KR100795365B1

KR100795365B1 - 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 유전자

Info

Publication number: KR100795365B1
Application number: KR1020070013549A
Authority: KR
Inventors: 최동수
Original assignee: 군산대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-01-17

Abstract

본 발명은 식물의 환경 스트레스 저항성 생장조절 유전자 CYP707A5 및 CYP707A6, 그 유전자로 암호화된 ABA 8'-히드록실라제의 활성에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 벼 (Oryza sativa L.) 유래의 ABA 8'-히드록실라제를 암호화하는 시토크롬 P450 CYP707A 유전자군의 하나인 CYP707A5 및 CYP707A6 유전자를 분리하고, 상기 유전자의 발현패턴, 그 유전자로 발현된 효소활성, 재조합 CYP707A5 및 CYP707A6 단백질의 활성, 호르몬과 다양한 스트레스 처리에 따른 상기 유전자의 발현패턴에 관한 것이다. 본 발명의 CYP707A5 또는 CYP707A6 유전자를 이용하면 한발, 저온등과 같은 환경 스트레스 저항성 조절유전자를 포함하는 벡터를 식물체에 도입하여 발현을 임의로 조절함으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시켜 식물 생장과 발달을 유도하는 효과가 있다.

환경 스트레스, CYP707A5, CYP707A6, ABA 8'-히드록실라제

Description

식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 유전자{Gene for increasing environmental-stress resistance of plant}

도1은 심수벼(deepwater rice)의 줄기신장에 있어 에틸렌 효과를 나타낸 결과이다.

A: 에틸렌 처리에 따른 줄기부의 생장.

B: 에틸렌 처리에 따른 심수벼(deepwater rice) 절간에서 ABA 및 PA 함량.

도2는 효모 세포와 정제된 마이크로좀을 이용한 실험에서 ABA 대사로부터 얻어진 반응 생성물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.

A: CYP707A5 또는 CYP707A6 단백질이 발현된 효모 세포에서 대사되어진 ABA 반응산물의 HPLC 측면도.

B: CYP707A5 또는 CYP707A6 단백질이 발현된 효모 세포로부터 분리한 마이크로좀을 이용한 반응 시스템에서 생성된 ABA 반응산물의 HPLC 측면도.

도3은 다양한 호르몬을 처리했을 때 감응하는 ABA 8'-히드록실라제를 암호화하는 심수벼 CYP707A 유전자들의 발현패턴을 노던 블롯으로 분석한 결과이다.

A: 에틸렌 처리에 따른 유전자의 발현패턴.

B: GA₃ 처리에 따른 유전자 발현패턴.

C: ABA 처리에 따른 유전자 발현패턴.

도4는 CYP707A 유전자의 발현패턴을 노던 블롯으로 분석한 결과이다.

A: 스트레스에 반응하는 심수벼 CYP707A 유전자의 발현패턴.

B: 심수벼에서 CYP707A 유전자 기관-특이적인 발현패턴.

1. 뿌리; 2. 지중경; 3. 자엽초; 4. 일차엽; 5. 절간분열조직이 포함된 맨 위의 절간부분; 6. 묘조정단분열조직이 포함된 맨위의 마디; 7. 생장중인 잎.

본 발명은 벼 유래 환경 스트레스 저항성 조절 유전자인 CYP707A5 및 CYP707A6을 분리하고, 상기 유전자의 식물체 부위별 발현패턴을 확인하였다. 또한 상기 유전자로 암호화된 ABA 8'-히드록실라제 단백질의 활성 측정, 다양한 스트레스와 호르몬에 의해 유도된 CYP707A5 또는 CYP707A6 유전자의 발현패턴으로부터 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 예측할 수 있다.

환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생 산성을 제한하는 요소로서 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.

한편 식물은 이러한 수분 스트레스에 대한 방어기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 지금까지 수분 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되어졌으며 (Skriver and Mundy, Plant Cell., 2, 1990, 503-512; Pih et al., Mol Cells. 9, 1998, 84-90; Anderberg and Walker-Simmons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1993, 10183-10187; Mizoguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, 765-769), 수분 스트레스에 대한 반응 유전자들의 발현을 유도하는 다양한 신호 전달 경로로는 ABA-의존성 경로 또는 ABA-비의존성 경로를 포함하고 있음이 밝혀졌다 (LaRosa et al., Plant Physiol. 85, 1987, 174-181; Savoure et al., Mol. Gen. Genet. 254, 1997, 104-109).

