CN109053873B - 一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用 - Google Patents

一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为ZmNAC43蛋白，为序列表的序列1所示的蛋白质。编码ZmNAC43蛋白的基因，命名为ZmNAC43基因，也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入ZmNAC43基因，得到与所述出发植物相比抗旱性降低的转基因植物。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入抑制ZmNAC43基因表达的物质，得到与所述出发植物相比抗旱性增加的转基因植物。本发明对于研究植物抗旱机制，培育干旱耐逆或干旱敏感植物具有应用价值，对于植物育种具有应用前景。

Description

一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用。
背景技术
植物在长期的进化过程中形成了复杂而高效的应答机制，从分子、细胞、生理和生化水平做出适应性调整，以抵御和适应逆境胁迫。转录因子在植物应答逆境过程中起着关键的调控作用。当植物遭受逆境时，会通过一系列的信号转导途径激活转录因子。被激活的转录因子与相应的顺式作用元件特异结合，激活下游一系列抗逆相关基因的表达，从而提高植物对逆境胁迫的抗性。因而转录因子在提高植物抗逆性方面有着广泛的应用前景，在作物抗逆育种过程中通过转入转录因子能够使作物的抗逆得到更为根本、更为综合的改良。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，获自玉米合344自交系，命名为ZmNAC43蛋白，为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)序列表的序列1所示的蛋白质；
(b)将序列1进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；
(c)来源于玉米且与(a)具有95％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质；
(d)在(a)或(b)或(c)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
标签具体如表1所示。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码ZmNAC43蛋白的基因，命名为ZmNAC43基因，也属于本发明的保护范围。
ZmNAC43基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)与(1)具有75％以上同一性且编码植物抗旱性相关蛋白的DNA分子；
(3)来源于玉米且与(1)具有90％以上同一性且编码植物抗旱性相关蛋白的DNA分子；
(4)在严格条件下与(1)杂交且编码植物抗旱性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
含有ZmNAC43基因的表达盒、重组载体或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选。
所述重组载体具体可为：将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pROK2载体的多克隆位点(例如SmaI酶切位点)，得到的重组质粒pROK2-ZmNAC43。
本发明还保护ZmNAC43蛋白的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)调控植物的抗旱性；
(Ⅱ)降低植物的抗旱性。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：提高目的植物中ZmNAC43蛋白的活性和/或含量，从而降低植物的抗旱性。
本发明还保护ZmNAC43基因在培育抗旱性降低的转基因植物中的应用。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入ZmNAC43基因，得到与所述出发植物相比抗旱性降低的转基因植物。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低目的植物中ZmNAC43蛋白的活性和/或含量，从而增加植物的抗旱性。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入抑制ZmNAC43基因表达的物质，得到与所述出发植物相比抗旱性增加的转基因植物。
以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体为拟南芥。所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述单子叶植物具体为禾本科植物。所述禾本科植物具体可为玉米。
