ES2645298T3 - ADN recombinante para supresión génica - Google Patents

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Shihshieh Huang
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Abstract

Una construcción de ADN recombinante para la supresión de al menos un gen diana de planta nativa que comprende en orden 5' a 3' un elemento promotor unido de manera operable a un primer elemento de ADN orientado antisentido en relación con el al menos un gen diana y un segundo elemento de ADN orientado sentido en relación con el al menos un gen diana que comprende 50 a 5.000 nucleótidos, en la que el elemento de ADN orientado sentido no es más de aproximadamente la mitad de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido, y el ARN orientado sentido transcrito por el ADN orientado sentido es complementario al extremo más 5' del ARN orientado antisentido transcrito por el elemento de ADN orientado antisentido, en la que dicho ARN transcrito forma un bucle de ARN orientado antisentido para suprimir dicho al menos un gen diana, y en la que dicho elemento de ADN orientado antisentido comprende, en serie, segmentos de dos o más genes dirigidos para supresión.

Description

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DESCRIPCION
ADN recombinante para supresion genica Campo de la invencion
En el presente documento se describen construcciones de ADN recombinante para producir bucles de supresion genica de ARN antisentido y procedimientos de produccion y uso de tales construcciones y plantas transgenicas que expresan bucles de supresion genica de ARN antisentido.
Antecedentes
Ciertas plantas tienen niveles bajos de aminoacidos espedficos en comparacion con otras plantas, por ejemplo, el mafz tiene bajo niveles de lisina, metionina y triptofano. Intentos para incrementar los niveles de aminoacidos en plantas transgenicas incluyen expresar ADN recombinante que codifica protemas en una ruta de smtesis de aminoacidos a niveles mayores que los genes nativos. Uno tal gen para producir niveles aumentados de lisina en mafz es una acido dihidropicolmico sintasa bacteriana. Un concepto para niveles incluso mas aumentados de aminoacidos incluye la supresion de genes que codifican protemas en las rutas catabolicas de aminoacidos.
La supresion genica incluye cualquiera de los procedimientos bien conocidos para la supresion de la transcripcion de un gen o la acumulacion del ARNm correspondiente a ese gen previniendo de ese modo la traduccion del transcrito en protema. Mas particularmente, la supresion genica mediada por insercion de una construccion de ADN recombinante con ADN orientado antisentido para regular la expresion genica en celulas vegetales esta descrita en el documento de patente americana 5.107.065 (Shewmaker y col.) y el documento de patente americana 5.759.829 (Shewmaker y col.). Las plantas transformadas usando tales construcciones de ADN orientado antisentido para la supresion genica pueden comprender ADN integrado colocado como una repeticion invertida que resulto de la insercion conjunta de diversas copias del ADN de transferencia (ADN-T) en plantas mediante transformacion mediada por Agrobacterium, como es descrito por Redenbaugh y col. en “Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr Savr™ Tomato”, CRC Press, Inc. (1992). Las inserciones de repeticion invertida pueden comprender una parte o todo el ADN-T, por ejemplo, contener una repeticion invertida de una construccion antisentido completa o parcial. El cribado para el ADN insertado que comprende elementos de repeticion invertida puede mejorar la eficiencia de identificacion de eventos de transformacion eficaces para el silenciamiento genico cuando la construccion de transformacion es una construccion de ADN antisentido simple.
La supresion genica desencadenada mediante la insercion de una construccion de ADN recombinante con ADN orientado sentido para regular la expresion genica en plantas esta descrita en el documento de patente americana 5.283.184 (Jorgensen y col.) y el documento de patente americana 5.231.020 (Jorgensen y col.). El ADN-T insertado que proporciona la supresion genica en plantas transformadas con tales construcciones sentido por Agrobacterium se organiza en su mayona en estructuras de repeticion invertida, como es descrito por Jorgensen y col., Mol. Gen. Genet., 207:471-477 (1987). Vease tambien Stam y col., The Plant Journal, 12:63-82 (1997) y De Buck y col., Plant Mol. Biol. 46:433-445 (2001), quienes usaron estudios de segregacion para apoyar el descubrimiento de Jorgensen de que en muchos eventos el silenciamiento genico esta mediado por ADN-T transgenico multimerico donde los ADN-T se colocan en repeticiones invertidas. El cribado para ADN insertado que comprende los elementos de repeticion invertida puede mejorar la eficacia del silenciamiento genico cuando se transforma con construcciones simples de ADN orientada sentido.
El silenciamiento genico tambien puede estar afectado por la transcripcion de ARN a partir de tanto un ADN orientado sentido como antisentido usando dos unidades de transcripcion separadas, por ejemplo, como se describe por Shewmaker y col. en el documento de patente americana 5.107.065 en el que en el Ejemplo 1 se preparo un vector binario con genes aroA tanto sentido como antisentido. Construcciones similares se describen en la Publicacion Internacional N° WO 99/53050 (Waterhouse y col.). Vease tambien el documento de patente americana 6.326.193 en el que el ADN dirigido de gen se une de manera operable a promotores opuestos.