최근에는 저온 스트레스에 대한 식물의 내성 발달과 관련된 연구가 많이 진행되어지고 있는데, Cao등은 애기장대로부터 저온 스트레스 조절에 관여하는 GIGANTEA(G1) 유전자의 기능을 분석하여 보고하였다 (Cao et al, Plant Cell Rep. 24, 2005, 683-690).

한편, 심수벼(deepwater rice)는 열대 몬순 기후지역에서 주로 재배되는 벼로 동남아시아와 아프리카 사람들의 주요한 자급용 농작물이다. 이 품종은 부분적인 침수 시에도 빠르게 줄기생장을 할 수 있어 불어나는 물속에서도 생장하는 능력을 가지고 있다 (Stunzi J.T and Kende H, Plant Cell Physiol. 30, 1998, 49-56). 이러한 빠른 줄기 성장은 절간사이에서 분비되어지는 호르몬의 변화에 기인한다.

식물 호르몬은 식물의 생장을 자극하거나 저해하거나 하며 또는 어떠한 생장 프로그램을 조절하는 시그널로서 작용하는 천연에 존재하는 물질이고, 극소량으로도 상당히 유효하다. 일반적으로 식물 호르몬으로서 인식되고 있는 물질로서는 옥신류(auxins), 지베렐린류(gibberellins), 사이토카이닌류(cytokinins), 앱시스산(abscisic acid), 부라시놀라이드(brassinolide) 및 에틸렌(ethylene)을 들 수 있다.

앱시스산 (abscisic acid)는 두 그룹의 독립된 연구에 의해 발견되어졌다. 1963년 Ohkuma 등은 목화의 미숙종자의 낙과를 촉진시키는 화합물로 발견하였으며 Wareing등은 목본과 식물의 휴면에 관여하는 화합물을 단리한 결과 이 두 화합물이 동일한 구조로 판명되어졌다. 구조가 확인된 이후 ABA의 생리작용, 식물계의 분포, 생합성 및 대사, 유도체의 합성 등에 관한 합성 및 생리활성분야의 많은 연구가 보고되었다.

지베렐린(GA)은 당초, 1920년대에 일본인 식물 병리학자에 의해 식물독소로서 발견되었다. 식물 병원성 진균인 지베렐라(Gibberella fujikuroi)는 벼과식물에 감염되어 병리적인 길이 방향의 생장을 일으키는 화학물을 분비한다. 1935~1938년 사이에 이 화합물이 단리되고, 활성 물질이 결정화되어 이것을 「지베렐린」이라고 불리게 되었다. 이후 연구에 의해 GA가 고등식물에 의해서도 생성되고, 생장의 조절과 분화 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다.

식물의 생장을 조절하는 물질로서 작용하는 ABA 와 GA는 종자의 발아, 줄기의 신장, 개화 그리고 결실등의 다양한 생장 프로세스를 조절한다. 한편, 침수는 절간에서 에틸렌 양의 증가를 유도하고 그 결과로 ABA(abscisic acid)와 GA(지베렐린 gibberellin A)의 양에도 확실한 변화가 일어나게 된다. 에틸렌 양의 증가는 결과적으로 ABA의 감소 및 GA함량의 증가되는 것에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다 (Kende H. et al., Plant Physiol. 118 (1998) 1105-1110).

심수벼의 생리ㆍ생화학적인 연구 결과에 따르면 부분적인 침수나 에틸렌 처리가 ABA 양을 75%나 감소시키고, GA 수준을 네 배나 증가시키며 그 결과로 인해 줄기생장이 초래되어진다고 보고하고 있다 (Hoffmann-Benning S and Kende H, Plant Physiol. 99, 1992, 1156-1161). 이러한 결과는 침수 또는 에틸렌으로부터 유도된 줄기생장이 ABA 및 GA 대사와 밀접한 관련이 있다는 것을 의미한다. 그러나 빠른 줄기생장을 유도하는 생리적인 현상에 대한 분자생물학적 메카니즘은 거의 알려져 있지 않다. 한편, 보고된 문헌에 의하면 소리쟁이류 식물(Rumex palustris)에서 침수는 ABA 생합성 효소 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 증명하였다 (Benschop J. J.et al., Plant J. 44, 2005, 756-768). 이러한 연구는 식물세포에서 내인성 ABA 수준이 식물의 생장과 발달을 조절하는 중요한 요인이라는 것을 의미한다.