本发明提供了一种与植物抗旱性相关的蛋白质及其编码基因，将编码基因导入植物后，植物对干旱胁迫的抗逆性显著降低(ROS清除能力和脯氨酸生物合成被减弱，从而抗旱性降低)。本发明对于研究植物抗旱机制，培育干旱耐逆或干旱敏感植物具有应用价值，对于植物育种具有应用前景。
附图说明
图1为ZmNAC43基因在干旱胁迫下的表达模式。
图2为萌发率试验的结果。
图3为根长和鲜重试验的结果。
图4为气孔和失水率的测定的结果。
图5为脯胺酸含量的测定的结果。
图6为细胞膜损伤分析的结果。
图7为细胞的活性氧含量的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥又称野生型拟南芥，用WT表示。
植物表达载体pROK2，简称pROK2载体。
从玉米自交系合344中发现一个新蛋白，命名为ZmNAC43蛋白，如序列表的序列1所示。将编码ZmNAC43蛋白的基因命名为ZmNAC43基因，开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例中的土指的是人工土(蛭石：珍珠岩：黑土＝1:1:3；体积比)。拟南芥的培养条件：温度为22±2℃，光照强度为400μmol·m-2·s-1，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为65-75％。玉米的培养条件：温度为27℃、光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为70-75％。
实施例1、干旱胁迫下ZmNAC43基因在玉米叶和根中的表达模式
1、利用300mM甘露醇处理三叶一心时期玉米自交系合344的幼苗，于处理不同时间点(0h、1h、3h、6h、12h)分别对根系和叶片进行取样，液氮速冻，-80℃保存。
2、利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总的RNA。
3、使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)进行反转录。
4、使用Bio-Rad Chromo4real-time PCR系统进行实时定量PCR。玉米Actin1(GRMZM2G126010_T01)和Ubi-2(GRMZM2G419891_T04)作为内参标准化数据。相对表达水平利用2-△△CT方法计算。ZmNAC43基因在0h的表达水平设为1，计算其他时间点的相对表达水平。每一个样品进行三次独立的生物学重复，每次进行三次技术重复。
用于检测ZmNAC43基因的引物对如下：
ZmNAC43-RT-F：5’-GTCGGAGCAGGAGCTGAAAT-3’；
ZmNAC43-RT-R：5’-AAGACGATCCTGTTGTCCTCC-3’。
用于检测Ubi-2基因的引物对如下：
Ubi-2-RT-F：5’-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3’；
Ubi-2-RT-R：5’-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3’。
用于检测Actin1基因的引物对如下：
Actin1-F：5’-GATGATGCGCCAAGAGCTG-3’；
Actin1-R：5’-GCCTCATCACCTACGTAGGCAT-3’。
ZmNAC43基因在干旱胁迫下的表达模式见图1。
在干旱胁迫1h和6h时，ZmNAC43基因在叶片中表达量约是0h的7-8倍；在干旱胁迫3h和12h时，ZmNAC43基因在叶片中表达量约是0h的4-5倍。在干旱胁迫3h时，ZmNAC43基因在根中表达量约是0h的15倍；在干旱胁迫1h、6h和12h时，ZmNAC43基因在根中表达量约是0h的2-3倍。结果表明在根和叶中，ZmNAC43基因能够不同程度地被干旱诱导表达，说明ZmNAC43蛋白是玉米适应非生物逆境过程中一个重要的调节因子。
实施例2、转基因植物的获得
一、重组质粒的构建
将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pROK2载体的SmaI酶切位点，得到重组质粒pROK2-ZmNAC43。已进行测序验证。
二、转基因拟南芥的获得
1、将重组质粒pROK2-ZmNAC43导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。将重组农杆菌悬浮于溶剂，得到OD600nm值为0.6-0.8的侵染液。溶剂：含5g/100mL葡萄糖、100μMAS、100μL/LTriton X-100、0.02％Silwet L-77、2ng/L 6-BA，余量为水。
2、取哥伦比亚生态型拟南芥植株，将花序浸没于侵染液中10s，10分钟后，再次将花序浸没于侵染液中10s，然后将植株平放于托盘中(盖好保鲜膜保湿)，黑暗条件下培养24h。
3、取完成步骤2的植株，正常培养2天，然后将花序再次浸没于侵染液中10s，然后将植株平放于托盘中(盖好保鲜膜保湿)，黑暗条件下培养24h。
4、完成步骤3后，正常培养植株，果夹成熟后收集种子。
5、取步骤4得到的种子，用75％酒精和10％次氯酸钠消毒后，播种于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后22±2℃光照培养5-7天。
6、完成步骤5后，将叶片生长为绿色不变黄的小苗移植于土壤中，培养3周。
