CN110938126B

CN110938126B - 柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用

Info

Publication number: CN110938126B
Application number: CN201911317908.4A
Authority: CN
Inventors: 刘小丰; 江东; 赵晓春; 朱世平; 申晚霞; 余歆
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110938126A

Abstract

本发明提供了一种柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用，涉及植物基因工程技术领域；所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FcMYC2基因具有调控柑橘精油合成的功能，体现为正调控柑橘精油主要成分单萜和倍半萜的合成；本发明通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述FcMYC2基因的功能，为研究柑橘精油合成调控网络和柑橘育种提供宝贵的基因资源。

Description

柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用。

背景技术

柑橘精油储藏在位于果皮、花瓣、叶片等组织的油胞中。其主要成分为单萜和倍半萜，占到总精油含量的97％以上。柑橘精油中单萜和倍半萜类成分有近百种，其调控机制和调控网络仍少有报道。目前，在其它植物中找到了一些调控倍半萜和生物碱合成的转录因子，如棉花GaWRKY1、白木香AsMYC2、苜蓿bHLH转录调控因子TSAR1和TSAR2等，在柑橘中仅发现AP2/ERF转录调控因子CitAP2.10调控倍半萜valencene的合成，但valencene在精油中含量极低，而其它调控柑橘单萜和其它倍半萜成分合成的转录因子仍未见报道。

滑皮金柑(Fortunella crassifolia Swing.)及脆蜜金柑(滑皮金柑的二倍体和四倍体的嵌合体)是柑橘中极罕见的两个精油含量极低(约为正常品种的1％)的品种，其果皮适口性好、无刺鼻辛辣味，其果实抗病性强，果实固形物含量、总糖含量显著高于其突变亲本融安金柑，也高于其它柑橘类品种。造成这一现象的分子机制目前仍不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种调控柑橘精油合成的FcMYC2基因、编码蛋白及其应用，通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述FcMYC2基因的功能，为柑橘育种提供了宝贵的基因资源。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种调控柑橘精油合成的FcMYC2基因，所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述FcMYC2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

本发明还提供了一组扩增所述FcMYC2基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种扩增所述FcMYC2基因的方法，以柑橘基因组DNA为模板，以权利要求3所述引物对为引物进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括：1μL模板DNA，12.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2×)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，无核酸超纯水10.5μL；所述PCR扩增的程序包括：95℃4min；95℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min，16℃保持。

本发明还提供了所述FcMYC2基因或所述蛋白质在调控柑橘精油合成中的应用。

优选的，所述柑橘包括柑橘属、金柑属或枳属植物。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控单萜合成中的应用。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控倍半萜合成中的中的应用。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控次生代谢产物合成中的应用。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在柑橘育种中的应用。

本发明提供了一种调控柑橘精油合成的FcMYC2基因，所述FcMYC2基因来源于柑橘；具有调控柑橘单萜和倍半萜合成功能，可影响植株中的茉莉酸和脱落酸的含量，进而影响柠檬苦素、类黄酮等次生代谢产物的合成。经验证，所述FcMYC2基因属于柑橘MYC2型bHLH家族成员，具有极高的序列特异性，其功能未见报道；本发明通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述FcMYC2基因的功能，为柑橘育种提供了宝贵的基因资源。

附图说明

图1为滑皮金柑(HP)与融安金柑(RA)表型、精油含量及基因表达分析，其中(A)为滑皮金柑与融安金柑果皮表型，(B)为滑皮金柑果皮(HP-P)与融安金柑果皮(RA-P)精油含量分析，(C)为滑皮金柑叶片(HP-L)和果皮与融安金柑叶片(RA-L)和果皮柠檬烯合成酶基因(LS，Cs3g04360)表达分析，(D)为滑皮金柑叶片和果皮与融安金柑叶片和果皮FcMYC2基因表达分析；数据展示以平均值±SD；Student’s t-test用于差异显著性分析，***代表p<0.001；

图2为不同柑橘品种果皮FcMYC2基因相对表达量及果皮精油含量，其中HP、RA分别为滑皮金柑和融安金柑，Z为枳壳(Poncirus trifoliata(L.)Raf)，BDZ为本地早橘(Citrusreticulata Blanco)，YJ为沅江酸橙(C.aurantium L.)，NH为纽荷尔脐橙(C.sinensis(L.)Osbeck)，DFZ为东风早柚(C.grandis(L.)Osbeck)，YLK为尤力克柠檬(C.limon(L.)Burm)；东风早柚用刀片削取外果皮，其余品种剥取全果皮；