La supresion genica se puede conseguir en plantas proporcionando construcciones de transformacion que son capaces de generar un aRn que pueden forma ARN de doble cadena a lo largo de al menos parte de su longitud. La supresion genica en plantas esta descrita en el documento EP 0426195 A1 (Goldbach y col.) en el que las construcciones de ADN recombinante para la transcripcion en ARN horquilla proporcionaban plantas transgenicas con resistencia al virus del broceado del tabaco. Vease tambien Sijen y col., The Plant Cell, Vol. 8, 2.277-2.294 (1996) que describe el uso de construcciones que portan repeticiones invertidas (sentido seguido de antisentido) de un gen del virus del mosaico del frijol en plantas transgenicas para mediar la resistencia a virus. Vease tambien la Publicacion Internacional N° 98/53083 (Grierson y col.) y la Publicacion de Solicitud de Patente americana relacionada N° 2003/0175965 A1 (Lowe y col.) que describe la supresion genica, usando una construccion de ARN de doble cadena que comprende una secuencia codificadora de gen precedida por una repeticion invertida de 5'UTR. Las construcciones para la supresion genica posttranscripcional en plantas por ARN de doble cadena del gen diana tambien estan descritas en la Publicacion Internacional N° WO 99/53050 (Waterhouse y col.) y la Publicacion Internacional N° WO 99/49029 (Graham y col.). Vease tambien la Publicacion de Solicitud de Patente americana N° 2002/0048814 A1 (Oeller) en la que las construcciones de ADN se transcriben a ARN sentido o
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antisentido con una cola de poli(T)-poli(A) que forma horquilla. Vease tambien la Publicacion de Solicitud de Patente americana N° 2003/0018993 A1 (Gutterson y col.) en la que el ADN sentido o antisentido esta seguido de una repeticion invertida de la region no traducida 3' del gen NOS. Vease tambien la Publicacion de Solicitud de Patente americana N° 2003/0036197 A1 (Glassman y col.) en la que el ARN para reducir la expresion del ARNm diana comprende una parte con homologfa a ARNm diana y una parte con regiones de ARN complementary que no estan relacionadas con el ARN endogeno.
La produccion de ARNdc en plantas para inhibir la expresion genica, por ejemplo, en un nematodo que se alimenta de la planta, esta descrita en el documento de patente americana 6.506.559 (Fire y col.). Los vectores de supresion genica multiple para su uso en plantas se describen en la Solicitud de Patente americana N° 2004/0029283 (Fillatti). La supresion transcripcional tal como la supresion de promotor trans puede estar afectada por una expresion de una construccion de ADN que comprende un promotor unido de manera operable a repeticiones invertidas de ADN promotor de un gen diana. Construcciones utiles para tal expresion genica mediada por la supresion de promotor trans son descritas por Mette y col., The EMBO Journal, Vol. 18, pp. 241-148, (1999) y por Mette y col., The EMBO Journal, Vol. 19, pp. 5.194-5.201-148, (2000).
Sumario
Esta invencion proporciona procedimientos y construcciones de ADN recombinante utiles para producir ARN orientado antisentido para la supresion genica en plantas transgenicas. En un aspecto esta invencion proporciona construcciones de ADN recombinante para la supresion de al menos un gen diana de planta nativa que comprende en orden 5' a 3' un elemento promotor unido de manera operable a un primer elemento de ADN orientado antisentido en relacion con el al menos un gen diana y un segundo elemento de ADN orientado sentido en relacion con el al menos un gen diana que comprende 50 a 5.000 nucleotidos, en las que el elemento de ADN orientado sentido no es mas de aproximadamente la mitad de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido, y el ARN orientado sentido transcrito por el ADN orientado sentido es complementario al extremo mas 5' de ARN orientado antisentido transcrito por el elemento de ADN orientado antisentido, en las que dicho ARN transcrito forma un bucle de ARN orientado antisentido para suprimir dicho al menos un gen diana, y en las que dicho elemento de ADN orientado antisentido comprende, en serie, segmentos de dos o mas genes dirigidos para supresion.
El ADN orientado sentido se puede clonar como una repeticion invertida del segmento mas 5' del elemento de ADN orientado antisentido. Las construcciones con tal ADN orientado sentido se transcriben a ARN que forma un bucle de ARN orientado antisentido cerrado en sus extremos con un segmento de ARN de doble cadena (ARNdc), por ejemplo, como se ilustra en la Figura 1. Para formar un bucle de ARN orientado antisentido el elemento de ADN complementario convenientemente es no mas de aproximadamente la mitad de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido, con frecuencia no mas de un tercio de la longitud de dicho elemento de ADN orientado antisentido, por ejemplo, no mas de un cuarto de la longitud de dicho elemento de ADN orientado antisentido. Las longitudes totales de los elementos de ADN combinados pueden variar. Por ejemplo, el elemento de ADN orientado antisentido puede consistir en de 500 a 5.000 nucleotidos y el elemento de aDn complementario puede consistir en de 50 a 500 nucleotidos. En muchos caos es util para el segmento de ADN orientado antisentido ser mas de dos veces la longitud del segmento de ADN orientado sentido para permitir la formacion de un bucle de ARN orientado antisentido.
La transcripcion antisentido esta disenada para suprimir genes multiples en los que el ADN esta colocado con dos o mas elementos orientados antisentido de diferentes genes dirigidos para supresion seguidos de un elemento orientado sentido complementario, por ejemplo, complementario a al menos un parte del elemento antisentido mas 5'. Esta invencion proporciona ademas un procedimiento para generar ARN orientado antisentido en una planta para la supresion de un gen diana, proporcionando dicho procedimiento en celulas de dicha planta una construccion de ADN recombinante de esta invencion. En el presente documento tambien se describen procedimientos de supresion de la expresion de un gen al proporcionar en las celulas de una planta una construccion de ADN recombinante de supresion de gen que transcribe un bucle antisentido de ARN.