7、完成步骤6后，取植株的莲座叶，提取基因组DNA，用ZmNAC43基因特异性引物及pROK2载体特异性引物进行检测，如果检测结果均为阳性，该植株为T1代转ZmNAC43基因植株。
ZmNAC43基因特异性引物如下(获得约1035bp的目标片段，判断为阳性)：
pROK2-ZmNAC43-F：CTCTAGAGGATCCCC ATGGGCACCATGACCCTG；
pROK2-ZmNAC43-R：TCGAGCTCGGTACCC TCAGAAGACGATCCTGTTG。
pROK2载体特异性引物如下(获得约1432bp的目标片段，判断为阳性)：
pROK2-F：CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAG；
pROK2-R：GACCGGCAACAGGATTCAATC。
8、T1代转ZmNAC43基因植株自交，收获种子，将种子依次按照步骤5、6、7进行操作，得到T2代转ZmNAC43基因植株。
9、T2代转ZmNAC43基因植株自交，收获种子，将抽样种子依次按照步骤5、6、7进行操作，得到T3代转ZmNAC43基因植株。
对于某一T2代转ZmNAC43基因植株，如果其自交获得的T3代植株均为转ZmNAC43基因植株，该T2代转ZmNAC43基因植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。
随机取两个纯合的转基因株系，OE1株系和OE3株系，进行实施例3的鉴定。
三、转空载体植株的获得
用pROK2载体代替重组质粒pROK2-ZmNAC43，按照步骤二进行操作，得到转空载体株系。
实施例3、转基因植物的鉴定
本实施例中通过加入甘露醇模拟干旱胁迫(在实验室条件下)。加入的甘露醇浓度越高，则环境的干旱程度越大。
一、萌发率试验
供试种子：OE1株系的T3代种子、OE3株系的T3代种子、转空载体株系的T3代种子、野生型拟南芥的种子。
第一组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率；
第二组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含200mM甘露醇的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率；
第三组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含300mM甘露醇的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。
进行三次重复试验，每次试验每个株系取55-60粒种子。
照片见图2A。萌发率的结果见图2B。第一组，转基因株系种子的萌发率、转空载体株系种子的萌发率以及野生型拟南芥种子的萌发率，均无无显著差异。第二组和第三组，与野生型拟南芥种子相比转基因株系种子的萌发率显著降低，与野生型拟南芥种子相比转空载体株系种子的萌发率无显著差异。结果表明，ZmNAC43蛋白调控植物种子萌发对干旱胁迫的应答，过表达ZmNAC43基因降低了植物的抗旱性。
二、根长和鲜重试验
供试种子：OE1株系的T3代种子、OE3株系的T3代种子、转空载体株系的T3代种子、野生型拟南芥的种子。
1、将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
2、完成步骤1后，将长势一致的幼苗进行分组处理。
第一组：转移到1/2MS培养基平板，竖直培养，第7天拍照、测量主根长和全植株鲜重；
第二组：转移到含200mM甘露醇的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7天拍照、测量主根长和全植株鲜重；
第三组：转移到含300mM甘露醇的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7天拍照、测量主根长和全植株鲜重。
进行三次重复试验，每次试验每个株系测量45-50株植物。
照片见图3A。主根长见图3B。全植株鲜重见图3C。正常条件下，各个株系的表型、根长和鲜重均无显著差异。干旱胁迫下，转基因株系的根长及鲜重显著低于野生型拟南芥，转空载体株系的根长和鲜重与野生型拟南芥无显著差异。结果表明，ZmNAC43蛋白参与调控干旱胁迫下植物根的生长，过表达ZmNAC43基因降低了植物的抗旱性。
三、各项生理指标的测定
供试种子：OE1株系的T3代种子、OE3株系的T3代种子、转空载体株系的T3代种子、野生型拟南芥的种子。
1、气孔和失水率的测定
(1)气孔的测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，取植株的叶片，撕取叶片下表皮，置于诱导气孔开放液(含30mMKCl、10mM Mes-KOH，余量为水，pH6.15)中，在22℃的光照培养室中孵育2.5小时，然后加入甘露醇并使其浓度为300mM继续孵育2.5小时(设置不加入甘露醇的对照处理)，然后于显微镜下观察气孔的开放度并拍照，测量气孔宽度和长度并计算宽长比(气孔宽度/气孔长度)。
照片见图4A。宽长比的结果见图4B。
