CN106102451B - 利用源自菠菜的cyp85基因的20-羟基蜕皮激素含量增加的转化植物体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过将包含源自菠菜(Spinacia oleracea)的CYP85(细胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至植物细胞中，以制备与野生型植物相比20‑羟基蜕皮激素含量得以增加的转化植物体的方法；通过上述方法制备的、与野生型植物相比20‑羟基蜕皮激素含量得以增加的转化植物体及其种子；包含编码所述源自所述菠菜CYP85蛋白质的基因作为有效成分的、用于增加植物体的20‑羟基蜕皮激素含量的组合物；通过将包含源自菠菜CYP85蛋白质编码基因的重组载体转化至植物细胞中来制备耐虫性得到提高的转化植物体的方法；通过所述方法制备的耐虫性得到提高的转化植物体及其种子；以及包含编码所述源自菠菜CYP85蛋白质的所述基因作为有效成分的、提高植物体的耐虫性的组合物。

Description

利用源自菠菜的CYP85基因的20-羟基蜕皮激素含量增加的转 化植物体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用源自菠菜的CYP85基因的制备20-羟基蜕皮 激素(20-hydroxyecdysone)含量增加的转化植物体的方法及其植物 体，更详细地，涉及通过将包含源自菠菜(Spinacia oleracea)的C YP85(细胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至 植物细胞中，以制备与野生型植物相比20-羟基蜕皮激素含量得以增 加的转化植物体的方法；通过上述方法制备的、与野生型植物相比2 0-羟基蜕皮激素含量得以增加的转化植物体及其种子；包含编码源自 所述菠菜CYP85蛋白质的基因作为有效成分的、用于增加植物体的 20-羟基蜕皮激素含量的组合物；通过将包含源自菠菜CYP85蛋白质 编码基因的重组载体转化至植物细胞中来制备耐虫性得到提高的转 化植物体的方法；通过所述方法制备的耐虫性得到提高的转化植物体 及其种子；以及包含编码源自所述菠菜CYP85蛋白质的基因作为有 效成分的、提高植物体的耐虫性的组合物。
背景技术
蜕皮激素(ecdysteroids)是调节昆虫蜕皮的类固醇性激素，195 4年由布坦那德(Butenanadt)和卡尔森(Karlson)首次提出。之后， 1966年中西(NaKanishi)和枝裕和(Koreeda)首次在植物中发现了 蜕皮激素。蜕皮激素作为2,3,14-三羟基-7-酮类固醇的1组，是属于 包括公知的蜕皮甾酮(ecdysterons)或蜕皮激素(ecdysones)等的多 羟基化类固醇类的化合物。虽然还未能完全知道这些化合物在植物中 的作用，但众所周知的是蜕皮激素的部分衍生物对植物开花(flower ing)产生影响。并且，已知植物蜕皮激素对部分非适应植食性昆虫 (non-adapted phytophagous insect)具有限制摄食、驱虫和杀虫等效果，从而影响植物的防御机制。
另一方面，细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)是包含在 多种植物中并具有亚铁血红素(heme)结构的酶，其不仅存在于植物 中，而且在细菌、真菌以及哺乳动物中均可发现。据报道，P450基 因具有很多同族种类，尤其在某些植物中细胞色素P450基因占整个基因组(genome)的1％左右，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也 有246个细胞色素P450基因和26个假(Pseudo)细胞色素P450基 因。已知这些细胞色素在植物体内参与植物激素的生物合成反应，或 者作为信号传导分子或防御反应的因素而发挥作用。并且，已知这些细胞色素还参与称之为植物生长调节剂的生长素(auxins)、赤霉素(g ibberellins)、茉莉酸(jasmonic acid)、油菜素内酯(brassinosteroids) 的生物合成路径，而且还参与类苯基丙烷(phenylpropanoids)、生物 碱(alkaloids)、萜类化合物(terpenoids)、脂质(lipids)、生氰糖苷 (cyanogenic glycosides)、芥子油甙(glucosinolates)等植物天然物 质的生物合成路径。尤其是细胞色素P450基因增加对真菌、细菌、 昆虫或哺乳动物的攻击等外部刺激的表达，并诱导植物防御反应相关 物质的合成。基于这种情况，细胞色素P450可实际应用在通过研究 和理解相关基因及信号传导体系，从而开发抗病性得到提高的生物工 程植物当中，或者作为抗病基因材料而实际应用于分子育种技术中。
