDホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域に任意の構造遺伝子を連結させることにより、連結された構造遺伝子の発現が前記制御領域により特異的に制御される。
前記制御領域は、好適には、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を活性化する活性化領域と、前記プロモーター領域に基づく前記構造遺伝子の発現を抑制する抑制領域と、から構成される。
すなわち、活性化領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させ、また、抑制領域は前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に低減させる。
この特異性は、組織や成長時期(ステージ)などにより支配されており、活性化領域または抑制領域は、それぞれ適当な組織または成長時期などに応じて、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を上昇または低減させる。
例えば、前記オオムギDホルデイン遺伝子は種子で多く発現していることから、前記発現調節DNAにおいて、前記活性化領域が種子において作用し前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を特異的に上昇させる。また、種子から次のステージに移行する過程で前記抑制領域により前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現を低減させることができると考えられる。そのため、制御領域をオオムギDホルデイン遺伝子の制御領域から構成することは、種子において前記構造遺伝子を特異的に発現させたい場合に有効となる。
また、上記のように制御領域を必ずしも活性化領域と抑制領域とから構成する必要はなく、目的に応じて前記制御領域を前記活性化領域のみから構成することもできる。その場合には、前記プロモーター領域に連結された構造遺伝子の発現が常に高められた状態となるため、前記構造遺伝子の遺伝子産物を回収したい場合などにおいて有効な生産手段となる。
上記の発現調節DNAは、オオムギの染色体DNA上のDホルデイン遺伝子上流配列から得ることができる。
より具体的には、前記発現調節DNAは、好適には、配列番号1に記載された塩基配列から構成される。または、前記発現調節DNAは配列番号1に記載された塩基配列のうちプロモーター活性及び発現制御活性を有する一部の塩基配列から構成することもできる。さらには、前記発現調節DNAは配列番号1に記載された塩基配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性及び発現制御活性を有効に備えているものであれば、そのような塩基配列をも含まれる。
前記発現調節DNAのうちプロモーター領域は、好適には、配列番号1の1303から1739までの塩基配列から構成することができ、さらに好適には、1446から1739までの塩基配列から構成することができる。また、これらの配列上に欠失、挿入、置換などを有するものであっても、前記プロモーター活性を有効に備えているものであれば、上記の塩基配列と実質的に同一である。
前記活性化領域は、少なくとも配列番号1における1096から1303に記載された塩基配列もしくは前記塩基配列のうち発現活性化能を有する一部の塩基配列を含む配列から構成することができる。従って、配列番号1における1096から1302に記載された塩基配列とその両側の領域とからなる発現活性化能を有する塩基配列から構成してもよい。
詳細には、配列番号1の1から1302を欠失させた1303から1739までの塩基配列では、連結させた構造遺伝子の発言を高めることができなかった。
一方、この配列番号1の1303から1739までの塩基配列にさらに1096から1302までの塩基配列を加えた1096から1739までの配列では、構造遺伝子の発現を高めることができた。
そのため、活性化領域は、配列番号1の1096から1302の全部もしくはその一部から構成することができる。または、前記活性化領域は配列番号1の1303以降にその一部が存在し、配列番号1の1096から1302の塩基配列又はその連続した一部を接続することにより残りの部分が連結されて、完全な活性化領域は形成されることも予想される。
従って、前記活性化領域は、少なくとも配列番号1の1096から1302までの塩基配列の一部を含み発現活性化能を有する塩基配列から構成することができる。なお、前記塩基配列と全く同一の配列でなくとも、発現活性化能を有効に備えた配列から構成することもできる。すなわち、前記塩基配列の一部に欠失、挿入または置換を有するものであっても発現活性化能を有効に備えていれば、実質的に本発明の塩基配列と同一である。