(2)失水率的测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，取植株的叶片100-200mg，立刻称取鲜重FW，然后放入培养皿中，室温敞开，分别隔0.5、1、1.5、2、3、4、5小时后称重一次，然后将叶片放入80℃的烘箱中烘干至恒重，称重DW。计算每个时间段叶片的失水率。总含水量＝FW-DW。每个时间点的含水量＝FW(h)-DW。每个时间点的失水率＝1-(FW(h)-DW)/(FW-DW)。
失水率的结果见图4C。
气孔开张度下降是植物对干旱逆境的适应性表现。在正常条件下，所有株系的气孔都被诱导液诱导开，并且没有显著性差异。在干旱胁迫下，所有株系的气孔开度都有所减小，转基因株系的气孔开度显著大于野生型拟南芥，与野生型拟南芥相比转空载体株系的气孔无显著差异。结果表明，过表达ZmNAC43基因能够抑制植物气孔在干旱胁迫下正常的收缩关闭行为，从而提高植物对干旱胁迫的敏感性。
气孔的开放度会直接影响水分的蒸发。随着时间的变化，所有株系叶片的失水率逐渐上升，转基因株系的失水率显著高于野生型拟南芥，转空载体株系的失水率与野生型拟南芥无显著差异。结果表明，过表达ZmNAC43基因能够降低植物的保水能力，ZmNAC43蛋白能够阻碍植物气孔在干旱胁迫下的收缩行为、提高植物叶片水分的流失、降低植物的耐旱性。
2、脯胺酸含量的测定
当植物遭受外界干旱逆境时，会引起渗透胁迫，从而影响植物的生长。同时较多植物在遭受逆境胁迫时都会积累大量的脯氨酸来维持正常的渗透压，调节胞质与液泡之间的渗透平衡，提高植物的抗逆性，所以脯氨酸是衡量植物抗旱性的一个重要指标。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48小时，然后取植株地上部分，称取鲜重并检测脯胺酸含量。
检测脯胺酸含量的方法参见文献：Bates,L.S.,Waldren,R.P.,and Teare,I.D.(1973).Rapid determination of free proline for water-stress studies.PlantSoil 39,205–207.doi:10.1016/j.dental.2010.07.006.。
结果见图5。正常条件下，各个株系的脯氨酸含量无显著差异。在干旱胁迫下，转基因株系的脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥，转空载体株系的脯氨酸含量与野生型拟南芥无显著差异。结果表明，在响应干旱胁迫时，过表达ZmNAC43基因的植株积累较少脯氨酸从而抗旱性降低。
3、细胞膜损伤分析
(1)伊文思兰染色
伊文思兰(Evans blue)能够将细胞膜破损、死亡并丧失活性的细胞染成蓝色，通过着色的情况从而判断植物在应对非生物胁迫时抗逆能力。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养2小时，然后取地上部分，进行伊文思兰染色。
结果见图6A。正常条件下，植株叶片Evans blue着色较浅，各株系无显著差异，说明此时叶片受损伤的比较少。在干旱胁迫下，转基因株系叶片的蓝色较野生型拟南芥深，说明转基因株系叶片细胞死亡的多，抗旱能力弱。
(2)PI染色
Propidium Iodide(PI)是一种能够穿透破损的细胞膜，而未能穿透活性细胞膜的染料，所以当细胞死亡或者细胞膜出现破裂时都能被PI染成红色。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗转移到含300mM甘露醇的1/2MS培养基平板(设置不加入甘露醇的对照处理)，竖直培养24小时，然后将幼苗进行PI染色，然后用激光共聚焦显微镜观察根尖的着色情况。
结果见图6B。正常条件下，植株根尖着色比较浅，各株系无显著差异，说明此时苗的生长较正常，细胞死亡的较少。在干旱胁迫下，各株系的根尖PI着色情况都有所加深，相对于野生型拟南芥转基因拟南芥根尖被PI染成红色的部位较多，着色比较深，根尖死亡的细胞比较多，进一步显示过表达ZmNAC43基因导致植株应对干旱胁迫时的抗逆能力减弱。
(3)丙二醛含量测定
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生会破坏细胞膜。因此，它是一个衡量植物衰老和抗逆性的常用生理指标。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48小时，然后取植株地上部分，称取鲜重并检测丙二醛含量。
检测丙二醛含量的方法参见文献：Wang,Y.C.,Gao,C.Q.,Liang,Y.N.,Wang,C.,Yang,C.P.,and Liu,G.F.(2010).A novel bZIP gene from Tamarix hispida mediatesphysiological responses to salt stress in tobacco plants.J.Plant Physiol.167,222–230.doi:10.1016/j.jplph.2009.09.008.。
结果见图6C。正常条件下，各株系植株MDA含量都较低，并且不同株系间没有显著性的差别。在干旱胁迫下，各株系植株MDA含量都有所提高，说明细胞膜都遭到一定的破坏，与野生型拟南芥相比转基因株系MDA含量更高，说明转基因植株在遭受胁迫时，细胞膜损伤的最严重，更进一步表明过表达ZmNAC43基因削弱了植物的抗旱性，加速细胞的死亡。