另一方面，韩国授权专利第0834380号中公开了使用源自拟南芥 CYP78A7的“提高植物的耐旱性的细胞色素P450基因”，韩国授权 专利第1256277号中公开了“参与对病原体的抵抗性反应的辣椒的细 胞色素P450基因(CaCYP450A)及利用该基因的转化抗病性植物体”， 但并没有公开本发明中涉及的利用源自菠菜的CYP85基因的20-羟基 蜕皮激素含量得以增加的转化植物体的制备方法及其植物体。
发明内容
要解决的技术问题
本发明是根据上述要求而完成的，在本发明中，制备了过表达源 自菠菜CYP85编码基因的转化植物体，并确认了与非转化植物体相 比，转化植物体内的20-羟基蜕皮激素含量得以增加的事实，从而完 成了本发明。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供一种转化植物体的制备方 法，与野生型植物相比，所述转化植物体的20-羟基蜕皮激素含量得 以增加，其中，所述制备方法包括以下步骤：将包含源自菠菜CYP8 5(细胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至植物 细胞中；以及由被转化的所述植物细胞再分化植物。
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的、与野生型植物相比 20-羟基蜕皮激素含量得以增加的转化植物体及其种子。
并且，本发明提供一种用于增加植物体的20-羟基蜕皮激素含量 的组合物，所述组合物包含编码所述菠菜CYP85蛋白质的基因作为 有效成分。
并且，本发明提供一种相比于野生型植物增加植物体的20-羟基 蜕皮激素含量的方法，所述方法包括将包含源自菠菜的CYP85(细 胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至植物细胞 中，以过表达CYP85基因的步骤。
并且，本发明提供一种耐虫性得到提高的转化植物体的制备方 法，所述制备方法包括以下步骤：将包含源自菠菜的CYP85(细胞 色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至植物细胞中； 以及由上述被转化的所述植物细胞再分化植物。
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的耐虫性得到提高的转 化植物体及其种子。
并且，本发明提供一种用于提高植物体耐虫性的组合物，所述组 合物包含编码所述菠菜CYP85蛋白质的基因作为有效成分。
有益效果
在本发明中，通过过表达源自菠菜CYP85蛋白质编码基因，确 认了植物体内的20-羟基蜕皮激素含量得以增加。20-羟基蜕皮激素对 部分害虫具有阻碍及躲避摄食、杀虫等效果，因此，可通过使用本发 明的菠菜CYP85蛋白质编码基因来研发出耐虫性得到提高的农产 品，以及利用增加的20-羟基蜕皮激素的防虫组合物，因而本发明具 有工业实用性。
附图说明
图1是本发明的包含源自菠菜CYP85蛋白质编码基因的重组载 体pB7WG2D，1的模式图。
图2是表示通过体外组织培养和转化而确保的菠菜植物体，为非 转化野生型对照区(左，野生型植物(wild type plant))和菠菜CYP85 基因过表达转化植物体(右，转化植物体(transgenic plant))的照片。
图3表示利用基因组DNA对转化植物体的菠菜CYP85基因是否 被导入进行PCR分析的结果。SoCYP85：菠菜CYP85基因；p35S-S oCYP85：重组载体内的启动子和导入基因的部位；EGFP：报告基因； W：对照区野生型菠菜；P：含有菠菜CYP85基因的植物表达载体阳 性对照区；1～3：转化菠菜。
图4表示确认转化植物的菠菜CYP85基因的表达是否增加的逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果。SoCYP85：菠菜CYP85基因； p35S-SoCYP85：重组载体内的启动子和导入基因的部位；EGFP：报 告基因；W：对照区野生型菠菜；P：含有菠菜CYP85基因的植物表 达载体阳性对照区；1～3：转化菠菜。