내인성 ABA 수준은 식물의 생장과 발달에 있어 생합성 뿐만 아니라 대사작용을 조절한다. ABA의 일차적인 대사 산물중의 하나인 phaseic acid(PA)은 ABA로부터 시토크롬 P450 모노옥시게나제, ABA 8'-히드록실라제에 의해 8‘-위치가 히드록실화된 화합물이다. 최근 보고된 문헌에 의하면, 애기장대 유래 ABA 8'-히드록실라제를 암호화하는 시토크롬 P450 CYP707A 유전자를 분리하고 이들 유전자의 기능을 규명하였다 (Kushiro T. et al., EMBO J. 23, 2004, 647-656; Saito S. et al., Plany Physiol. 134, 2004, 1439-1449). 또한 벼 유전체의 해독을 통해 벼 게놈에서 시토크롬 P450 유전자군의 분류가 완성되었다 (http://drnelson.utmem.edu/ricefams.html).

상기와 같은 종래 기술을 바탕으로, 식물의 환경 스트레스 저항성 조절인자를 연구하던 중, 본 발명자들은 벼 (Oryza sativa L.) 유래의 ABA 8'-히드록실라제에 의해 환경 스트레스 저항성이 증가되어져 식물생장이 조절되는 것을 발견하고, 상기 단백질을 코딩하는 CYP707A5 및 CYP707A6 유전자를 분리하였다. 또한 상기 유전자로 코딩된 ABA 8'-히드록실라제 단백질의 활성을 측정하고, 다양한 호르몬 또는 스트레스 처리에 따른 상기 유전자의 발현패턴을 확인하여 환경 스트레스 저항성 조절 유전자로서의 기능을 밝히고, CYP707A 유전자 재조합단백질이 가지는 ABA 8'-히드록실라제의 생화학적 활성을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CYP707A5 유전자, 서열번호 2의 염기서열을 가지는CYP707A6 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 벼(Oryza sativa L.) 유래의 ABA 8'-히드록실라제의 활성에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 효소는 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 벼 유래 재조합 CYP707A5 및 CYP707A6 단백질의 ABA 8'-히드록실라제의 활성을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 호르몬에 의해 유도된 상기 유전자의 발현패턴을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 다양한 스트레스 처리에 따른 상기 유전자의 발현패턴을 제공하며 식물체 기관-특이적인 발현양상을 분석하여 환경 스트레스를 인식하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기의 목적을 달성하기 위하여, 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CYP707A5 유전자, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 CYP707A6 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, CYP707A5 또는 CYP707A6 유전자로 암호화되는 단백질(ABA 8'-히드록실라제)을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CYP707A5 유전자, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CYP707A6 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 CYP707A5 또는 CYP707A6 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 본 발명에 적용될 수 있는 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 바람직하게는 상기 환경 스트레스 저항성 식물체는 벼일 수 있다.

또한 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CYP707A5 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 CYP707A6 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여 환경 스트레스에 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 환경 스트레스를 인식하는 유전자의 발현패턴을 제공하며 벼의 줄기, 잎, 뿌리에서 발현되는 것을 특징으로 하는 식물의 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 벼 유래 재조합 CYP707A5 또는 CYP707A6 단백질의 ABA 8'-히드록실라제의 활성을 제공한다.

또한 본 발명은 다양한 스트레스와 호르몬에 의해 유도되어진 CYP707A5 유전자의 발현패턴을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 “환경 스트레스”는 식물의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말한다. 바람직하게는 상기 환경 스트레스는 한발 스트레스, 저온 스트레스, 염 스트레스이다.