(4)相对电导率测定
相对电导率是衡量植物细胞膜完整性的一个重要指标，当植物受到损伤，或者是在逆境胁迫的条件下，都容易使细胞膜受到破坏而导致细胞质的胞液外渗，电解质的流失而使相对电导率增大。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养2周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养5天，然后取叶片，检测相对电导率。
检测相对电导率的方法参见文献：Lutts S,Kinet J M,BouharmontJ.1996.NaCl-induced senescence in leaves of rice(Oryza sativa L.)cultivarsdiffering in salinity resistance.Annals of Botany,78,389-398.。
结果见图6D。正常条件下，各株系植株相对电导率都较低。在干旱胁迫下，各株系植株相对电导率都有提高，并且转基因株系较野生型拟南芥高，结果说明干旱胁迫下过表达ZmNAC43基因植物细胞膜的破坏程度增加，植物的抗逆性降低。
4、细胞的活性氧含量
(1)DAB染色
DAB染料能够用来观察植物中过氧化氢(H2O2)的含量。DAB染料能够与H2O2释放出的氧离子氧化成棕色物质，颜色越深代表H2O2的含量越多。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养2小时，然后取植株，进行DAB染色。
结果见图7A。在正常条件下，各株系的DAB着色没有显著性的差异。在干旱胁迫下，转基因株系叶片的棕色较野生型拟南芥深，说明转基因株系叶片的H2O2积累比较多。结果表明，干旱胁迫下过表达ZmNAC43基因增加了活性氧的积累，从而加剧对植物的伤害。
(2)NBT染色
NBT染料能够用来观察植物中超氧阴离子的含量。NBT染料能够将超氧阴离子氧化成蓝色沉淀，颜色越深说明超氧阴离子含量越多。
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养2小时，然后取植株，进行NBT染色。
结果见图7B。在正常条件下，各株系的NBT着色没有显著性的差异。在干旱胁迫下，转基因株系植株叶片的蓝色都较野生型拟南芥深，说明转基因株系的叶片的超氧阴离子积累比较多。结果表明，干旱胁迫下过表达ZmNAC43基因增加了活性氧的积累，从而加剧对植物的伤害。
(3)H2O2含量测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48h，然后取地上部分，进行H2O2含量测定。
检测H2O2含量的方法参见文献：Velikova,V.,Yordanov,I.,and Edreva,A.(2000).Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treatedbean plants:protective role of exogenous polyamines.Plant Science 151,59-66.doi:10.1016/S0168-9452(99)00197-1。
结果见图7C。在干旱胁迫下，转基因株系的H2O2含量较野生型拟南芥高，说明了逆境下过表达ZmNAC43基因导致显著增多的H2O2积累。
(4)超氧阴离子产率测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48h，然后取地上部分，进行超氧阴离子产率测定。
检测超氧阴离子产率的方法参见文献：Able A J,Guest D I,Sutherland MW.1998.Use of a new tetrazolium-based assay to study the production ofsuperoxide radicals by tobacco cell cultures challenged with avirulentzoospores of Phytophthora parasitica var nicotianae.Journal of PlantPhysiology,117,491-499.。
结果见图7D。在干旱胁迫下，转基因株系的超氧阴离子含量较野生型拟南芥要高，说明逆境下过表达ZmNAC43基因导致植物中的超氧阴离子显著增加。
(5)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48h，然后取地上部分，进行超氧化物歧化酶活性测定。
检测超氧化物歧化酶活性的方法参见文献：Wang,Y.C.,Gao,C.Q.,Liang,Y.N.,Wang,C.,Yang,C.P.,and Liu,G.F.(2010).A novel bZIP gene from Tamarix hispidamediates physiological responses to salt stress in tobacco plants.J.PlantPhysiol.167,222–230.doi:10.1016/j.jplph.2009.09.008.。