また、前記抑制領域は、配列番号1における1から1095に記載された塩基配列のうち発現抑制能を有する一部の塩基配列から構成することができる。
詳細には、前記プロモーター領域と活性化領域とを有する塩基配列(詳細には、配列番号1の1096から1739)にさらに配列番号1における1から1095までの塩基配列を接続することにより、前記プロモータ領域のみ存在する場合の発現レベルにまで抑制された。すなわち、活性化領域による発現の上昇を一定の条件の下に前記抑制領域は打ち消す作用を有している。
尚、上記の配列番号1における1から1095までの配列は抑制領域として十分な配列であり、例えば、この配列のうち発現抑制能を有する一部を使用することも、また、前記発現抑制能を有していれば、上記塩基配列と実質的に同一な塩基配列に置換して使用することもできる。
上記のような各領域の塩基配列は、オオムギのDNAから好適に得ることができるが、ここに示した塩基配列に基づいてハイブリダイゼーション技術等によりオオムギ以外の植物から得ることも可能である。または、人工的に合成することもできる。さらに、ここで得られた塩基配列の一部を塩基置換などにより修飾した後に使用することも可能である。
上記発現調節DNAを好適に使用する場合には、前記発現調節DNAに任意の構造遺伝子を接続させた発現カセットとして使用することができる。
ここで生成された発現カセットを、直接任意の植物に導入し、染色体などに組み込みトランスジェニック植物を生成する目的で使用することができる。
または、発現カセットを任意のベクターに組み込み発現ベクターとして使用することもできる。ここで生成された発現ベクターは、植物に導入してトランスジェニック植物を作成する目的で使用することが可能であり、また、in vitroの発現系等に使用することも可能である。
一方、ここで作成されたトランスジェニック植物内では、前記構造遺伝子が発現調節DNAによりその発現が調節される。前記植物としては、前記発現調節DNAが好適に機能する植物であればいかなるものでもよいが、好適にはオオムギである。
前記発現カセットまたは前記発現ベクターを導入する細胞としては、外来遺伝子である構造遺伝子の発現が特異的に上昇する登熟中の胚乳組織が好適であり、また、これ以外にも再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等も用いることができる。上記のように前記発現カセット、または前記発現ベクターを再分化能を有する植物細胞に導入することは、オオムギやその他の植物の種々の改良あるいは、種子での遺伝子産物の生成に有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
図1は、本実施例の発現調節DNAの一部および既報のDホルデイン遺伝子の5’上流領域との相同性を示す。なお、シンボル(*)は互いに相同な塩基配列を示す。
図2は、本実施例の発現調節DNAの一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域との塩基配列の比較結果を示す。
図3は、本実施例の発現調節DNA、高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域及び既報のDホルデイン遺伝子の5’上流領域既知領域の制限酵素地図を比較した結果を示す。
図4は、本実施例の発現ベクター(レポータープラスミド)を作製する際の工程を示す。
図5は、本実施例の発現ベクター(レポータープラスミド)のGUS活性を示す。
図6は、本実施例の発現ベクター(レポータープラスミド)において、発現調節DNAを段階的に欠失させた際のGUS活性を比較した結果を示す。
発明の実施の形態
以下に本発明の好適な実施の形態を説明する。
1.発現調節DNAの単離
発現調節DNAはオオムギの染色体DNA上のDホルデイン遺伝子の5’上流領域から単離することができる。この単離方法は、大別して、(1)オオムギ染色体DNAの調製工程、(2)クローニング工程及び(3)塩基配列決定工程から構成される。
(1)オオムギ染色体DNAの調製
オオムギ染色体DNAは、公知の方法で行うことができる。例えば「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、252頁(1989)等に記載の方法で行うことができる
(2)発現調節DNAの単離とクローニング