En las construcciones y procedimientos de esta invencion el gen dirigido para silenciamiento es un gen nativo.
Breve descripcion del dibujo
La Figura 1 es una ilustracion esquematica de una construccion de ADN recombinante util en esta invencion para
producir un bucle orientado antisentido de ARN.
La Figura 2 es un analisis tipo Western que indica la supresion genica usando una construccion de esta
invencion.
La Figura 3 muestra espectros de espectroscopfa de masas que indican el contenido de zeina en semillas. Descripcion detallada
Las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 son secuencias de nucleotidos de construcciones de ADN recombinante utiles para transcribir ARN que puede formar un bucle de ARN orientado antisentido para suprimir uno o multiples genes en plantas transgenicas. Vease las Tablas 1 y 2 para una descripcion de elementos de aquellas construcciones.
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Como se usa en el presente documento, “complementario” se refiere a polinucleotidos que son capaces de hibridar, por ejemplo, cadenas sentido y antisentido de ADN o cadenas autocomplementarias de ARN, debido a la complementariedad de nucleotidos alineados permitiendo el enlace de C-G y A-T o A-U.
Como se usa en el presente documento, “vector” significa una molecula de ADN capaz de replicacion en una celula hospedadora y/o a la cual otro segmento de ADN se puede unir de manera operable para provocar la replicacion del segmento unido. Un plasmido es un vector ilustrativo.
Como se usa en el presente documento, una planta o semilla “transgenica”, es una cuyo genoma se ha alterado por la incorporacion de ADN recombinante que comprende material genetico exogeno o copias adicionales de material genetico nativo, por ejemplo, por transformacion o recombinacion de la planta. Las plantas transgenicas incluyen plantas progenie de una planta original derivadas a partir de un procedimiento de transformacion que incluye la progenie de plantas transgenicas de reproduccion con plantas de tipo silvestre u otras plantas transgenicas. Plantas de cultivo de particular interes en la presente invencion incluyen mafz, soja, algodon, canola (colza), trigo, arroz, girasol, cartamo y lino. Otros cultivos de interes incluyen plantas productoras de verduras, fruta, cesped y madera.
Construcciones de ADN recombinante para la transformacion de planta
Las construcciones de ADN recombinante para producir agentes de supresion genica de ARN antisentido en bucle, en plantas transgenicas pueden ser facilmente preparados por los expertos en la tecnica. Generalmente, tal construccion de ADN comprende como mmimo un promotor activo en el tejido dirigido para supresion, un elemento de ADN que se puede transcribir que tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de nucleotidos de un gen dirigido para supresion y un elemento terminador de transcripcion. El elemento de gen dirigido copiado para su uso en el ADN que se puede transcribir en la construccion de supresion genica puede ser un elemento promotor, un elemento intron, un elemento exon, un elemento 5' UTR, o un elemento 3' UTR. Aunque el tamano mmimo de ADN copiado de la secuencia de un gen dirigido para supresion se cree que es aproximadamente de 21 o 23 nucleotidos; se prefieren segmentos de nucleotidos mas largos, por ejemplo, mas de la longitud completa de un gen dirigido. Las longitudes utiles de cada segmento de ADN estan en el intervalo de 50 a 5.000 nucleotidos, dicho ADN orientado antisentido de 500 a 5.000 nucleotidos de longitud y los elementos de ADN complementario pueden ser de 50 a 500 o mas nucleotidos de longitud. El elemento de aDn puede comprender multiples partes de un gen, por ejemplo, nucleotidos que son complementarios a elementos genicos contiguos o separados de UTR, exon e intron. Tales construcciones tambien pueden comprender otros elementos reguladores, ADN que codifica peptidos de transito, peptidos senal, marcadores selectivos y marcadores que se pueden someter a cribado como se desee.
Con referencia a la Figura 1 se ha mostrado esquematicamente una construccion de ADN recombinante que comprende un elemento promotor, un elemento de ADN orientado antisentido (indicado “ADN a/s”), un elemento de ADN orientado sentido complementario (indicado “ADN s”) y ADN que proporciona senales y sitio de poliadenilacion (indicado “sitio poliA”). La construccion de ADN se transcribe a ARN que comprende un segmento de ARN orientado antisentido y un segmento de ARN complementario que es complementario al extremo mas 5' del segmento de ARN orientado antisentido. Los extremos 5' y 3' del ARN antisentido puede auto hibridarse para formar un segmento de ARN de doble cadena que cierra un bucle de ARN orientado antisentido. Por ejemplo, si la secuencia de nucleotidos del extremo mas 5' de la cadena de ADN orientado antisentido transcrito es 5'-CGGCATA—, la secuencia del extremo mas 3' de la cadena transcrita del ADN de repeticion invertida sera —TATGCCG-3' que se clona facilmente del ADN fuente que proporciona el elemento antisentido. Con tales secuencias el bucle del ARN orientado antisentido se prolongara a partir de un lado de un segmento de ARNdc, por ejemplo,
5'-GCCGUAU-------
3'-CGGCAUA---------
El ADN orientado antisentido y su ADN autocomplementario puede ser contiguo o estar separado por ADN vector, por ejemplo, hasta aproximadamente 100 nucleotidos o asf de ADN vector separando los sitios de restriccion usados para el ensamblaje del vector.