图3为转基因植株与对照植株株型及叶片表型分析，WT为锦橙对照，RNAi为FcMYC2干扰植株，箭头所示为叶片油胞；

图4为FcMYC2表达下调植株和对照中FcMYC2基因和LS基因的表达分析，RI-1、-2和-3为pGBi-RNAi-1载体转化后获得的3个株系，RI-3-1、3和-7为pGBi-RNAi-3载体转化后获得的3个株系，WT为锦橙对照；

图5为FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照的类黄酮和柠檬苦素含量分析，类黄酮含量为总的类黄酮含量，柠檬苦素含量为Limonin含量。

具体实施方式

本发明所述FcMYC2基因优选来源于于金柑(Fortunella crassifolia Swing.)，该基因仅一个外显子，无内含子，基因序列由1563个核苷酸组成，SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2间有两个SNP位点，分别在+408和+1320位上，有两种组合方式，其中SEQ ID NO.1的组合方式为G₄₀₈T₁₃₂₀，SEQ ID NO.2的组合方式为T₄₀₈C₁₃₂₀，这两个SNP位点变异位于密码子的第3位，未造成氨基酸的改变。本发明所述FcMYC2基因属于柑橘MYC2型bHLH家族成员，降低植株中FcMYC2基因的表达水平，能明显降低植株中单萜和倍半萜的含量。同时所述FcMYC2基因也显著影响柠檬苦素、类黄酮等次生代谢产物的合成。

本发明还提供了所述FcMYC2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。本发明所述蛋白质由520个氨基酸残基组成。

本发明还提供了一组扩增所述FcMYC2基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：GCTTTTCTGAAGCCATGGAA，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：GCAGTTAATAAGCAAGATCGAGT。

本发明还提供了一种扩增所述FcMYC2基因的方法，以柑橘基因组DNA为模板，以权利要求3所述引物对为引物进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括：1μL模板DNA，12.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2×)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，无核酸超纯水10.5μL；本发明所述模板DNA的浓度优选为50ng/μL，上游引物和下游引物的浓度均为10μM；所述PCR扩增的程序包括：95℃4min；95℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min，16℃保持。

本发明所述柑橘优选包括柑橘属、金柑属或枳属植物。

本发明实施例中通过构建所述FcMYC2基因干扰株系，并通过对转基因株系的表型观察、精油成分与含量分析、基因表达分析，发现干扰株系叶片油胞明显变小，精油含量显著低于对照，特别是单萜和倍半萜含量显著低于对照，确定所述FcMYC2基因及其编码的蛋白质能够调控柑橘精油合成。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控单萜合成中的应用。发明所述FcMYC2基因通过降低单萜和倍半萜的合成，影响柠檬苦素和类黄酮合成中所需要萜类前体的供给，造成柠檬苦素含量明显上升，而类黄酮含量明显下降。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控倍半萜合成中的中的应用。本发明所述应用中，所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控倍半萜合成中作用与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控次生代谢产物合成中的应用。本发明所述此生代谢产物包括柠檬苦素和类黄酮。本发明所述应用中，所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在调控次生代谢产物合成中作用与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明还提供了所述的FcMYC2基因或所述的蛋白质在柑橘育种中的应用。本发明在所述柑橘育种过程中，能够通过基因工程的手段调节FcMYC2基因的表达水平，降低单萜和倍半萜的合成量，减少糖分的消耗，进而获得品质更加优良的柑橘资源。

下面结合实施例对本发明提供的柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

果皮精油含量滴定

为比较滑皮金柑(HP)与融安金柑(RA)果皮中精油含量的差异，对两个品种转色期果皮的精油含量用溴化钾-溴酸钾滴定法进行滴定量分析。结果如图1中B所示，HP果皮精油含量为0.11mg/g，RA果皮精油含量为9.3mg/g。HP的精油含量极显著地低于油胞正常品种RA(p<0.001)，同样远低于许多其它的金柑和柑橘品种。