発現調節DNAの単離は、プロモーター活性が同定されている既知のDホルデイン遺伝子5’上流領域(以下、既知領域)を用いて公知の方法により行うことができる。例えば「遺伝子工学製品ガイド1995−1996」、宝酒造株式会社、F−16(1995)等の方法によりPCR法を用いて行うことができる。
上記の方法以外にも、従来の方法に従い染色体ライブラリーを作製後、Dホルデイン遺伝子と相同性を持つプローブを用いてスクリーニングすることによっても単離することができる。例えば、「クローニングとシーケンス−植物バイオテクノロジー実験マニュアル」、農村文化社、134頁(1989)等に記載の方法で行うことができる。
また、本発明を実施するに当たり制限酵素消化、DNA連結処理、大腸菌の形質転換など遺伝子クローニングに関わる操作が必要となるが、これは慣用技術によって行うことができる(MOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982)参照)。
(3)塩基配列の決定
上記において単離された発現調節DNAの塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法(Methods in Enzymology,65,499(1980))やジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Gene,19,269(1982))等により決定することができる。
尚、上記したオオムギから発現調節DNAを得る方法以外にも、上記において決定された塩基配列に基づき、サザンハイブリダイゼーション法を用いて他の植物から前記発現調節DNAまたはこれと実質的に同一なDNAを回収することもできる。または、前記発現調節DNAは、上記の塩基配列に基づきDNA合成機などを用いて人工的に合成することもできる。
2.発現カセット及び発現ベクターの構築と細胞での発現
(1)発現カセットの作製
発現カセットは、前記発現調節DNAの下流に任意の構造遺伝子を接続し、さらに、前記構造遺伝子の下流にNOSターミネーターなどの転写終結因子を連結することで作製できる。ここで、作製された発現カセットは、直鎖状のまま直接、植物の染色体に導入するか、後述する任意のプラスミドに組み込んで発現ベクターとして使用することができる。
(2)発現ベクターの作製
発現ベクターは、上述の通り、前記発現カセットを任意のプラスミドに挿入して作製することができる。または前記プラスミドに、発現調節DNA、構造遺伝子、転写終結因子を順次連結させて作製することもできる。プラスミドとしては、例えばプラスミドpBI101(CLONTECH社製)など市販のものなどいかなるものを用いてもよいが使用目的に応じて選択することが好ましい。
例えば、前記発現ベクターを導入する生物に応じた複製開始点を有するプラスミドを選択することが好ましい。また、異なる生物間(例えば、大腸菌とオオムギなどの植物)の双方で複製させたい場合には、双方の複製開始点を有するシャトルベクターを使用することが好ましい。また、発現ベクターを大量に回収したときなどでは、コピー数の多いプラスミドを選択することが望ましい。
さらに、前記プラスミドとして、前記発現ベクターを生物等に導入する際の指標となる薬剤または栄養成分などに基づく選択マーカーが備えられているものを選択することができる。
尚、上記のような発現ベクターまたは発現カセットの作製は慣用技術により行うことができる(例えばMOLECULAR CLONING MANUAL COLD SPRINGHARBOR LABORATORY (1982))。
(3)発現カセットまたは発現ベクターの植物への導入
前記発現カセットまたは発現ベクターを導入する細胞としては、登熟種子胚乳細胞等の植物細胞及び再分化能を有する植物細胞、例えば、葯由来細胞、未熟胚由来細胞等が挙げられる。
導入方法としては、公知の方法を用いることができ(Plant Cell Reports, 10, 595 (1992))具体的には、ポリエチレングリコール法の他に、エレクトロポレーション法(例えばNature, 319, 791 (1986)参照)、パーティクルガン法(例えばNature, 327, 70 (1987)参照)、レーザー穿孔法(例えばBarley Genetics VI, 231 (1991)参照)、アグロバクテリウム法(例えばPlant J., 6, 271 (1994)参照)などが挙げられる。
例えば、オオムギの登熟種子胚乳細胞に発現カセットまたは発現ベクターを導入する場合には、登熟種子胚乳細胞よりプロトプラストを調製し、ポリエチレングリコール法(例えばEMBO J., 3, 2717(1984)参照)などの公知の方法によって発現カセットまたは発現ベクターを導入することができる。