본 발명에서 사용된 용어 “환경 스트레스 저항성”은 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물의 성장 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명에서는 효모를 이용한 분석법 (in vivo, in vitro)으로부터 재조합 단백질의 ABA 8'-히드록실라제 활성을 측정하였다. 이 분석은 심수벼의 CYP707A5 또는 CYP707A6 유전자에 의해 ABA 8'-히드록실라제 효소가 암호화된다는 강력한 생화학적 증거를 제시하였다 (도 2참조). 두 분석법에서, 그 결과들이 명백한 정량성을 보이지는 않았지만 CYP707A5 유전자는 CYP707A6 유전자보다 높은 활성을 가지는 것으로 보여진다 (도 2참조). 효소간의 활성 차이는 두 단백질의 구조적 차이 때문으로 여겨지는데, 계통도에서 CYP707A6 유전자와 근접해 있는 CYP707A4 유전자는 애기장대 유래 CYP707A 유전자군에서 가장 낮은 활성을 가지는 것과 관계가 있는 것으로 보여진다 (Kushiro T. et al., EMBO J. 23, 2004, 647-656; Saito S. et al., Plant Physiol. 134, 2004, 1439-1449). 또한, CYP707A5 및 CYP707A6 단백질은 7‘-히드록실라제 및 9’-히드록실라제의 활성을 나타내지 않고 단지 8'-히드록실라제의 생화학적 기능을 가지는 것으로 보여진다 (data not shown). 적출된 줄기부분은 심수벼의 침수, 에틸렌, GA등에 의하여 매개되는 줄기신장 연구에 주로 사용되어진 다. 왜냐하면 줄기부분의 생장반응이 완전한 심수벼 생장반응과 아주 유사하기 때문이다.

도 1A에서 알 수 있듯이, 지속적인 에틸렌 처리는 줄기신장을 유도하는데 어떤 면에서는 에틸렌을 처리하는 것만으로도 침수처리와 같이 심수벼의 줄기신장을 유도하는 것을 알 수 있다. 또한 에틸렌 처리는 심수벼 절간부의 신장에서 내인성 ABA 수준을 감소시키기 때문에 에틸렌이 ABA 대사 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 어떻게 조절하는지에 대한 이해도 반드시 필요하다. 도 3A에서 보여주는 바와 같이 두개의 CYP707A 유전자에 의해 암호화된 8‘-히드록실라제 중에서 오직 CYP707A5 유전자만이 에틸렌 처리에 감응하여 상향 조절되는 것으로 보여진다. 이런 결과는 CYP707A5 단백질이 에틸렌에 의하여 유도된 줄기신장이 내인성 ABA 수준의 감소와 상관관계가 있다는 것을 의미한다. 또한 도 1B에서 알 수 있듯이 에틸렌 처리에 따른 줄기신장에서 ABA 및 PA 함량의 측정은 이 과정에서 CYP707A5 단백질의 확실한 역할을 증명해준다. CYP707A6 단백질은 에틸렌 처리 전 PA가 높은 함량을 가지는데 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다. 왜냐하면 이 유전자는 에틸렌을 처리하기 전에 더 많이 발현되는 것으로 관찰되어졌기 때문이다.

도 3에서 보여주는 바와 같이 CYP707A5 유전자 발현은 적어도 세 개의 다른 호르몬인 에틸렌, ABA, GA에 의해 조절되어진다. 세 개의 호르몬 중에서 심수벼의 침수 혹은 에틸렌 처리에 의한 줄기 신장에 있어 에틸렌이 CYP707A5 유전자의 발현을 유 도하는데 가장 중요한 호르몬의 역할을 하는 것으로 관찰되었다.

최근 연구에 의하면, 애기장대에서 CYP707A2 유전자는 종자 발아에서 ABA의 빠른 비활성화와 관련이 있으며, CYP707A3 유전자는 스트레스 조건하에서 ABA 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어졌다 (Umezawa T. et al., Plant J. 46, 2006, 171-182). 결과적으로 CYP707As 유전자군을 이루는 각각의 유전자들의 생리적 기능은 매우 다양한 것을 알 수 있다.

본 발명에서는 CYP707A 유전자들의 조절기능을 조사하기 위해 다양한 조건하에서 유전자의 발현패턴을 제공하였다. 도 3에서 보여주는 바와 같이 CYP707A5 유전자는 거의 모든 호르몬이나 스트레스 처리에 감응하는 반면에 CYP707A6 유전자는 거의 반응을 보이지 않았다. 또한 도 4B에서 알 수 있듯이 식물체 기관-특이적인 발현패턴에서도 두 유전자의 발현은 중복되어 관찰되지 않았다. 애기장대의 네 개의 CYP707A 유전자들은 각기 다른 발현패턴을 보이는데 이것은 CYP707A 유전자군의 각각의 유전자가 독자적이고 고유한 기능을 가지며 심수벼의 CYP707A5 유전자는 CYP707A6 유전자보다 생리적인 과정에서 보다 중요한 역할을 하는 것을 의미한다.