Las construcciones de ADN recombinante se pueden ensamblar usando materiales y procedimientos comercialmente disponibles conocidos por aquellos con un conocimiento normal en la tecnica. Una tecnologfa util para construir construcciones de ADN y vectores para la transformacion es la tecnologfa de clonacion GATEWAY™ (disponible de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California) que usa la reaccion de clonacion de la LR recombinasa espedfica a sitio del sistema de Integrasa att de la construccion de vector del bacteriofago lambda, en lugar de endonucleasas y ligasas de restriccion. La reaccion de clonacion de LR se describe en los documentos de patente americana 5.888.732 y 6.277.608, las Publicaciones de Solicitud de Patente americana 2001283529, 2001282319 y 20020007051.
El Manual de Instruccion de la Tecnologfa de Clonacion de GATEWAY™ el cual tambien esta suministrado por Invitrogen tambien proporciona direcciones concisas para la clonacion rutinaria de cualquier ADN deseado en un vector que comprende elementos de expresion vegetal operables.
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Un procedimiento de fabricacion de vector alternativo emplea la clonacion independiente a ligacion descrita por Aslanidis, C. y col., Nucleic Acids Res., 18, 6.069-6.074, 1990 y Rashtchian, A. y col., Biochem., 206, 91-97,1992 en la que un fragmento de ADN con extremos 5' y 3' de cadena sencilla se ligan en un vector deseado que, a continuacion, se pueden amplificar in vivo.
En la bibliograffa se han descrito numerosos promotores que estan activos en celulas vegetales. Estos incluyen promotores presentes en genomas vegetales, as^ como promotores de otras fuentes, incluyendo el promotor de nopalina sintasa (nos) y promotores de octopina sintasa (ocs) portados sobre plasmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, promotores de caulimovirus tales como el virus del mosaico de la coliflor o promotores del virus del mosaico de escrofularia (figwort). Por ejemplo, vease los documentos de patente americana 5.322.938 y 5.858.742 que describen versiones del promotor constitutivo derivado del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S), el documento de patente americana 5.378.619 que describe un promotor 35S del Virus del Mosaico de escrofularia (FMV), el documento de patente americana 5.420.034 que describe un promotor de napina, el documento de patente americana 6.437.217 que describe un promotor RS81 de mafz, el documento de patente americana 5.641.876 que describe un promotor de actina de arroz, el documento de patente americana 6.426.446 que describe un promotor RS324 de mafz, el documento de patente americana 6.429.362 que describe un promotor PR-1 de mafz, el documento de patente americana 6.232.526 que describe un promotor A3 de mafz, el documento de patente americana 6.177.611 que describe promotores de mafz constitutivos, el documento de patente americana 6.433.252 que describe un promotor de oleosina L3 de mafz, el documento de patente americana 6.429.357 que describe un promotor e intron de actina 2 de arroz, el documento de patente americana 5.837.848 que describe un promotor espedfico de rafz, el documento de patente americana 6.084.089 que describe promotores inducibles por fno, el documento de patente americana 6.294.714 que describe promotores inducibles por luz, el documento de patente americana 6.140.078 que describe promotores inducibles por sal, el documento de patente americana 6.252.138 que describe promotores inducibles por patogeno, el documento de patente americana 6.175.060 que describe promotores inducibles por deficiencia de fosforo, el documento de patente americana 6.635.806 que describe un promotor de coixina, el documento U.S. 2002/0192813A1 que describe los elementos 5', 3' e intron utiles en el diseno de vectores de expresion vegetal eficaces, el documento U.S. 2004/0216189A1 que describe un promotor de aldolasa de cloroplasto de mafz, y el documento U.S. 2004/01233447A1 que describe promotores inducibles por deficit de agua.
Estos y numerosos otros promotores que funcionan en celulas vegetales son conocidos por los expertos en la tecnica y estan disponibles para su uso en polinucleotidos recombinantes de la presente invencion para proporcionar la expresion de genes deseados en celulas de planta transgenica.
Ademas, los promotores se pueden alterar para contener “secuencias potenciadoras” multiples para ayudar en la elevacion de la expresion genica. Tales potenciadores son conocidos en la tecnica. Al incluir una secuencia potenciadora con tales construcciones, se puede aumentar la expresion de la protema seleccionada. Estos potenciadores con frecuencia se encuentran 5' al inicio de la transcripcion en un promotor que funciona en celulas eucariotas, pero con frecuencia pueden estar insertados corriente arriba (5') o corriente abajo (3') a la secuencia codificadora. En algunos casos, estos elementos potenciadores 5' son intrones. Particularmente util como potenciadores son los intrones 5' de los genes de la actina 1 de arroz (vease el documento de patente americana 5.641.876) y actina 2 de arroz, el intron del gen de la alcohol deshidrogenasa de mafz, el intron del gen de la protema de choque termico 70 de mafz (documento de patente americana 5.593.874) y el gen shrunken 1 de mafz. Se desea suficiente expresion en tejidos de semilla de planta para efectuar mejoramientos en la composicion de la semilla. Promotores ilustrativos para su uso para la modificacion de la composicion de semilla incluyen promotores de genes de semilla tales como napina (documento U.S. 5.420.034), L3 oleosina de mafz (documento U.S. 6.433.252), zeina Z27 (Russell y col. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-166), globulina 1 (Belanger y col. (1991) Genetics 129:863-872), glutelina 1 (Russell (1997) supra), y peroxirredoxina antioxidante (Perl) (Stacy y col. (1996) Plant Mol. Biol. 31(6):1.205-1.216).