(4)トランスジェニック植物
上記のように外来DNAである発現カセットまたは発現ベクターを植物に導入することにより、トランスジェニック植物を創製することができる。このトランスジェニック植物は、天然の性質とは異なる性質を備えた新たな品種を形成する。
例えば、発現カセットまたは発現ベクター内の構造遺伝子が、植物の発生や成長に関与する遺伝子であれば、発芽や成長の調節を通じて、収穫期または収穫量の調節が可能となり、また、前記構造遺伝子が植物の構成成分に関与する遺伝子であれば、新たな品質の植物を得ることが可能となる。
実施例
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1. オオムギ染色体DNAの調製および制限酵素消化
試験圃場で育成したオオムギ(はるな二条)の緑葉を凍結乾燥後、染色体DNAを調製した。得られた全DNA5μgを50ユニットの制限酵素PstIで完全消化した。このDNAをエタノール沈殿後10μlの滅菌水に溶解した。
実施例2. アダプターDNAの連結
PstI消化したオオムギはるな二条DNA2.5μgとPstIアダプター(宝酒造社製)5μlをライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて16℃、30分反応させ連結させた。連結したDNAをエタノール沈殿後、5μlの滅菌水に溶解し、PCR法の鋳型DNAとした。
実施例3. Dホルデイン遺伝子特異的プライマーの合成
配列表2に示した配列をもとにDホルデイン遺伝子5’末端近傍の以下に示す配列を持つプライマーDNAを合成した。すなわち、これらプライマーDNAは、5’-TCTCACGTTCAGCGGTGGTGAGAGCC-3’(プライマーDHP1)と、5’-GTTCCCATTGATCTCACGTTCAGCG-3’(プライマーDHP2)とである。
実施例4. Dホルデイン遺伝子5’上流領域のPCR法を用いた増幅
1回目の増幅は、実施例2で得た鋳型DNAを1.0μl、DHP2プライマー(100μM)を1.0μl、C1プライマー(宝酒造社製、100μM)を1.0μl、dNTP混合溶液(dNTPそれぞれ2.5mM)を4.0μl、マグネシウムを含む10xPCR緩衝液(ベーリンガー社製)を5.0μl、耐熱性DNAポリメラーゼ(Expand High Fidelity,ベーリンガー社製)を0.5μl、さらに滅菌水を37.5μl加え反応液とした。反応は、サーマルコントローラー(MJ research社製)を用いて、最初の変性を94℃で2分間行った後、60℃で30秒、68℃で3分間、94℃で15秒間の反応を30回繰り返し行った。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したが特異的なバンドは検出できなかった。
2回目の増幅は、鋳型DNAとして一回目の増幅産物を1.0μl,プライマーとしてDHP1プライマー(100μM)を1.0μl、C2プライマー(宝酒造社製、100μM)を1.0μlに変更し一回目の反応と同様にして増幅を試みた。ここで得られた増幅産物をアガロース電気泳動によって分析したところ、約1.8Kbの特異的に増幅されたバンドが検出された。
実施例5. PCR増幅産物のクローニング
増幅産物をアガロース電気泳動後、1.8Kbのバンドを切り出し、ガラスミルク法(バイオ101社製)により精製後、得られたDNA断片をブランティングキット(宝酒造社製)を用いて平滑末端化した。この断片をクローニングベクターpUC118のHincII部位にクローニングし、DPP3クローンを得た。
実施例6. DPP3クローンの構造解析
DPP3クローンの構造解析は、DNAを両末端から欠失させて行うこととした。デリーションキット(宝酒造社製)の取扱説明書に従い約200bp間隔の欠失ミュータントを両末端から作製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により構造解析した。
配列表の配列番号1に、決定されたDホルデイン遺伝子の5’上流領域(DPP3)の構造を示す。尚、この配列番号1に記載の塩基配列を以下、発現調節DNAという。
ここで得られた発現調節DNAは、配列番号2に示したDホルデインのcDNAの5’末端領域と相同な配列を持つことから、得られたDNA断片が少なくともDホルデインプロモーター領域を含んでいると考えられた。具体的には配列番号2には、Dホルデインの翻訳領域が含まれている。そして、この配列番号2において、翻訳開始を示すコドンATG(37番〜39番に相当)の上流のプロモーター領域の一部(1番〜36番)が、配列番号1の発現調節DNAのプロモーター領域の一部(1704番から1739番まで)と一致していた。