实施例2

FcMYC2基因和柠檬烯合成酶(LS)基因在HP和RA组织中的表达分析

本实施例中所涉及的FcMYC2基因来源于金柑(Fortunella crassifoliaSwing.)，从HP和RA的叶片和果皮RNA-seq数据中筛选所得。

本实施例中所涉及的柠檬烯合成酶基因来源于柑橘，柠檬烯是柑橘果皮精油中含量最高的成分，能达到精油成分的70％以上。

用于检测FcMYC2基因表达量的引物序列为:

FcMYC2-qRT-F：5’-TCCGCTCTGTGGTTCCAAAC-3’(SEQ ID NO.6)

FcMYC2-qRT-R：5’-CTTGGCCCTGAGCTCTTTGA-3’(SEQ ID NO.7)

用于检测LS基因的引物序列为：

LS-qRT-F：5’-ATGGAGATGGGCATGGTGTT-3’(SEQ ID NO.8)

LS-qRT-R：5’-TGCCAGGAGATGCTGTGAAA-3’(SEQ ID NO.9)

以Actin(Cs1g05000)作为内参基因，其引物序列为：

Actin-F：5’-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3’(SEQ ID NO.10)；

Actin-R：5’-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3’(SEQ ID NO.11)

根据内参基因Actin来计算FcMYC2和LS的相对表达量，并将滑皮金柑叶片(HP-L)的表达量视为1，计算FcMYC2和LS的相对表达倍数。

结果如图1中C和D所示，FcMYC2和LS的表达水平在RA组织中的表达水平极显著高于HP，符合RA组织中精油含量远高于HP的特征。

实施例3

FcMYC2基因的表达水平与柑橘果皮精油含量的相关性

本实施例中分别对金柑属品种HP、RA，枳属品种枳壳(Poncirus trifoliata(L.)Raf)，柑橘属品种本地早橘(Citrus reticulata Blanco)、沅江酸橙(C.aurantium L.)、纽荷尔脐橙(C.sinensis(L.)Osbeck)、东风早柚(C.grandis(L.)Osbeck)和尤力克柠檬(C.limon(L.)Burm)果皮中FcMYC2基因相对表达量与果皮精油含量进行了分析。其中东风早柚用刀片削取外果皮，其余品种剥取全果皮。结果如图2所示，HP果皮精油含量仅0.09mg/g，其它几个柑橘品种果皮精油含量在4.49～18.23mg/g之间，远高于HP。相关分析显示，柑橘FcMYC2的表达水平与果皮精油含量呈极显著正相关(r＝0.880，p<0.01)。

实施例4

FcMYC2基因干扰载体的构建

本实施例中所用p1301NG载体参见论文nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用(刘小丰，彭爱红，许兰珍等，nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用.热带作物学报，2013年第7期)。pFGC5941载体可从公司购得。用EcoRI/PstI将“CAMV35S promoter+chalcone synthase intron+octopine synthase polyAsignal”从pFGC5941载体中切下，连接到经相同酶切的p1301NG载体中，得到RNAi干扰载体pGBi。本发明所述RNAi干扰载体pGBi保藏在实验室内，并承诺自申请日起20年内对公众开放，并可用于重复本发明实验。

分别选取+7至+406(RNAi-1)和+737至+1106(RNAi-2)两个片段为RNAi干扰的靶片段，设计引物扩增两个片段，其引物序列如下：

用于扩增片段RNAi-1的引物序列为:

RNAi-1-forward-F：5’-GGCGCGCCGAGATTGTGTCTTCGT-3’(SEQ ID NO.12)

RNAi-1-forward-R：5’-ATTTAAATCAATTGCAAATGAACG-3’(SEQ ID NO.13)

RNAi-1-reverse-F：5’-GGATCCCAATTGCAAATGAACG-3’(SEQ ID NO.14)

FcMYC2-qRT-R：5’-TCTAGAGAGATTGTGTCTTCGT-3’(SEQ ID NO.15)

用于扩增片段RNAi-2的引物序列为:

RNAi-3-forward-F：5’-GGCGCGCCTTGCTCCTCTGCTAGA-3’(SEQ ID NO.16)

RNAi-3-forward-R：5’-ATTTAAATACGTTTGGAACCACAGA-3’(SEQ ID NO.17)