图5是利用液相色谱质谱联用(LC/MS/MS)来分析野生型菠菜 和CYP85基因过表达转化菠菜的20-羟基蜕皮激素含量的色谱图。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供提供一种转化植物体的制备 方法，与野生型植物相比，所述转化植物体的20-羟基蜕皮激素含量 得以增加，其中，所述制备方法包括以下步骤：将包含源自菠菜CY P85(细胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因的重组载体转化至植 物细胞中；以及由被转化的所述植物细胞再分化植物。
本发明的CYP85蛋白质的范围包括具有以SEQ ID NO：2表示 的氨基酸序列的蛋白质和所述蛋白质的功能性等同物。"功能性等同 物"是指在添加、取代或者缺失氨基酸的情况下，与以所述SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列至少具有70％以上的序列同源性，优选具有80％以上的序列同源性，更优选具有90％以上的序列同源性，再优 选具有95％以上的序列同源性，即与以SEQ ID NO：2表示的蛋白 质质表现出实质上相同的生理活性的蛋白质。"实质上相同的生理活 性"是指调节植物体的20-羟基蜕皮激素含量的活性。
并且，本发明提供编码所述CYP85蛋白质的基因。本发明的基 因可包括SEQ IDNO：1所示的碱基序列。并且，所述碱基序列的 同源体包含在本发明的范围内。具体地，所述基因可包括与SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％以上的序列同源性，优选具有80％以上 的序列同源性，更优选具有90％以上的序列同源性，再优选具有95 ％以上的序列同源性的碱基序列。对于核苷酸的"序列同源性的％"是 通过比对两个以最适方式排列的序列和比较区域来确定出的，比较区 域中的核苷酸序列的一部分与两序列的最佳排列的参考序列(不包括 附加或删除)相比，可包括添加或删除(即，缺口(gap))。
术语“重组”是指细胞复制异构核酸或表达上述核酸或表达由肽、 异构肽或异构核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能将在上述细胞的 天然形态中未被发现的基因或者基因片段表达为正义引物或者反义 引物形态中的一种。而且，重组细胞可以表达从天然状态的细胞中发 现的基因，但上述基因是发生变异的，是通过人为手段再导入至细胞 内的基因。
本发明的上述CYP85基因序列可以插入到重组表达载体内。术 语“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母菌质粒、植物细胞病 毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。大体上而言，任意的质粒及载体 只要在宿主内能够复制及稳定，均可使用。上述表达载体的重要特性 在于，具有复制原点、启动子、标记基因及翻译控制元件(translatio n controlelement)。
通过本领域技术人员公知的方法可以构建包括CYP85基因序列 及合适的转录/翻译调节信号的表达载体。上述方法包括试管内重组D NA技术、DNA合成技术及活体内重组技术等。为了引导mRNA的 合成，上述DNA序列可以有效地连接到表达载体内的合适的启动子上。而且，表达载体可以包括作为翻译起始部位的核糖体结合部位及 转录终止子。
本发明的重组载体的优选例为Ti-质粒载体，其存在于根癌农杆 菌(Agrobacterium tumefaciens)等合适的宿主中时，能够将其自身的一 部分，所谓的T-区域转移到植物细胞中。其它类型的Ti-质粒载体(参 照EP0116718B1号)目前用于将杂合DNA序列转移至原生质体中， 所述原生质体可以通过将植物细胞或杂合DNA适当地插入到植物的 基因组内，从而生产新的植物。Ti-质粒载体最优选的形态是EP0120 516B1号及美国专利第4,940,838号中要求保护的所谓的双元(bina ry)载体。能够将本发明的DNA导入到植物宿主中的其它适合的载 体可以选自源自双链植物病毒(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV))及单链病毒、双粒病毒等的病毒载体，例如可以选自非完整性植物病 毒载体。这些载体的使用对难以适当地转化植物宿主时尤其有利。