结果见图7E。在正常条件下，各株系的SOD酶活没有显著性差异，表明各株系的活性氧的清除能力相近。在干旱胁迫下，转基因株系的SOD活性较野生型拟南芥低，说明过表达ZmNAC43基因导致植物对活性氧清除能力下降，进而抗逆能力下降。
(6)过氧化物酶(POD)活性测定
①将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。
②完成步骤①后，将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆4株，培养3周。
③完成步骤②后，每个花盆浇灌50ml 300mM甘露醇溶液(设置用等体积水代替甘露醇溶液的对照处理)，培养48h，然后取地上部分，进行过氧化物酶活性测定。
检测过氧化物酶活性的方法参见文献：Wang,Y.C.,Gao,C.Q.,Liang,Y.N.,Wang,C.,Yang,C.P.,and Liu,G.F.(2010).A novel bZIP gene from Tamarix hispidamediates physiological responses to salt stress in tobacco plants.J.PlantPhysiol.167,222–230.doi:10.1016/j.jplph.2009.09.008.。
结果见图7F。在正常条件下，各株系的POD酶活没有显著性差异，表明各株系的活性氧的清除能力相近。在干旱胁迫下，转基因株系的POD活性较野生型拟南芥低，说明过表达ZmNAC43基因导致植物对活性氧清除能力下降，进而抗逆能力下降。
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种植物抗旱相关蛋白ZmNAC43及其编码基因和应用
<130> GNCYX182019
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 344
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 1
Met Gly Thr Met Thr Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp
1 5 10 15
Asp Glu Leu Val Gly Tyr Tyr Leu Lys Arg Lys Val Asp Asn Leu Lys
20 25 30
Ile Glu Leu Glu Val Ile Pro Val Val His Leu Tyr Lys Ser Glu Pro
35 40 45
Trp Glu Leu Pro Glu Lys Ser Leu Leu Pro Arg Arg Asp Leu Glu Trp
50 55 60
Phe Phe Phe Cys Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Thr
65 70 75 80
Asn Arg Ala Thr Ser Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg
85 90 95
Arg Ile Ala Cys Asp Gly Gly Val Tyr Gly Leu Arg Lys Thr Leu Val
100 105 110
Phe Tyr Arg Gly Arg Ala Pro Gly Gly Glu Arg Thr Ala Trp Val Met
115 120 125
His Glu Tyr Arg Leu Cys Gln Asp Leu Ala His Gly Thr Cys Asn Phe
130 135 140
Ile Gly Ala Tyr Ala Leu Cys Arg Val Ile Lys Arg His Glu Gly Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Glu Ser Cys Ala Lys Gly Ala Ala Gly Ser Ala Arg
165 170 175
Ser Gly Gln Met Ser Lys Val Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val Ser Asn
180 185 190
Asp Gln Leu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Pro Pro Thr Leu Asp Val Gly
195 200 205
Thr Met Ala Gly Ser Gly Asn Ala Phe Gln Ser Pro Val Gly Tyr Gly
210 215 220
Tyr Gly Val Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Gly Leu Pro Ser
225 230 235 240
Ser Ala Leu Ala Thr Pro Leu Leu Ile Val Pro Ser Pro His Asp Thr
245 250 255
Phe Ser Ile Gly Gly Asp Gly Asp Phe Leu Pro Ala Ala Ala Glu Ser