Las construcciones de ADN recombinante con frecuencia incluiran un elemento 3' que contiene generalmente una senal y un sitio de poliadenilacion, especialmente si el ADN recombinante esta dirigido a la expresion de protema, asf como la supresion genica. Elementos 3' bien conocidos incluyen aquellos de genes de Agrobacterium tumefaciens tales como nos 3’, tml 3’, tmr 3’, tms 3’; ocs 3’, tr7 3’, por ejemplo, descritos en el documento U.S.
6.090.627; elementos 3' de genes vegetales tales como protema de choque termico 17 de trigo (Triticum aesevitum), un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa-1,6-bifosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen de lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz, todos los cuales estan descritos en la solicitud de patente publicada americana 2002/0192813 A1; y el gen de la ribulosa bifosfato carboxilasa de guisante (Pisum sativum) (rbs 3’), y elementos 3' de los genes dentro de la planta hospedadora.
Las construcciones de ADN recombinante de supresion genica tambien se pueden apilar con ADN que imparte otros rasgos de interes agronomico que incluye ADN que proporciona resistencia a herbicida o resistencia a insecto tal como usando un gen de Bacillus thuringensis para proporcionar resistencia frente a lepidopteros, coleopteros, homopteros, heirupteros y otros insectos. Herbicidas para los cuales la resistencia es util en una planta incluyen herbicidas de glifosato, herbicidas de fosfinotricina, herbicidas de oxinilo, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de piridina, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de bialafos, herbicidas de sulfonamida y herbicidas de glufosinato. Personas de conocimiento normal en la tecnica son capaces de proporcionar rasgos
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apilados en referencia a las publicaciones de solicitud de patente americana 2003/0106096A1 y 2002/0112260A1 y documentos de patente americana 5.034.322; 5.776.760; 6.107.549 y 6.376.754 y a resistencia a insecto/nematodo/virus en referencia a los documentos de patente americana 5.250.515; 5.880.275; 6.506.599; 5.986.175 y la Publicacion de Solicitud de Patente americana 2003/0150017 A1. Procedimientos de transformacion - Se conocen numerosos procedimientos para la transformacion celulas vegetales con ADN recombinante en la tecnica y se pueden usar en la presente invencion. Dos procedimientos frecuentemente usados para la transformacion de planta son transformacion mediada por Agrobacterium y bombardeo con microproyectiles. Los procedimientos de bombardeo con microproyectiles estan ilustrados en los documentos de Patente americana 5.015.580 (soja); 5.550.318 (maiz); 5.538.880 (maiz); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (maiz); 6.399.861 (maiz) y 6.153.812 (trigo) y la transformacion mediada por Agrobacterium esta descrita en los documentos de patente americana 5.159.135 (algodon); 5.824.877 (soja); 5.591.616 (maz); y 6.384.301 (soja).
Para el sistema de transformacion de planta basado en Agrobacterium tumefaciens, elementos adicionales presentes sobre las construcciones de transformacion incluiran secuencias del borde izquierdo y derecho de ADN-T para facilitar la incorporacion del polinucleotido recombinante en el genoma vegetal.
En general es util introducir ADN recombinante al azar, es decir, a una localizacion no espedfica, en el genoma de una lmea de planta diana. En casos especiales puede ser util para dirigir la insercion de ADN recombinante para conseguir la integracion espedfica a sitio, por ejemplo, para reemplazar un gen existente en el genoma, para usar un promotor existente en el genoma vegetal, o para insertar un polinucleotido recombinante en un sitio predeterminado conocido por ser activo para la supresion genica. Varios sistemas de recombinacion espedfica a sitio que persisten que se sabe que funcionan implantes incluyen cre-lox como se describe en el documento de patente americana 4.959.317 y FLP-FRT como se describe en el documento de patente americana 5.527.695.
Los procedimientos de transformacion preferiblemente se practican en el cultivo de tejido sobre medios en un ambiente controlado. Los “medios” se refieren a las numerosas mezclas de nutriente que se usan para cultivar celulas in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. Las dianas celulares receptoras incluyen, pero no se limitan a, celulas de meristemo, callo, embriones inmaduros y celulas gameticas tales como microsporas, polen, esperma y ovulos. Se contemplo que cualquier celula de la cual se puede regenerar una planta fertil es util como celula receptora. El callo se puede iniciar a partir de fuentes tisulares que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, meristemos apicales de planton, microsporas y similares. Celulas capaces de proliferar como callo tambien son celulas receptoras para la transformacion genetica. Procedimientos de transformacion practicos y materiales para la produccion de plantas transgenicas, por ejemplo, diversos medios y celulas diana receptoras, transformacion de embriones inmaduros y posterior regeneracion de plantas transgenicas fertiles se describen en los documentos de patente americana 6.194.636 y 6.232.526.