表达载体优选含有一个以上的选择性标记。上述标记作为具有能 够用常规化学方法筛选出的特性的核酸序列，包括能将转化细胞从非 转化细胞中区分出来的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或 草丁膦(phosphinothricin)等除草剂抗性基因、卡那霉素(kanamyci n)、G418、博来霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因，但并不限定于此。
在本发明的重组载体中，启动子可以是CaMV 35S、肌动蛋白、 泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子，但不限于此。术语“启动子” 是指始于结构基因的DNA上游区域，是RNA聚合酶为了启动转录 而结合的DNA分子。“植物启动子”是指能在植物细胞中启动转录的 启动子。“组成型(constitutive)启动子”是指在大部分的环境条件及生 长状态或者细胞分化条件下具有活性的启动子。由于转化体的筛选能 够在各阶段、通过各种组织形成，因此本发明优选使用组成型启动子。 并且，不限制组成型启动子的选择可能性。
在本发明的重组载体中，可以使用通常使用的终止子，例如胭脂 碱合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmy1A终止子、菜豆碱(phaseoli ne)终止子、根癌农杆菌的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等，但 不限定于此。关于终止子的必要性，一般被认为是这些区域能促进植物细胞内转录的确定性及效率。因此，在本发明的内容中使用终止子 是非常适合的。
植物的转化是指将DNA转移到植物的任意方法。这些转化方法 不一定需要经过再生及(或)组织培养期。目前，植物种的转化不仅 对于双子叶植物，包括单子叶植物两者的植物种也非常普遍。原则上， 任意的转化方法均可用于将本发明的杂合DNA导入到适当的祖细胞 中。所述方法可选自对于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.e t al.，1982，Nature296，72-74；Negrutiu I.et al.，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.et al.， 1985Bio/Technol.3，1099-1102)、向植物元素的显微注射法(Cross way A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)、各种植物元 素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轰击法(Klein T.M.et al.，19 87，Nature 327，70)、依据植物的浸润、成熟花粉或小孢子转化的 根癌农杆菌介导的基因转移(非完整性)中依据病毒的感染(EP030 1316号)等。本发明的优选方法包括农杆菌介导的DNA传递。尤其 优选的是利用EPA120516号及美国专利第4,940,838号所记载的所谓 双元载体技术的方法。
本发明的方法，包括向本发明的重组载体中转化植物细胞的步 骤，所述转化可由如根癌农杆菌介导。并且，本发明的方法包括由转 化的所述植物细胞中再分化转化植物的步骤。由转化植物细胞再分化 转化植物的方法可使用本领域普通技术人员公知的任意一种方法。
转化的植物细胞需要再分化成全株。本领域公知的用于通过愈伤 组织或原生质体培养再分化成成熟的植物技术有多种(Handbook of Plant Cell Culture(植物细胞培养手册)，1-5卷，1983-1989Momill an，N.Y.).
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的与野生型植物相比2 0-羟基蜕皮激素含量得以增加的转化植物体及其种子。