RNAi-3-reverse-F：5’-GGATCCACGTTTGGAACCACAGA-3’(SEQ ID NO.18)

RNAi-3-reverse-R：5’-TCTAGATTGCTCCTCTGCTAGA-3’(SEQ ID NO.19)

将扩增好的序列，经TA克隆，测序确认后，分别用AscI/SwaI和BamHI/XbaI酶切后连接入经相同酶切的pGBi载体中，获得两个干扰载体pGBi-RNAi-1和pGBi-RNAi-3，用电击法分别将两个载体转入农杆菌EHA105中。

实施例4

下调FcMYC2基因表达的锦橙的获得

利用转基因手段下调柑橘中FcMYC2基因的表达，受体材料为锦橙(C.sinensis(L.)Osbeck cv.Jincheng)上胚轴。MS基础培养基型号为M519(PhytoTechnologyLaboratories，美国)。所有激素和抗生素都采用过滤灭菌的方式，在培养基使用时加入。具体遗传转化操作步骤如下：

(1)上胚轴的培育

在转化前25d左右，取成熟且未受到伤害的锦橙果实，在加有洗涤剂的温水中仔细清洗干净，室温凉干后在超净工作台上用70％酒精浸泡15min。用刀片切开果实，取出饱满的种子，剥去外种皮和内种皮，放入装有萌发培养基[MS(5％Suc)+9g/L agarpowder，pH5.8]的试管中，28℃培养箱中暗培养。转化前3-5d将取出试管见光培养。

(2)农杆菌准备

转化前3d取出在-80℃保存的农杆菌菌株，在LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素和50mg/L的利福平)上划单克隆。转化前1d挑取单克隆，在含有LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和50mg/L的利福平)中摇菌过夜。转化当天早晨，取1mL过夜培养的菌液，加到50mL相同的LB液体培养基中二次培养。当二次培养的农杆菌菌液达到OD₆₀₀＝0.5时，取出菌液，在50mL的离心管中5000rpm 20min离心收集菌液，然后用激活培养基[MS(3％Suc)+100μMAS，pH5.2]重悬菌株，室温静置备用。

(3)外植体的预培养

农杆菌二次活化期间，在超净台上取出准备好的锦橙上胚轴，放入15cm玻璃培养皿中，切成1-2cm长的外植体。将外植体放到装有液体预培养基[MS(3％Suc)+2mg/LBA+1mg/L IAA+2mg/L 2,4-D+100μMAS，pH5.8]的三角瓶中，100rpm摇床上室温振荡培养2-4h。

(4)外植体的侵染与共培养

从预培养基中取出外植体，放入带有农杆菌的激活培养基中侵染10-15min，期间轻轻摇晃2-3次。将侵染后的外植体用灭菌滤纸擦干并整齐摆放在共培养基[MS(3％Suc)+3g/L phytagel+2mg/L BA+1mg/L IAA+2mg/L 2,4-D+100μMAS，pH5.8]上，26℃暗培养2-3天。

(5)外植体筛选培养

外植体共培养3d后，将外植体直接转入筛选培养基[MS(3％Suc)+3g·L^-1phytagel+2mg/LBA+1mg/L IAA+500mg/L Car，pH5.8]中，28℃暗培养10d左右进行光照培养，光周期为16/8h。4周左右继代一次。

(6)再生芽的筛选与嫁接

再生芽用DFP-1荧光蛋白观测镜(NightSea，美国)观察，确认带有绿色荧光的再生芽。待绿色荧光芽长到0.5cm后，微嫁接于1月龄的锦橙试管砧木上，放入带有滤纸桥的嫁接培养基[MS(5％Suc)，pH5.8]上培养。待再生芽长出数片新叶，并形成再生小苗时，将小苗从试管中取出，嫁接于1年生的枳壳砧木上，放在温室中培养。再生幼苗嫁接存活后，及时取叶片提取DNA，通过PCR检测是否为阳性转化植株，选择阳性转化植株进行后续实验。

实施例5

FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照的基因表达分析

对FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照植株中FcMYC2和LS基因进行表达分析，结果如图4所示，干扰植株中FcMYC2和LS的表达量较对照都极显著下调。