Las semillas de las plantas transgenicas se pueden recolectar de plantas transgenicas fertiles y se usan para cultivar generaciones progenie de plantas transformadas incluyendo, la lmea de plantas hubridas para el cribado de plantas que tienen un rasgo agronomico aumentado. Ademas de transformacion directa de una planta con un ADN recombinante, se pueden preparar plantas transgenicas cruzando una primera planta que tiene un ADN recombinante con una segunda planta que carece del ADN. Por ejemplo, el ADN recombinante se puede introducir en la primera lmea de planta que esta disponible para la transformacion para producir una planta transgenica que se puede cruzar con una segunda lmea de planta para someter a introgresion el ADN recombinante en la segunda lmea de planta. Una planta transgenica con ADN recombinante que proporciona un rasgo agronomico aumentado, por ejemplo, produccion aumentada, se puede cruzar con la lmea de planta transgenica que tiene otro ADN recombinante que confiere otro rasgo, por ejemplo, resistencia a herbicida o resistencia a plaga, para producir plantas progenie que tienen ADN recombinante que confiere ambos rasgos. Generalmente, en dicho cultivo para combinar rasgos la planta transgenica que dona el rasgo adicional es una lmea masculina y la planta transgenica que porta los rasgos base es la lmea femenina. La progenie de este cruce se segregara de manera que algunas de las plantas portaran el ADN para ambos rasgos parentales y algunos portaran ADN para un rasgo parental; tales plantas se pueden identificar por marcadores asociados con plantas progenie de ADN recombinante parental que portan ADN para ambos rasgos parentales se pueden cruzar de nuevo en la lmea madre femenina multiple veces, por ejemplo, normalmente 6 a 8 generaciones, para producir una planta progenie con basicamente el mismo genotipo que una lmea parental transgenica original pero para el ADN recombinante de la otra lmea parental transgenica.
En la practica de la transformacion el ADN generalmente se introduce dentro de solamente un pequeno porcentaje de celulas diana en un experimento cualquiera de transformacion. Se usaron genes marcadores para proporcionar un sistema eficaz para la identificacion de aquellas celulas que se transforman de manera estable recibiendo e integrando una construccion de ADN transgenica dentro de sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo, tal como un antibiotico o herbicida. Cualquiera de los herbicidas a los cuales las plantas pueden ser resistentes son agentes utiles para marcadores selectivos. Se exponen celulas potencialmente transformadas al agente selectivo. En la poblacion de celulas supervivientes seran aquellas celulas en las que, generalmente, el gen que confiere resistencia esta integrado y se expresa a niveles suficientes para permitir la supervivencia de la celula. Las celulas se pueden ensayar mas para confirmar la integracion estable del ADN exogeno. Genes marcadores selectivos frecuentemente usados incluyen aquellos que confieren resistencia a antibioticos tales como kanamicina y paromomicina (nptll),
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higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas tales como glufosinato (bar o pat) y glifosato (aroA o EPSPS). Ejemplos de tal marcador genetico se ilustran en los documentos de patente americana 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.
Tambien se pueden emplear marcadores que se pueden someter a cribado que proporcionan una capacidad de identificar visualmente transformantes, por ejemplo, un gen que expresa una protema coloreada o fluorescente tal como una luciferasa o protema verde fluorescente (GFP) o un gen que expresa una beta-glucuronidasa o gen uidA (GUS) para los cuales se conocen diversos sustratos cromogenicos.
Las celulas que sobreviven a la exposicion al agente selectivo, o celulas que se han puntuado positivas en un ensayo de cribado, se pueden cultivar en medios de regeneracion y dejar que maduren en las plantas. Las plantulas en desarrollo se pueden transferir a mezcla de crecimiento vegetal, y aclimatar, por ejemplo, en una camara ambientalmente controlada a una humedad relativa de aproximadamente 85 %, 600 ppm de CO2 y 25 a 250 microeinsteins m-2 s-1 de luz, antes de transferirse a un invernadero o camara de cultivo para la maduracion. Las plantas se regeneran desde aproximadamente 6 semanas a 10 meses despues de que se identifique un transformante, dependiendo del tejido inicial. Las plantas se pueden polinizar usando procedimientos de cultivo vegetal convencionales conocidos por los expertos en la tecnica y se produce semilla, por ejemplo, la autopolinizacion se usa frecuentemente con mafz transgenico. La planta transformada regenerada o su semilla o plantas progenie se puede ensayar para la expresion del ADN recombinante y someter a cribado para la presencia de rasgo agronomico aumentado.
Plantas y semillas transgenicas
Se cultivaron semillas de planta transgenica descrita en el presente documento para generar plantas transgenicas que tienen un rasgo aumentado en comparacion con una planta control. Tal semilla para plantas con rasgo agronomico aumentado se identifica por cribado de plantas transformadas o semilla progenie para rasgo aumentado. Por eficacia se disena un programa de cribado para evaluar plantas transgenicas multiples (eventos) que comprenden el ADN recombinante, por ejemplo, plantas multiples desde 2 a 20 o mas eventos transgenicos.
Plantas transgenicas cultivadas a partir de semilla transgenica proporcionada en el presente documento demuestran rasgos agronomicos mejorados que contribuyen a produccion incrementada u otro rasgo que proporciona valor de planta incrementada, incluyendo, por ejemplo, calidad de semilla mejorada. De particular interes son las plantas que tienen produccion mejorada que resulta del crecimiento y desarrollo vegetal mejorado, tolerancia al estres, desarrollo de semilla mejorado, mayor respuesta a la luz, desarrollo de la flor mejorado, o metabolismo del carbono y/o nitrogeno mejorado.
Muchos eventos transgenicos que sobreviven hasta plantas transgenicas fertiles que producen semillas y plantas progenie no presentara un rasgo agronomico mejorado. El cribado es necesario para identificar la planta transgenica que tiene rasgos agronomicos aumentados a partir de poblaciones de plantas transformadas como se describen en el presente documento mediante evaluacion del rasgo en una diversidad de ensayos para detectar un rasgo agronomico aumentado. Estos ensayos tambien pueden tomar muchas formas, que incluyen, pero se limitan a, analisis para detectar cambios en la composicion qmmica, biomasa, propiedades fisiologicas, morfologfa de la planta.