作为本发明的一个具体实施例，所述植物体可以是如拟南芥、马 铃薯、茄子、烟草、辣椒、番茄、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗、菠菜、 甜菜、红薯、芹菜、胡萝卜、水芹、香菜、白菜、卷心菜、萝卜(R aphanus sativus for.raphnistroides MAK)、西瓜、香瓜、黄瓜、南瓜、 葫芦、草莓、大豆、绿豆、菜豆、豌豆等双子叶植物，或者是如水稻、 大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦、洋葱等单子叶植物，优选为 双子叶植物，更优选地，可以是格梅林滨藜(Gmelin'ssaltbush)、戟 叶滨藜、subcordata Kitag滨藜(Atriplex subcordata Kitag)、甜菜、 糖用甜菜、碱蓬、南方碱莲、七面草、裸花碱蓬、地肤、铺地藜、杂 配藜、土荆芥、小藜、戟叶滨藜、灰藜、白藜、无翅猪毛菜、菠菜、 盐角草、华虫实等藜科(Chenopodiaceae)植物，再优选地，可以是 菠菜，但不限于此。
并且，本发明提供一种用于增加植物体的20-羟基蜕皮激素含量 的组合物，该组合物包含编码CYP85蛋白质的基因作为有效成分。 所述组合物含有编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的YP85 蛋白质的基因作为有效成分，并通过将所述基因转化至植物体，从而 能够增加植物体的20-羟基蜕皮激素含量。
并且，本发明提供一种与野生型植物相比增加植物体的20-羟基 蜕皮激素含量的方法，该方法包括将包含源自菠菜CYP85蛋白质编 码基因的重组载体转化至植物细胞，从而过表达CYP85基因的步骤。
并且，本发明提供一种耐虫性得到提高的转化植物体的制备方 法，其包括以下步骤：将源自菠菜CYP85(细胞色素P450，85家族) 蛋白质编码基因的重组载体转化至植物细胞中；以及由上述被转化的 植物细胞再分化植物。
本发明的“耐虫性”是指植物对虫害表现出的抵抗性和耐性，包括 对寄生植物的害虫的偏好性的阻止、对于害虫的宿主的生长阻碍性， 通过强的补偿力和恢复力而表现出的不受虫害影响的耐性等。
本发明的包含源自菠菜CYP85蛋白质编码基因的重组载体转化 的植物体的20-羟基蜕皮激素含量将会增加，其中，众所周知的是20 -羟基蜕皮激素对部分害虫具有限制摄食、驱虫和杀虫等效果，因此 包含源自菠菜CYP85蛋白质编码基因的重组载体转化的植物体可受 增加的20-羟基蜕皮激素的影响而提高耐虫性。
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的耐虫性得到提高的转 化植物体及其种子。
本发明的所述植物体如前所述。
并且，本发明提供一种用于提高植物体的耐虫性的组合物，所述 组合物包含编码CYP85蛋白质的基因作为有效成分。本发明的组合 物包含由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的CYP85蛋白质编码基 因作为有效成分，并通过将所述CYP85蛋白质编码基因转化至植物 体并表达，从而可提高植物体的耐虫性。
下面，通过实施例详细地说明本发明。但是，下述实施例只是为 了例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1：菠菜CYP85基因的克隆及制备植物表达载体
CYP85(细胞色素P450，85家族)蛋白质编码基因是从菠菜进 行克隆的。克隆的CYP85基因是利用网间通路系统(gateway syste m)插入至植物表达载体pB7WG2D，1中。CYP85基因的表达是通 过35S启动子来调节的，使用EGFP基因作为报告基因，并使用棒(bar)基因作为选择标记(图1)。
实施例2.制备转化植物体
在无菌发芽菠菜(冬性品种)的根部，使用添加有5μMα-萘乙 酸(NAA，α-naphthalene acetic acid)、10μM 6-苄基腺嘌呤(BA，b enzyladenine)以及0.3μM赤霉酸(GA3，gibberellic acid)的1/2MS (20g/l蔗糖、2.5g/l结冷胶(gellan gum)，pH6.0)培养基诱导愈伤 组织。被诱导的愈伤组织在添加有20μM NAA、1μM BA及0.3μM GA3的1/2MS(20g/l蔗糖、2.5g/l结冷胶，pH 6.0)培养基中，以3 周为间隔进行传代培养，并维持这种方式。