实施例6

FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照的精油成分分析

利用HS-SPME-GCMS(headspace solid-phase microextraction and gaschromatography-mass spectrometry)的方法对转基因锦橙和对照的叶片进行精油成分测定，设6个生物学重复。精油成分分析前，每个株系取保存的叶片1g，液氮速冻后研磨成粉，倒入20mL的瓶中，加入3mL饱和NaCl溶液和2μL环己酮(内标)，立即用聚四氟乙烯隔热垫密封盖盖紧，上机检测。顶空固相微萃取条件：40℃平衡15min，顶空吸附40min。萃取头的型号为美国Supelco公司的二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS 50/30μm)。吸附完毕后萃取头移入气相色谱仪中250℃解吸5min。气相色谱和质谱型号分别为美国Agilent公司的7890A和5975C，色谱柱为DB-5MS(30m×250μm，0.25μm)。升温程序分三步：35℃保持5min，然后以3℃/min升至180℃并保持2min，再以5℃/min升至240℃并保持2min。进样口温度250℃，不分流进样。载气为氦气(纯度>99.999％)，流速为1mL/min。质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)源，电子能量70eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围m/z 35-400。

获得的质谱数据与NIST 2008和Flavor 2.0质谱库进行比对，将鉴定出的挥发性成分的含量计算公式为：挥发性物质含量(μg/g)＝各成分的峰面积×环己酮的质量/(环己酮的峰面积×样品质量)。

结果如表1所示，FcMYC2干扰植株中单萜、单萜氧化物、倍半萜、倍半萜氧化物及其它非萜类成分含量都明显低于对照，分别为对照的13.5％、5.6％、22.4％、0和21.6％，可见下调FcMYC2基因的表达能显著降低了植株中精油的含量。

表1下调FcMYC2基因表达植株和对照精油成分表(μg/g)

U：未检出

无标准差的成分仅在6个生物学重复中的一个重复中检出

注：造成部分成分标准差较大的原因是转基因株系间成分含量的差异

实施例7

FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照的类黄酮和柠檬苦素含量分析

本实施例利用广靶代谢组学检测方法对FcMYC2基因下调表达的锦橙及对照的类黄酮和柠檬苦素含量进行了分析，在武汉迈特维尔生物科技有限公司提取并完成检测，FcMYC2基因下调表达和对照各取6个株系，每2个株系设为一组，各3组进行检测。结果如图5所示，FcMYC2基因下调表达的锦橙中类黄酮的含量显著下调，而柠檬苦素含量显著上调。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 柑橘FcMYC2基因及其编码蛋白在调控柑橘精油合成中的应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> Fortunella crassifolia Swing.

<400> 1

atggaagaga ttgtgtcttc gtcttcttcg tcttatccca tgccattttg tcaagaaacc 60

tcaccaactc ttcaacagag acttcaattc attgttcaaa accggcctga gtggtgggtc 120

tattccatct tctggcaacc actgaaagac gtgaacggcc gccttgtttt atcatggggt 180

gatggctatt tccgcgggag caaagatttt gctacaaggg cggcggcagg caaacaaggc 240

gcaggcaacg agcccaaatt cggcttcttt ttggagagga agaaggtgag caaagaggtt 300

caagttcatt tcggagagga tatggacttg gatagaatgg tggatgggga tgttactgac 360

ggggaatggt attacacagt gtcggttacc cgttcatttg caattgggga tggtagtgtt 420

cttggtaggg tgtttagctc tggtgattat gtgtggctaa ctggtgacca tgagctccaa 480

ctgtacgagt gtgaaagagt taaagaagct cgtatgcatg ggattcagac tttggtctgc 540

gtttcaactg cttgtggagt tgttgaattg ggctcttcag atttgatcaa agaagattgg 600

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caagtcaatc ttaattctga gagccaactt caactaccca atcccacgac cagaaataat 720

aataatacta ataatgttgc tcctctgcta gacattggaa tgttctcagg tgcaggcgcc 780

ccccaccacc accaccacca tcatcatcaa aaagagtggt cccttgaaga gaattcgaag 840

cagcagaccc gagaagtatc cggcgatgta attaagaaag aacagctagc tgctggtttt 900

ggccgttcat cttcagattc ggggccttct gactcagacg gtcacttcgt ttcaggattt 960

actgacatta atgttacatc caaaaaacga ggaagaaagc caacaagcgg aagagagtct 1020

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gctctccgct ctgtggttcc aaacgtttcc aaaatggaca aagcttcttt actcgctgat 1140