Los siguientes ejemplos ilustran aspectos descritos en el presente documento.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la preparacion de un vector de transformacion util para insertar una construccion de ADN recombinante en una planta transgenica para practicar un procedimiento como se describe en el presente documento.
El gen LKR/SDH codifica una preprotema para la lisina cetoglutarato reductasa (LKR) y sacaropina deshidrogenasa (SDH) que son enzimas en una ruta catabolica de lisina. La supresion de LKR es patente en la modificacion, por ejemplo, incremento, del contenido de lisina. La supresion de lKr esta afectada por la expresion en una planta de una construccion de ADN recombinante que produce un ARN antisentido estabilizado transcrito a partir de ADN de LKR orientado antisentido y ADN de LKR orientado sentido que forma un bucle de ARN orientado antisentido.
Se prepara un vector de transformacion que comprende dos unidades de transcripcion entre los bordes derecho e izquierdo de Agrobacterium tumefaciens. Una unidad de transcripcion para un marcador comprendida por:
(a) ADN de un promotor de actina de arroz e intron de actina de arroz,
(b) ADN de un peptido de transito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis
(c) ADN de aroA de A. tumefaciens (un marcador resistente a glifosato), y
(d) ADN de terminador de NOS de A. tumefaciens,
La otra unidad de transcripcion para la supresion del gen LKR comprendida por:
(a) ADN del promotor de GLB1 de Zea mays,
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(b) ADN de un intron de ADH1 de Zea mays,
(c) fragmento de ADN orientado antisentido de LKR de Zea mays,
(d) fragmento de ADN orientado sentido de LKR de Zea mays, y
(e) ADN del terminador de GLB1 de Zea mays.
La SEQ ID NO:1 es una secuencia de ADN de un vector de transformacion que comprende el marcador anteriormente descrito y los elementos de supresion genica. Vease la Tabla 1 de a continuacion para una descripcion de los elementos del vector de transformacion contenido dentro de la SEQ ID NO:1.
Tabla 1
Bases de SEQ ID NO:1
Descripcion del segmento de ADN
1-357
borde derecho de A. tumefaciens
376-1774
ADN de un promotor de actina de arroz e intron de actina de arroz
1784-2011
ADN del peptido de transito de cloroplasto de EPSPS de A. tumefaciens
2012-3379
ADN de A. tumefaciens aroA (marcador resistente a glifosato)
3395-3647
ADN del terminador de NOS de A. tumefaciens
3691-4686
ADN del terminador de GIB1 de Zea mays
4692-5145
Elemento de ADN orientado sentido de LKR de Zea mays
5152-6118
Elemento de ADN orientado antisentido de LKR de Zea mays
6123-6680
ADN de un intron de ADH1 de Zea mays
6687-8082
ADN del promotor de GLB1 de Zea mays
8149-8590
borde izquierdo de A. tumefaciens
Se uso un vector preparado con los elementos enumerados en la Tabla 1 para transformar tejido vegetal de mafz. Se obtuvieron plantas de mafz transgenicas por transformacion mediada por Agrobacterium. Las plantas transgenicas a partir de dos eventos de insercion transgenica separados se cultivaron para producir semilla F1. Seis semillas maduras de cada evento se analizaron para determinar el exito de la transformacion y supresion de LKR. Las semillas transgenicas maduras se diseccionaron para extraer la protema que se analizo por analisis tipo Western. Con referencia a la Figura 2, la semilla de uno de los eventos no mostro reduccion en LKR en comparacion con el tipo silvestre; y se mostro que la semilla del otro evento se segregaba (1:1 hemicigoto:tipo silvestre) ya que tres de las seis semillas mostraron reduccion sustancial en LKR en comparacion con el tipo silvestre.
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra vectores de transformacion utiles para insertar una construccion de ADN recombinante en una planta transgenica para practicar un procedimiento como se describe en el presente documento. Se prepararon vectores de transformacion usando los siguientes elementos de ADN en los que:
(a) “pGcx" se refiere a ADN para un promotor derivado de un gen de gama coixina de Coixlacryma-jobi;
(b) "pZ27" se refiere a ADN para un promotor derivado de un gen de gama zeina de Zea mays;
(c) "pZ27t" se refiere a ADN para un promotor truncado que tiene secuencia lfder de 59 nucleotidos sometida a delecion de la region 3' de pZ27;
(d) "Z19as" se refiere a ADN para un segmento orientado antisentido de 351 nucleotidos de la secuencia codificadora de un gen de alfa zeina de 19 kilo daltons de Zea mays;
(e) "Z19s" se refiere a ADN para un segmento orientado sentido de 351 nucleotidos de la secuencia codificadora de un gen de alfa zeina de 19 kilo daltons de Zea mays, que es una repeticion invertida de Z19as;
(f) "Z22as" se refiere a ADN para un segmento orientado antisentido de 789 nucleotidos de la secuencia codificadora de un gen de alfa zeina de 22 kilo daltons de Zea mays;
(g) "Z22asL" se refiere a ADN para un segmento orientado antisentido de 785 nucleotidos de la secuencia codificadora de un gen de alfa zeina de 22 kilo daltons de Zea mays;
(h) "Z22asSI" se refiere a ADN para un segmento orientado antisentido de 789 nucleotidos de la secuencia codificadora de un gen de alfa zeina de 22 kilo daltons de Zea mays que tiene un intron capaz de ser sometido a corte y empalme de 520 nucleotidos de longitud de un intron 3 del gen GB1 de Zea mays insertado en la region no emparejada;