본 발명에서 분리된 CYP707A5 및 CYP7807A6 유전자의 연역된 아미노산 서열을 보면, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CYP707A5 유전자는 CYP707A1 유전자와 70% 아미노산 동일성을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CYP707A6 유전자는 단지 59% 동일성을 가진다. 재조합 CYP707A6 단백질은 자포니카형 벼의 cDNA의 연역된 아미노산 서열 (GenBank Accession No. AK120757)과 비교했을 때 심수벼 CYP707A6 단백질의 중간에서 네 개의 글라이신 잔기가 제외되어져 있지만 ABA 8'-히드록실라제 활성을 가지는 것을 알 수 있었다 (도 2 참조).

본 발명을 보다 상세히 설명하기 위하여 이하의 실시예를 기재하나, 본 발명의 권리범위가 그들에 한정되는 것은 아니다.

<실시예1: 식물체의 생장, 에틸렌 처리에 따른 줄기신장>

벼(Oryza sativa L. cv Pin Gaew 56) 식물체는 Stunzi & Kende (1989)의 방법에 따라 생장시켰다 (Lee Y and Kende H, Plant Physiol. 127, 2001, 645-654; Choi D. et al., Plant Cell Physiol. 45, 2004, 897-904).

11-내지 13주간 생장한 심수벼 식물체의 절간분열조직과 연장부가 포함된 맨 위의 절간부 15cm 길이의 줄기부분을 적출하여 밀폐된 원통형의 기체 실린더에 넣어 에틸렌 및 GA 처리에 사용하였다. 이 실린더에 지속적으로 공기를 통과시켜 7시간 전배양하고, 그 이후 공기 또는 5μL/L 에틸렌이 포함된 공기를 50mL/min 유속으로 통과시켰다. 4시간, 12시간, 24시간 처리했을 때 줄기신장을 길이로 측정하였다. 도 1A에서 보면 줄기신장을 측정한 결과 4시간이 경과한 경우는 거의 차이가 없었 지만 처리경과 시간이 12시간, 24시간일 때는 공기만 처리한 경우에 비해 상대적으로 줄기 신장이 각각 4.2배, 7.5배에 증가되어지는 것을 관찰하였다.

<실시예2: 에틸렌 처리에 따른 심수벼 절간에서 ABA 및 PA 함량 측정>

ABA 8'-히드록실라제 활성을 측정하기 위해 줄기부분의 절간분열조직과 연장부를 포함하는 하단부 1-cm를 액체질소로 급냉동 시키고, 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄한 후, 노던 블롯 분석을 실시하여 ABA 및 PA 함량을 측정하였다. 절간에서 ABA 및 PA의 내인성 수준은 공기 또는 5μL/L 에틸렌이 포함된 공기를 50mL/min 유속으로 통과시켜 배양하고 4시간 후 측정한 결과, 도 1B에서 보여 주듯이, 공기를 처리한 부분과 비교했을 때 에틸렌이 포함된 공기를 처리한 경우 내인성 ABA 수준이 37% 감소하였으며 PA 수준은 25% 증가되는 것을 확인하였다.

<실시예3: CYP707A5 및 CYP707A6 유전자 분리 및 효모세포에서 ABA 8'-히드록실라제 활성을 분석하기 위한 발현벡터의 설계>

심수벼의 CYP707A 유전자에 대한 cDNA는 절간에서 분리한 RNA를 재료로 하여 RT-PCR을 수행하여 획득하였다. 구체적으로는 단일가닥 cDNA는 30분간 공기 또는 에틸렌을 처리하여 배양한 줄기부분으로부터 채취한 혼합된 전체 RNA를 이용하여 RT-PCR 방법으로 합성하였다. CYP707A5 및 CYP707A6 유전자의 coding sequence는 94℃ 에서 2분 동안 전처리한 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 68℃에서 90초로 41사이클 반응시킨 후 proof-reading DNA polymerase인 AccuPrime^TM Pfx DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 증폭시켰다. CYP707A5에 대한 정방향 프라이머 HK1224 (서열번호 5)와 역방향 프라이머 HK1225 (서열번호 6), CYP707A6에 대한 정방향 프라이머 HK1247 (서열번호 7)과 역방향 프라이머 HK1230 (서열번호 8) 설계는 인도형 벼종의 시퀀스 데이터베이스로부터 게놈 DNA 시퀀스를 토대로 하였다 (Genbank Accession Nos. AAAA02007218(CYP707A5), AAAA02025750(CYP707A6)).