260 265 270
Arg Ser His Ala His Leu Phe Asp Thr Val Gly Met Gly Met Gly Gly
275 280 285
Val Ser Glu Gln Glu Leu Lys Trp Asp Ser Phe Ala Cys Pro Ser Thr
290 295 300
Phe Ser Ser Gly Ala Asp Met Ala Ala Ala Ser Pro Ala Met Leu Cys
305 310 315 320
Arg Gln Ala Ser Asp Gly Phe Asp Asp Leu Leu Ala Ala Phe Phe Phe
325 330 335
Ser Glu Asp Asn Arg Ile Val Phe
340
<210> 2
<211> 1035
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2
atgggcacca tgaccctgcc gcccgggttc cgcttccacc cgaccgacga cgaactcgtg 60
ggctactacc tcaagaggaa ggtggacaac ctcaagatcg agctcgaggt catccccgtc 120
gtccatctct acaaatccga gccatgggag ctaccagaga agtcgcttct gccgaggcgc 180
gacctggagt ggttcttctt ctgcccgcgc gaccgcaagt acccgaacgg gtcgcgaacc 240
aaccgtgcca cgtccacggg gtactggaag gccacgggca aggaccgccg catcgcctgc 300
gacggcggcg tctacggtct ccgcaagacg ctcgtcttct accgtggccg cgcccccggc 360
ggcgagcgca ccgcctgggt catgcacgag taccgcctct gccaggacct cgcccacggc 420
acttgcaact tcatcggtgc ttacgcgctt tgccgcgtga tcaagcggca cgagggcggg 480
ctgccgcagg gcgagagctg cgcgaaagga gccgccggca gcgcgagatc agggcagatg 540
agcaaggtct ccagcagctc gtccctcgtc agcaacgacc agctcagcgc gtcgttcacc 600
cctcctccta cactggacgt gggcaccatg gctggatccg gcaacgcgtt ccagagcccc 660
gttgggtacg ggtacggcgt gacgacgacg gcgacggcca ccactgcggg gctgccgtcg 720
agcgcactgg ccacgcccct gctcatcgtg ccgtctcccc acgacacgtt ttccatcggc 780
ggcgacggcg acttcctccc cgccgcggcc gagtcgcgtt cgcacgcgca cctgttcgac 840
accgtgggaa tggggatggg cggcgtctcg gagcaggagc tgaaatggga cagcttcgcc 900
tgcccaagca cgttctcgag tggtgccgac atggcggcgg cgagtccggc gatgctgtgc 960
cggcaggcga gcgacggctt cgacgacctg ctggcggcct tcttcttctc ggaggacaac 1020
aggatcgtct tctga 1035

Claims (10)

1.一种蛋白质，为如下（a）或（b）：
（a）序列表的序列1所示的蛋白质；
（b）在（a）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为编码区如序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质的应用，为调控植物的抗旱性；所述植物为玉米或拟南芥。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控为降低。
7.一种植物育种方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性和/或含量，从而降低植物的抗旱性；所述植物为玉米或拟南芥。
8.权利要求2或3所述基因在培育抗旱性降低的转基因植物中的应用；所述植物为玉米或拟南芥。
9.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入权利要求2或3所述基因，得到与所述出发植物相比抗旱性降低的转基因植物；所述植物为玉米或拟南芥。
10.一种植物育种方法，包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性和/或含量，从而增加植物的抗旱性；所述植物为玉米或拟南芥。
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