(i) "Z22s" se refiere a ADN para un segmento orientado sentido de 289 nucleotidos de la secuencia codificadora
de un gen de alfa zeina de 22 kilo daltons de Zea mays, el cual es una repeticion invertida del extremo 5' de Z22as; y
(j) “TE9” se refiere a ADN para un elemento de senal y sitio de poliadenilacion orientada sentido de un gen RbcS2 de Pisum sativum
5 Con referencia a la Tabla 2 y la SEQ ID NO: 2 se produjo un vector de transformacion que comprendfa la “construccion 2a" de la manera del Ejemplo 1 excepto que la unidad de transcripcion para la supresion del gen LKR se reemplazo por una unidad de transcripcion que comprendfa los elementos ilustrados en el siguiente esquema: "Construccion 2a" pZ27 - Z19as - Z22asL - Z22s - Z19s - TE9
Tabla 2
Bases de SEQ ID NO:2
Descripcion de segmento de ADN
1-357
borde derecho de A. tumefaciens
376-1774
ADN de un promotor de actina de arroz e intron de actina de arroz
1784-2011
ADN de peptido de transito de cloroplasto de EPSPS de A. tumefaciens
2012-3379
ADN de A. tumefaciens aroA (marcador resistente a glifosato)
3395-3647
ADN del terminador de NOS de A. tumefaciens
3479-4391
ADN del terminador de RbcS2 de Pisum sativum
4398-4748
ADN para Z19s
4755-5043
ADN para Z22s
5050-5835
ADN de Z22asL
5842-6192
ADN de Z19as
6204-7305
ADN del promotor Z27 de Zea mays
7353-7794
borde izquierdo de A. tumefaciens
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Se transformo callo de mafz y se seleccionaron eventos con una copia sencilla del vector de transformacion para el desarrollo en plantas. La semilla de plantas cultivadas a partir de 26 de 29 eventos de copia sencilla mostro considerable reduccion de las alfa zeinas de 19 kilo daltons y las alfa zeinas de 22 kilo daltons.
Se produjeron otros vectores de transformacion de una manera similar usando los elementos ilustrados en la 15 siguiente Tabla 3.
Tabla 3
Construccion 2b1
pGcx - Z19as - Z22asSI - Z22s - Z19s - TE9
Construccion 2b2*
pGcx - Z19as - Z22asSI - Z22s - Z19s - TE9
Construccion 2c
pZ27 - Z19as - Z22asSI - Z22s - Z19s - TE9
Construccion 2d
PZ27t - Z19as - Z22asSI - Z22s - Z19s - TE9
Construccion 2e
PZ27 - Z19as - Z22asL - Z19s - TE9
* la construccion 2b2 se inserto en un vector de transformacion que tambien inclrna una unidad de transcripcion para la expresion de otro gen que tema un promotor contiguo a pGcx.
Se informa de la eficacia de supresion de las alfa zeinas en semillas producidas por plantas cultivadas a partir de eventos de copia sencilla en la Tabla 4 la cual informa del numero de eventos transgenicos con reduccion de zeinas 20 en comparacion con el numero total de eventos transgenicos generados en cada construccion ensayada. El fenotipo de reduccion de zeina es observado por analisis de MALDITOF MS (Espectrometna de masas con tiempo de vuelo de ionizacion por desorcion por laser asistida por matriz). La Figura 3 ilustra espectros tfpicos que evidencian la reduccion de zeina.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una construccion de ADN recombinante para la supresion de al menos un gen diana de planta nativa que comprende en orden 5' a 3' un elemento promotor unido de manera operable a un primer elemento de ADN orientado antisentido en relacion con el al menos un gen diana y un segundo elemento de ADN orientado sentido en
    5 relacion con el al menos un gen diana que comprende 50 a 5.000 nucleotidos, en la que el elemento de ADN orientado sentido no es mas de aproximadamente la mitad de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido, y el ARN orientado sentido transcrito por el ADN orientado sentido es complementario al extremo mas 5' del ARN orientado antisentido transcrito por el elemento de ADN orientado antisentido, en la que dicho ARN transcrito forma un bucle de ARN orientado antisentido para suprimir dicho al menos un gen diana, y en la que dicho elemento de 10 ADN orientado antisentido comprende, en serie, segmentos de dos o mas genes dirigidos para supresion.
  2. 2. La construccion de ADN recombinante de la reivindicacion 1, en la que dicho bucle de ARN orientado antisentido se cierra con un segmento de ARN de doble sentido.
  3. 3. La construccion de ADN recombinante de la reivindicacion 2, en la que una cadena de dicho segmento de ARN de doble cadena es identica al ARNm de un gen dirigido para supresion.
    15 4. La construccion de ADN recombinante de la reivindicacion 1, en la que dicho elemento de ADN orientado sentido
    comprende de 50 a 500 nucleotidos.
  4. 5. La construccion de ADN recombinante de la reivindicacion 1, en la que dicho elemento de ADN orientado sentido no es mas de aproximadamente un tercio de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido.
  5. 6. La construccion de ADN recombinante de la reivindicacion 1, en la que dicho elemento de ADN orientado sentido 20 no es mas de aproximadamente un cuarto de la longitud del elemento de ADN orientado antisentido.
  6. 7. Un procedimiento para generar ARN orientado antisentido en una planta para la supresion de un gen diana, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar, en las celulas de dicha planta, una construccion de ADN recombinante segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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