また前記発現調節DNAのプロモーター領域には、真核生物のプロモーター領域において広く存在するTATAボックスが存在するほか、多くの種子貯蔵タンパク質のプロモーターに見られ登熟中種子での効果的な発現に必要とされるGCN4ボックス(GAGTCA)が確認された(配列表の配列番号1の1153番から1158番及び1174番から1179番)。
図1には、上記において得られた発現調節DNAの塩基配列番号の一部(上段)および既報のDホルデイン遺伝子の5’上流領域(以下、既知領域という)(下段)との相同性を示す。
ここで得られた発現調節DNAを既知のプロモーター領域の塩基配列を比較した。図2には、上記において得られた発現調節DNAの塩基配列の一部とコムギの高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と比較した結果を示す。図2において、上段が発現調節DNAの一部(配列番号1261から1739)を示し、下段には既知の前記高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域を示す。
図3には、発現調節DNA(A)、既知領域(B)及び高分子グルテニン遺伝子のプロモーター領域(C)の制限酵素地図を比較した結果を示す。
実施例7. レポータープラスミド(発現ベクターの作製)
レポータープラスミドの作製の各工程を図4に模式的に示す。プラスミドpBI101(CLONTECH社製)のGUS遺伝子とNOSターミネーターを含むHindIII−EcoRI断片をプラスミドpUC118のHindIII、EcoRI部位に組み込みpBI11とし、ネガティブコントロールとした(図4A)。またポジティブコントロールとしてはイネやオオムギで構成的に発現するpACT1Fを用いた(図示せず)。
一方、目的の発現調節DNA(DPP3)を含むレポータープラスミドは、DPP3の下流にGUS遺伝子およびNOSターミネーターを連結した。具体的には、DPP3のHindIII断片を欠失させて作製したプラスミドDPP3HDをBpu1102Iで消化した。その後、平滑末端化し、さらにEcoRIで消化した。この部位に、pBI101のGUS遺伝子とNOSターミネーターを含むSmaI−EcoRI断片を挿入して、プラスミドDPP3HDGUS9とした。DPP3HDGUS9のHindIII部位に、欠失させたHindIII断片を再び挿入することによりレポータープラスミド(DPP3GUS2)を作製した(図4B)。
実施例8.レポータープラスミドDPP3GUS2のプロモーター領域の欠失実施例7で得られたレポータープラスミドDPP3GUS2をデリーションキットを用いてプロモーターの5’末端より欠失させ、種々のレポータープラスミドを構築した。具体的には、DPP3GUS2Δ32は、配列番号1の219から1739の塩基配列を含む。DPP3GUS2Δ16は、配列番号1の1096から1739の塩基配列を含む。DPP3GUS2Δ42は、配列番号1の1198から1739の塩基配列を含む。DPP3HDGUS9は、配列番号1の1303から1739の塩基配列を含む。DPP3GUS2Δ47は、配列番号1の1446から1739の塩基配列を含む。DPP3GUS2Δ22は、配列番号1の1526から1739の塩基を含む配列を含む。
実施例9. 登熟種子胚乳細胞でのプロモーター活性の検出
単離されたDホルデイン遺伝子のプロモーター領域の登熟種子胚乳細胞における活性は、実施例7において示されたレポータープラスミドを用いたトランジェントアッセイ系で確認した。
まず開花後14日程度の大麦品種Bomiの登熟種子の穀皮を剥ぎ、70%エタノールで1回、5倍希釈した次亜塩素酸で1回殺菌した後、水で3回洗浄した。胚乳を押し出し0.4%セルラーゼ、11%マンニトールを含むCPW溶液(0.2mM KH2PO4,10mM CaCl2,1mM MgSO4,1mM KNO3)で25℃、一晩処理した。