CYP707A5에 대한 정방향 프라이머 HK1224 (서열번호 5)

5′-CAGGATCCAATGGGTGCTTT-3′

CYP707A5에 대한 역방향 프라이머 HK1225 (서열번호 6)

5′-CGGAATTCACTCCTGCTCGG-3′

CYP707A6에 대한 정방향 프라이머 HK1247 (서열번호 7)

5′-AAGAGCTCACACACATGGCTTTCT-3′

CYP707A6에 대한 역방향 프라이머 HK1230 (서열번호 8)

5′-TAGAATTCAAGCACCTGCTGCTG-3′

PCR로 증폭되어진 cDNA는 효모발현 벡터인 pYeDP60에 클로닝하고 전체 염기서열을 확인하였다 (GenBank Accession No. DQ887714(CYP707A5), DQ887715(CYP707A6)). CYP707A 유전자의 유추된(deduced) 아미노산 서열를 보면, 심수벼의 CYP707A6 단백질은 Nipponbare (GenBank Accession No. AK 120757)의 cDNA 클론으로부터 유추된 아미노산 서열에 의하면 자포니카 벼와 비교했을 때 264번 위치로부터 네 개의 글라이신 잔기가 제외되어져 있다.

<실시예4: 재조합 CYP707A5 또는 CYP707A6 단백질의 ABA 8'-히드록실라제의 활성>

1. In vivo에서 효모를 이용한 분석

재조합 CYP707A5 또는 CYP707A6 단백질의 활성은 Schoendorf (2001)등의 방법에 따라 측정하였다. 형질전환된 효모세포는 24시간 동안 SGI 배지에서 배양시킨 다음 SLI 배지로 옮겨 12시간 동안 단백질 유전자를 유도하였다 (Schoendorf A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 2001, 1501-1506; Yang et al., Plant J. 47, 2006, 675-686). 대략 18시간 동안 신선한 SLI 배지에서 연이어 효소 발현을 유도한 다음 효모세포를 채취하고, 활성분석을 위한 실험을 실시하였다. 채취한 세포를 30 μM ABA가 포함된 신선한 SLI 배지에서 250rpm, 30℃의 조건으로 18시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 후, 유기 추출물을 분리,건조하고, 0.2% 초산에 녹인 후 Sep-Pak^®C18 카트리지(Waters, Milford, MA, USA)로 정제하였다. 역상 HPLC를 이용한 PA 함량 분석은 메탄올/물 용매 조건하에서 2 mL/min 유속으로 실시하였다 (Cornish K and Zeevaart J.A.D., Plant Physiol. 76, 1984, 1029-1035).

2. In vitro에서 효모를 이용한 분석

마이크로좀 단백질을 제조하기 위해 본 발명에서는 500 mL SLI 배양액에서 효모세포를 채취하고, 0.1 M 인산칼륨 완충용액 (pH 7.6)에서 세포를 재현탁 시킨 다음 깨어진 세포는 10000 g에서 15분간 원심분리하고, 상층액은 140000 g에서 1시간 동안 초원심분리 하였다. 마이크로좀 분획은 5% 글리세롤이 포함된 동일 완충용액에서 재현탁 하였다. 단백질은 Bio-Rad 단백질 분석 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 정량하였다. ABA 8'-히드록실라제의 활성을 확인하기 위해, 본 발명에서는 재조합 CYP707As 마이크로좀 단백질 30 μg/mL을 500 μM NADPH, 200 μM ABA가 포함된 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.6) 100 μL에 첨가하였다. 반응혼합물을 22 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 반응을 10 μL 초산을 첨가하여 중지시켰 다. 반응생성물은 에틸아세테이트로 추출하고 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 용출액은 2분대 분획을 모아서 ABA 및 PA가 포함된 적당한 분획을 합하여, 건조한 다음 GC 분석을 위해 최소량의 디아조메탄에 용해시켰다 (Cornish K and Zeevaart J. A. D. Plant Physiol, 76, 1984, 1029-1035; Liu C. J. Plant J. 36, 2003, 471-484).

<실시예5: 식물 호르몬 처리에 따른 심수벼 내 CYP707A 유전자의 발현패턴>

1. 호르몬 처리

에틸렌 처리의 경우 줄기부를 공기 또는 5μL/L 에틸렌이 포함된 공기를 유속 50mL/min로 통과시켜 각각 30분, 90분, 180분을 처리하였다.