gctgttgcct acatcaaaga gctcagggcc aaggttgacg aacttgaggc gaaactccgt 1200

gaacaggcta gaaaatcaaa ggtggtgtac aacgtttatg acaacaatca aagcactggc 1260

tctacaatca tgatgccaac gtcgtcttcg actactcatc atcttggcat taatattaat 1320

attatggatg tcgatgtgaa gattgtagga tcagaagcca tgatacgtgt tcaatgccca 1380

gatatcaatt atccggcggc taaattgatg gatgtgctca gagatcttga gtttcatgtt 1440

catcatgcca gtgtatcaag cgtgagggag actatgcttc aggatgttgt cgtcaggatt 1500

cccgagggat tgattagtga agaggttatt agaagtgcta ttttccaaag aatgcaaaac 1560

tag 1563

<210> 2

<211> 1563

<212> DNA

<213> Fortunella crassifolia Swing.

<400> 2

atggaagaga ttgtgtcttc gtcttcttcg tcttatccca tgccattttg tcaagaaacc 60

tcaccaactc ttcaacagag acttcaattc attgttcaaa accggcctga gtggtgggtc 120

tattccatct tctggcaacc actgaaagac gtgaacggcc gccttgtttt atcatggggt 180

gatggctatt tccgcgggag caaagatttt gctacaaggg cggcggcagg caaacaaggc 240

gcaggcaacg agcccaaatt cggcttcttt ttggagagga agaaggtgag caaagaggtt 300

caagttcatt tcggagagga tatggacttg gatagaatgg tggatgggga tgttactgac 360

ggggaatggt attacacagt gtcggttacc cgttcatttg caattggtga tggtagtgtt 420

cttggtaggg tgtttagctc tggtgattat gtgtggctaa ctggtgacca tgagctccaa 480

ctgtacgagt gtgaaagagt taaagaagct cgtatgcatg ggattcagac tttggtctgc 540

gtttcaactg cttgtggagt tgttgaattg ggctcttcag atttgatcaa agaagattgg 600

agcttggtgc aattagccaa atctctcttc ggccctgtca ttgctactat gctcacaaag 660

caagtcaatc ttaattctga gagccaactt caactaccca atcccacgac cagaaataat 720

aataatacta ataatgttgc tcctctgcta gacattggaa tgttctcagg tgcaggcgcc 780

ccccaccacc accaccacca tcatcatcaa aaagagtggt cccttgaaga gaattcgaag 840

cagcagaccc gagaagtatc cggcgatgta attaagaaag aacagctagc tgctggtttt 900

ggccgttcat cttcagattc ggggccttct gactcagacg gtcacttcgt ttcaggattt 960

actgacatta atgttacatc caaaaaacga ggaagaaagc caacaagcgg aagagagtct 1020

cctctcaacc acgtggaagc agagaggcag cgccgtgaga ggcttaatca tcgcttctat 1080

gctctccgct ctgtggttcc aaacgtttcc aaaatggaca aagcttcttt actcgctgat 1140

gctgttgcct acatcaaaga gctcagggcc aaggttgacg aacttgaggc gaaactccgt 1200

gaacaggcta gaaaatcaaa ggtggtgtac aacgtttatg acaacaatca aagcactggc 1260

tctacaatca tgatgccaac gtcgtcttcg actactcatc atcttggcat taatattaac 1320

attatggatg tcgatgtgaa gattgtagga tcagaagcca tgatacgtgt tcaatgccca 1380

gatatcaatt atccggcggc taaattgatg gatgtgctca gagatcttga gtttcatgtt 1440

catcatgcca gtgtatcaag cgtgagggag actatgcttc aggatgttgt cgtcaggatt 1500

cccgagggat tgattagtga agaggttatt agaagtgcta ttttccaaag aatgcaaaac 1560

tag 1563

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<212> PRT

<213> Fortunella crassifolia Swing.