得られたプロトプラストを11%マンニトールを含むCPW溶液で洗った後、一形質転換系あたり106プロトプラストになるように分注した。分注後、それぞれにDNA 30μg、C100S溶液(7%ソルビトール,100mM CaCl2,4.7mM MES(pH5.7))200μlを加えて懸濁し、40%ポリエチレングリコール1540を含むC100S溶液(pH7.0)0.5mlを加えて、10分間処理した。LW溶液(Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991))10mlを加えて遠心し、沈殿にL1培地(Theor. Appl. Genet. 81: 437 (1991))3mlを加えて、25℃で一晩培養した。培養液にLW溶液20mlを加えて遠心し、沈殿をGUS抽出溶液(0.05M NaPO4,0.01M EDTA,0.1%サルコシル,0.1%トリトンX−100,0.1% 2−メルカプトエタノール)200μlに懸濁して凍結融解を2回繰り返した。その後、遠心分離を行い、遠心上清をプロモーター活性測定のための粗酵素液として使用した。すなわち、得られた粗酵素液を4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニドと反応させた後、0.2M炭酸ナトリウム溶液で反応を止め、4−メチルウンベリフェリルの生成を測定し、プロモーター活性とした。またタンパク質の定量は、バイオラッド社の“プロテインアッセイ”を用いて行なった。
各区のGUS活性を図5に示す。図5より単離されたDホルデインプロモーター領域を含むレポータープラスミドDPP3GUS2を導入した大麦登熟種子胚乳細胞区は、pACT1Fを導入した区と比較して約1.5倍のGUS活性を示した。このことから、前記発現調節DNAはプロモーター活性を持っていることが確認された。
実施例10. 登熟種子胚乳細胞での欠失プロモーターの活性検出
実施例9に示した方法と同様に、実施例8で得られた各欠失レポータープラスミドをオオムギの登熟種子胚乳細胞に導入しGUS活性を測定した。各区のGUS活性を図6に示す。図6から明らかなように、短いプロモーター領域しか含まないDPP3GUS2Δ22ではほとんど活性が認められないが、DPP3GUS2Δ47,DPP3HDGUS9とプロモーターが長くなるほどGUS活性は増加した。さらに、DPP3GUS2Δ42でいったんGUS活性が低下した後、再びGUS活性が増加し、DPP3GUS2Δ16で最も高い活性を示した。しかしながら、DPP3GUS2Δ32及び全長のプロモーターを含むDPP3GUS2ではまた活性が抑えられていた。
一般にプロモーターは、生体内において、遺伝子の発現量を組織や時期、栄養状態などの植物体の状況等により調節されている。すなわち、プロモータには、制御領域が備えられ、単に発現量を増加させるだけではなく、ある状況下に置かれたときには遺伝子発現を抑制し、植物体にとって調和のとれた発現が実行されている。この点から、上述したGUS活性の結果及び開花後14日目の胚乳組織におけるDホルデインプロモーターの活性を分析すると、配列番号1の1303から1739の塩基配列内(DPP3HDGUS9)にDホルデイン遺伝子の発現を促進する領域(活性領域)が、そして配列番号1の1から1103の塩基配列内にDホルデイン遺伝子の発現を抑制的に調節している領域(抑制領域)が存在していることは明らかである。このことは、これらの各領域が連結することにより生体内でのDホルデインの調節のとれた効果的な発現が可能となることを示している。
発明の効果
本発明により、Dホルデイン遺伝子の発現調節DNAの塩基配列および登熟種子中での効果的な転写調節が明らかとなった。この発現調節DNAに適当な外来の構造遺伝子および転写終結因子を連結した発現カセットまたは、これをプラスミドに組み込んだ発現ベクターとして、オオムギもしくはその他の植物に導入する。ここで導入された植物では、オオムギもしくはその他の植物の種子を意図的に改良されたトランスジェニック植物が生成され、または種子において遺伝子産物を生産させるための道具として用いることにより、所望のトランスジェニック植物を創製することができる。
従って、上記の発現調節DNAは、植物の品種改良または品質の向上を通じて、植物育種の分野に貢献する。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:1739
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA
配列:
配列番号:2
配列の長さ:2296
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA
配列:
Claims (1)
- 構造遺伝子の発現を調節するDNAであって、
(1)配列番号1の1303から1739までの塩基配列からなる、オオムギD−ホルデイン遺伝子由来のプロモーター領域と、
(2)(a)配列番号1の1096から1302までの塩基配列を含む活性化領域と、
を有し、前記プロモータ領域と前記制御領域とは作動可能連結され、さらに、前記構造遺伝子と作動可能に連結させた際に構造遺伝子の発現を調節することを特徴とするDNA。
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