GA₃의 처리: 기존에 보고된 Lee & Kende (Lee Y and Kende H. Plant Physiol. 127 , 2001, 645-654)방법과 상기 방법으로 동일하게 처리하였다. 줄기부를 증류수 또는 50 μM GA₃ 하에서 배양하면서 30분, 60분, 120분에 유전자 발현양상을 확인하였다.

에틸렌과 GA₃을 처리한 경우는 줄기부, 모종, 잎에서 전체 RNA를 추출하였다.

ABA의 처리: 종자를 젖은 거름종이에서 3일간 발아시킨 다음, 생장한 유식물을 50 μM ABA용액 또는 물에 푹 잠긴 거름종이에 옮겨서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 유식물로부터 뿌리, 지중경, 잎을 적출하여 각각 전체 RNA를 추출하였다.

2. 노던 블롯 (Northern Blot)을 통한 발현양상 확인 및 비교

줄기부, 유식물, 잎에서 Chomczynski 와 Sacchi의 방법에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 각 처리구별로 분리한 RNA는 20 μg씩 취하여 1.4% 포름알데하이드 아가로즈 젤에 전기영동하고, 0.5M 암모니움 아세테이트용액 및 0.5㎍/㎖ EtBr을 포함하는 염색액에 5분간 둔 후 증류수로 1시간 탈염색하였다. 나일론막으로 전기영동된 RNA 밴드를 전이시키고, RNA 블롯 막은 65℃에서 2시간 동안 전혼성화 (50 % formamide, 0.5 % SDS, 1.0M NaCl, 0.1㎎/㎖denatured salmonsperm DNA) 반응시켰다. 반응 후 (알파-32P) dCTP로 방사능 표지된 CYP707A5와 CYP707A6의 염기서열에 특이적인 탐침 cDNA 각각을 62℃에서 16시간 동안 반응시키고, 세척한 후 X-ray 필름에 감광시켰다.

3. 결과분석

도 3A는 에틸렌를 처리한 줄기절간조직에서 CYP707A5 와 CYP707A6 유전자의 발현패턴을 나타내는 것이고, 도 3B는 GA₃를 처리했을 때, 도3C는 ABA를 처리한 뿌리, 지중경, 잎에서 유전자 발현패턴을 나타내는 것이다.

도 3을 통해 알수 있듯이, 유전자 특이적 탐침을 이용한 노던 블롯 분석 결과를 통해 심수벼의 호르몬 저항성 CYP707A5 유전자의 발현패턴을 살펴보면 에틸렌, GA₃, ABA를 처리했을 때 발현양이 증가되어지는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 식물체의 각 부위에서 호르몬에 의해 상기 유전자의 발현이 현저하게 나타나며 이런 결과는 식물체가 스트레스에 대하여 스스로 방어하는 메카니즘을 가지는 것이라 생각할 수 있다.

한편, 호르몬 처리에 따른 CYP707A5 및 CYP707A6 유전자의 발현패턴을 보면, CYP707A5 유전자의 발현은 에틸렌을 처리한 경우 공기만 처리한 것과 비교하여 시간이 경과함에 따라 과발현되어 나타났지만, CYP707A6 유전자의 발현은 거의 변화가 없거나 약간 감소되어지는 것을 관찰할 수 있었다. GA₃을 처리한 경우 CYP707A5 유전자의 발현은 30분에서 60분간 배양했을 때는 과발현되어지는 현상을 관찰할 수 있었지만 120분 배양에서는 발현양상에 차이를 보이지 않았다. 반면에 CYP707A6 유전자의 발현패턴은 60분까지는 거의 변화가 없었지만 120분이 경과했을 때는 물 또는 GA₃를 처리한 두 실험에서 현저하게 감소되어지는 것을 관찰할 수 있었다. 모종에서 CYP707A5 유전자 발현은 ABA 처리했을 때 뿌리와 잎에서 발현이 증가되어지는 반면에 CYP707A6 유전자 발현은 거의 관찰할 수 없었으며 CYP707A5 유전자 발현에 비해 다소 발현양이 감소되어짐을 확인할 수 있었다.