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Met Glu Glu Ile Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Met Pro Phe

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Cys Gln Glu Thr Ser Pro Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Phe Ile Val

20 25 30

Gln Asn Arg Pro Glu Trp Trp Val Tyr Ser Ile Phe Trp Gln Pro Leu

35 40 45

Lys Asp Val Asn Gly Arg Leu Val Leu Ser Trp Gly Asp Gly Tyr Phe

50 55 60

Arg Gly Ser Lys Asp Phe Ala Thr Arg Ala Ala Ala Gly Lys Gln Gly

65 70 75 80

Ala Gly Asn Glu Pro Lys Phe Gly Phe Phe Leu Glu Arg Lys Lys Val

85 90 95

Ser Lys Glu Val Gln Val His Phe Gly Glu Asp Met Asp Leu Asp Arg

100 105 110

Met Val Asp Gly Asp Val Thr Asp Gly Glu Trp Tyr Tyr Thr Val Ser

115 120 125

Val Thr Arg Ser Phe Ala Ile Gly Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg Val

130 135 140

Phe Ser Ser Gly Asp Tyr Val Trp Leu Thr Gly Asp His Glu Leu Gln

145 150 155 160

Leu Tyr Glu Cys Glu Arg Val Lys Glu Ala Arg Met His Gly Ile Gln

165 170 175

Thr Leu Val Cys Val Ser Thr Ala Cys Gly Val Val Glu Leu Gly Ser

180 185 190

Ser Asp Leu Ile Lys Glu Asp Trp Ser Leu Val Gln Leu Ala Lys Ser

195 200 205

Leu Phe Gly Pro Val Ile Ala Thr Met Leu Thr Lys Gln Val Asn Leu

210 215 220

Asn Ser Glu Ser Gln Leu Gln Leu Pro Asn Pro Thr Thr Arg Asn Asn

225 230 235 240

Asn Asn Thr Asn Asn Val Ala Pro Leu Leu Asp Ile Gly Met Phe Ser

245 250 255

Gly Ala Gly Ala Pro His His His His His His His His Gln Lys Glu

260 265 270

Trp Ser Leu Glu Glu Asn Ser Lys Gln Gln Thr Arg Glu Val Ser Gly

275 280 285

Asp Val Ile Lys Lys Glu Gln Leu Ala Ala Gly Phe Gly Arg Ser Ser

290 295 300

Ser Asp Ser Gly Pro Ser Asp Ser Asp Gly His Phe Val Ser Gly Phe

305 310 315 320

Thr Asp Ile Asn Val Thr Ser Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro Thr Ser

325 330 335

Gly Arg Glu Ser Pro Leu Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg Arg

340 345 350

Glu Arg Leu Asn His Arg Phe Tyr Ala Leu Arg Ser Val Val Pro Asn

355 360 365

Val Ser Lys Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu Ala Asp Ala Val Ala Tyr

370 375 380

Ile Lys Glu Leu Arg Ala Lys Val Asp Glu Leu Glu Ala Lys Leu Arg

385 390 395 400

Glu Gln Ala Arg Lys Ser Lys Val Val Tyr Asn Val Tyr Asp Asn Asn

405 410 415

Gln Ser Thr Gly Ser Thr Ile Met Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Thr

420 425 430

His His Leu Gly Ile Asn Ile Asn Ile Met Asp Val Asp Val Lys Ile

435 440 445

Val Gly Ser Glu Ala Met Ile Arg Val Gln Cys Pro Asp Ile Asn Tyr

450 455 460

Pro Ala Ala Lys Leu Met Asp Val Leu Arg Asp Leu Glu Phe His Val

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His His Ala Ser Val Ser Ser Val Arg Glu Thr Met Leu Gln Asp Val

485 490 495

Val Val Arg Ile Pro Glu Gly Leu Ile Ser Glu Glu Val Ile Arg Ser

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<212> DNA

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<212> DNA

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tctagattgc tcctctgcta ga 22

Claims

1.一种调控柑橘精油合成的FcMYC2基因或FcMYC2基因编码的蛋白质在调控柑橘精油合成中的应用；

所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柑橘精油源自柑橘属、金柑属或枳属植物。

3.权利要求1所述的FcMYC2基因或其编码的蛋白质在调控柑橘精油中单萜合成中的应用。

4.权利要求1所述的FcMYC2基因或其编码的蛋白质在调控柑橘精油中倍半萜合成中的应用。