为了制备转化植物体，首先提前3～7天将愈伤组织移至添加有2 0μM NAA、5μM BA和0.3μM GA3的1/2MS(20g/l蔗糖、2.5g/l 结冷胶，pH 6.0)培养基中，然后在转化当天移至滤纸上，以去除水 分。转化是以EHA105农杆菌菌株为介导，导入有靶基因的农杆菌的 感染是将所述农杆菌悬浮在没有钙离子的1/2MS(20g/l蔗糖、100μ M乙酰丁香酮(acetosyringone)，pH6.0)培养基中，以使OD300＝0. 2，然后在该培养基中浸渍一定量的所述愈伤组织，并静置约30分钟， 然后回收愈伤组织并在滤纸上干燥3～5分钟，并重新浸渍到包含所述 农杆菌的培养基中，静置3～5分钟。然后，回收愈伤组织，在滤纸上 干燥3～5分钟后，使用没有钙离子的1/2MS(20g/l蔗糖、100μM乙 酰丁香酮，pH5.4)培养基，并在黑暗条件下进行4天的共培养。
进行共培养后，将愈伤组织浸渍在添加有1mM头孢噻肟(cefot axime)的1/2MS溶液中保持30分钟后，使用滤纸进行干燥，并移至 添加有20μM NAA、5μM BA和0.3μM GA3的1/2MS(20g/l蔗糖、 2.5g/l结冷胶、250μM头孢噻肟、5μM草丁瞵(PPT，phosphinothrici n)，pH6.0)筛选培养基中，以20～10小时的光照条件和16～14小时 的黑暗条件进行为期4周的培养，对转化的愈伤组织进行1次筛选。 在将PPT浓度提高5倍的相同的培养基中对从筛选培养基中1次筛 选出的愈伤组织进行了2次筛选，并在2～4周后确认EGFP基因的表 达，由此筛选最终转化的愈伤组织。
将最终筛选的愈伤组织在添加有10μM NAA及0.3μM GA3的1 /2MS(20g/l蔗糖、2.5g/l结冷胶、250μM头孢噻肟，pH6.0)培养基 中培养4～8周，然后筛选形成根部的愈伤组织并移至添加有2μM N AA及5μM BA的1/2MS(20g/l蔗糖、3g/l结冷胶，pH6.0)培养基 中，以诱导体细胞胚的形成。对从体细胞胚中获得的小植物体，重新 确认了EGFP基因的表达，并筛选转化植物体后，移至1/2MS(20g/ l蔗糖、8g/l琼脂，pH6.0)培养基中培养成植物体(图2)。将在体外 分化成完整植物体的菠菜移至土壤中，并在一定期间保持高湿度，同 时经过驯化过程后，培养成成熟的植物。对照区植物体是通过实施除 农杆菌感染和转化体筛选过程以外的其它相同过程而制备的。
实施例3.转化植物体的导入基因的确认及表达分析
转化菠菜的CYP85导入基因的确认是通过提取转化植物体和对 照区植物体的DNA后实施PCR而分析的。PCR分析时使用的引物 共为3对，第一个是能够扩增CYP85导入基因的一部分的引物(so CYP85-F；5'-(GCTGGTATTGAATCAAGCTC)-3'；SEQ ID NO：3， soCYP85-R；5'-(GGTACTTGACAGCCATCATT)-3'；SEQ ID NO： 4)，第二个是能够扩增导入基因时使用的重组载体的35S启动子部位 和CYP85基因之间的一部分的引物(P35S-SoCYP85-F；5'-(TTCGCAAGACCCTTCCTCTA)-3'；SEQ ID NO：5，P35S-SoCYP85-R； 5'-(CTAATAACTCGAAACTCGAATGC)-3'；SEQ ID NO：6)，第 三个是能够扩增导入基因时用作报告基因的EGFP基因的一部分的 引物(EGFP-F；5'-(TCTTTTTCATCTTTTCACTTCTCC)-3'；SEQ IDNO：7，EGFP-R；5'-(TGATATAGACGTTGTGGCTGTTG)-3'； SEQ ID NO：8)。在本发明中对3种转化菠菜(编号：85201、8502 03和853282)是否导入了CYP85基因进行了确认。
结果为，CYP85基因在非转化对照区检测出0.4kb大小的一个条 带，而在转化菠菜中的0.3～0.4kb之间检测出了两个条带。基于将本 发明中使用的重组载体用作阳性对照区实施PCR的结果，确认了0. 4kb条带是菠菜原有的CYP85基因的大小，0.3kb大小的条带是导入 的基因被扩增而显示出的条带(图3)。基因大小差异是因为导入基 因不存在内含子部位所引起的，从导入基因时使用的35S启动子和使 用可扩增CYP85基因之间的引物(SEQID NO：5和6)进行的结 果来看，在非转化对照区中并没有确认到基因扩增，而在转化菠菜及 阳性对照区中能够确认到扩增产物(图3)。并且，对报告基因EGFP 的导入与否进行了确认，其结果为在非转化对照区中并没有检测出报 告基因，而在转化菠菜中均检测出了报告基因。与所述PCR分析相 同地，利用3种转化菠菜(编号：85201、850203和853282)进行了 分析。