<실시예6: 다양한 스트레스 처리에 따른 심수벼 내의 CYP707A 유전자의 발현패턴>

1. 스트레스 처리

식물체의 생장과 발달에 영향을 미치는 것으로 알려진 환경 스트레스로써 한발 스트레스, 저온 스트레스, 염 스트레스를 식물체에 처리하였다. 8주된 심수벼 잎을 재료로 하여 물, 400 mM 만니톨, 250 mM NaCl, 100 μM ABA 용액에서 6시간 처리한 후 전체 RNA를 추출하였다.

2. 다양한 스트레스 처리에 따른 CYP707A 유전자의 발현패턴

도 4A에서 보여주는 바와 같이 상기 나열되어진 스트레스 조건하에서 CYP707A5 및 CYP707A6 유전자의 발현패턴을 살펴보면, CYP707A5 유전자 발현은 만니톨, NaCl, ABA를 처리한 경우 심수벼 잎에서 강하게 발현양이 증가되어짐을 관찰할 수 있었다. 반면에 CYP707A6 유전자의 발현은 상기처리 조건에서 관찰할 수 없었다.

한편, 심수벼의 다양한 조직과 기관에서 CYP707A5 및 A6 유전자 발현패턴을 조사하기 위하여 뿌리, 지중경, 자엽초, 일차엽, 절간분열조직이 포함된 맨 위절간부, 묘조정단분열 조직이 포함된 맨 위 마디, 생장중인 잎을 재료로 하여 상기 유전자의 발현양상을 관찰하였다. 도 4B에서 확인할 수 있듯이 CYP707A5 유전자는 유식물과 생장중인 잎에서 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 CYP707A6 유전자는 절간과 생장중인 잎에서는 과량으로 발현되어졌지만, 유식물에서는 약하게 발현되는 것을 관찰하였다.

<실시예7: ABA 및 그 대사체의 함량 측정>

ABA 및 PA의 추출, 정제, 정량 과정은 기존에 보고된 방법을 변형시켜 실시하였다 (Cornish K and Zeevaart J.A.D., Plant Physiol, 76, 1984, 1029-1035). 시료는 Yang 및 Zeevaart (Yang S.H and Zeevaart J.A.D, Plant J. 47, 2006, 675-686) 방법에서 잔류 수용액 추출용매를 에틸아세테이트를 사용한 것을 제외하고는 채취, 추출, 정량방법을 동일하게 진행하였다. 분획은 건조하여 역상 HPLC를 수행하였다 (Cornish K and Zeevaart J.A.D. Plant Physiol, 76, 1984, 1029-1035). ABA 및 PA의 메틸에스터는 6890 기체 크로마토그래피 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 모든 ABA 및 PA의 측정값은 적어도 3회 내지 4회 이상 반복하여 유사한 값을 얻었다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, ABA 및 PA의 함량분석 결과는 정확한 정량성을 보이지는 않았지만 CYP707A5 유전자는 CYP707A6 유전자보다 높은 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 효소간의 활성 차이는 두 단백질의 구조적 차이 때문으로 여겨지는데, 계통도에서 CYP707A6 유전자와 근접해 있는 CYP707A4 유전자가 애기장대 유래 CYP707A 유전자군에서 가장 낮은 활성을 가지는 것과 관계가 있는 것으로 보여진다 (Kushiro, T. et al., EMBO J. 23, 2004, 647-656; Saito, S. Plant Physiol. 134, 2004, 1439-1449).

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 벼에서 환경 스트레스 조절 유전자 CYP707A5 및 CYP707A6을 분리하고, 호르몬 및 다양한 스트레스 조건하에서 이들의 발현양상을 분석하여 상기 유전자의 환경 스트레스에 대한 저항성을 확인하였으며, 상기 유전자를 비활성화시켜 저온 스트레스와 관련된 효소 생산을 억제함으로써 식물체의 환경 스트레스에 대한 저항성을 변화시킬수 있으며 이 방법에 의해 환경 스트레스 저항성이 변화된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 또한 상기 유전자의 기관-특이적인 발현양상과 관련하여 환경 스트레스 반응 유전자들을 식물체의 부위별 발현을 유도하여 환경 스트레스에 의해서 특이적으로 반응하는 식물체를 생산할 수 있는 매우 유용한 발명이다

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식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 CYP707A6 유전자.
식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 제2항의 유전자로 암호화되는 단백질(ABA 8'-히드록실라제).
식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CYP707A5 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 CYP707A6 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는데 이용되는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CYP707A5 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 CYP707A6 유 전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여 환경 스트레스에 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법.