对于确认导入了CYP85基因的转化菠菜，在RNA水平上对导入 基因的表达是否增加的情况进行了确认。为此，提取出转化植物体和 对照区植物体的总RNA，然后进行RT-PCR分析。RT-PCR分析中使 用的引物有3对，第一个是能够扩增CYP85基因的一部分的引物(SEQ ID NO：3和4)，第二个是能够扩增基因导入时用作报告基因的 EGFP基因的一部分的引物(SEQ ID NO：7和8)，第三个是能够扩 增可成为评价靶基因表达增减的标准的基因，即环亲合素(Cyclophi lin,CYC)的一部分的引物(CYC-F；5'-(GATGTTACCCCCAAAAC TGCT)-3'；SEQ ID NO：9，CYC-R；5'-(AACAACATGCTTTCC ATCCAG)-3'；SEQ ID NO：10)。
其结果可以确认到，对于非转化对照区和3种转化植物体，各样 品的CYC基因表达表现出同一水平，然而，对于被导入的CYP85基 因，相比非转化对照区，其在3种转化菠菜中的表达水平得以增加。 并且，在转化菠菜中均确认到报告基因EGFP的表达(图4)。
基于上述结果，本发明的3种转化菠菜均含有导入的CYP85基 因，从DNA水平上来看，能够确认，在被确认为导入了CYP85基因 的3种转化菠菜中该基因的表达相比非转化对照区得以增加。
实施例4.转化植物体的20-羟基蜕皮激素(20E)含量分析
对被确认为导入了所述CYP85基因的转化植物体中的20-羟基蜕 皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)的含量变化进行分析。非转化对 照区及转化植物体的20E提取是通过以下方法进行的。即，使用5、 2.5、2.5ml甲醇对约50mg的干燥样品进行3次提取，然后在提取物 中添加2.5ml的水，并使用10ml的己烷进行2次相分配，收集甲醇/ 水层后进行浓缩，然后使用500μM甲醇进行再溶解，以用作20E分 析样品，而提取物的20E含量分析是利用LC/MS/MS进行的。本发 明的用于20E含量分析的LC/MS/MS条件如下表1所示。
[表1]
20E含量的分析结果为，对照区植物体的20E平均含量约为μg/ 干重g，而转化植物体约为290μg/干重g，从而可以确认平均约增加 了3倍左右，而且在3种转化植物体中还确认到相比对照区20E的含 量最大增加了5倍的转化体(图5)。
通过上述结果，可知利用源自菠菜CYP85基因的转化植物体中 的20-羟基蜕皮激素(20E)含量得以增加。
工业实用性
本发明中，通过过表达源自菠菜CYP85蛋白质编码基因，确认 了植物体内的20-羟基蜕皮激素含量得以增加。20-羟基蜕皮激素对部 分害虫具有限制摄食、驱虫和杀虫等效果，因此，可使用本发明的菠 菜CYP85蛋白质编码基因，研发出耐虫性得到提高的农产品，以及 利用增加的20-羟基蜕皮激素的防虫组合物，因而，能够有效地应用 于工业中。

Claims (5)

1.一种转化菠菜的制备方法，与野生型菠菜相比，所述转化菠菜的20-羟基蜕皮激素含量得以增加，其中，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的源自菠菜(Spinacia oleracea)的CYP85蛋白质的基因的重组载体转化至菠菜细胞中；以及由被转化的所述菠菜细胞再分化菠菜。
2.编码由SEQ ID NO：2氨基酸序列构成的CYP85蛋白质的基因在增加菠菜的20-羟基蜕皮激素含量中的应用。
3.一种相比于野生型菠菜增加菠菜的20-羟基蜕皮激素含量的方法，所述方法包括将包含编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的源自菠菜的CYP85蛋白质的基因的重组载体转化至菠菜细胞中，以过表达CYP85基因的步骤。
4.一种耐虫性得到提高的转化菠菜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的源自菠菜的CYP85蛋白质的基因的重组载体转化至菠菜细胞中；以及由被转化的所述菠菜细胞再分化菠菜。
5.编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的CYP85蛋白质的基因在提高菠菜耐虫性中的应用。
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