KR100838053B1 - 시토크롬 피450 85 에이 2 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베이어-빌리거 산화(Baeyer-Villiger oxidation) 활성을 가지는 CYP85A2 단백질에 관한 것이다. 또한 상기 단백질의 세포내 발현 수준을 증가 또는 감소시켜 식물의 브라시노라이드 합성을 조절하는 방법 및 상기 단백질을 이용하여 브라시노라이드 등의 락톤 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Cytochrome P450 monooxygenase, Baeyer-Villiger oxidation, 락톤 화합물, 브라시노스테로이드, 애기장대, 형질전환체

Description

시토크롬 피450 85 에이 2 및 이의 이용{CYP85A2 and its use}

도 1은 식물체에서 현재까지 알려진 브라시노라이드의 생합성 경로 및 각 단계에 관여하는 효소에 대한 것을 나타내는 것이다. DET2, CYP85A1, CYP85A2, CYP90A1와 CYP90B1는 애기장대 유전자이고 별표로 표기된 CYP90D2와 CYP92A6는 각각 벼와 완두의 유전자이다.

도 2는 애기장대에서 알려진 두 가지의 CYP85 단백질인 CYP85A1과 CYP85A2가 서로 다른 효소활성을 가지고 있음을 확인한 결과이다. 도 2a와 2b는 CYP85A1와 CYP85A2 단백질을 과발현하도록 형질전환한 각각의 효모 균주(CYP85A1/V60/WAT21와 CYP85A2/V60/WAT21)에 동량의 6-deoxo-28-norcastasterone(6-deoxo-28-norCS)과 6-deoxocastasterone (6-deoxoCS)를 피딩(feeding)한 뒤 그 대사산물의 함량비교를 통해 두 효소의 기질 특이성이 확연하게 다를 뿐만 아니라 CYP85A2의 경우 BL (brassinolide) synthase의 활성 또한 가지고 있음을 확인한 GC-MS 결과이며, 도 2c는 이러한 두 효모 균주에 6-deoxoCS을 농도별로 피딩한 뒤 그 대사산물의 양을 분석하여 CYP85A2가 CYP85A1보다 휠씬 높은 C-6 옥시다제 활성을 가지고 있음을 보여준다. 도 2d는 CYP85A1과 CYP85A2 단백질의 아미노산 서열을 비교한 것으로서 두 단백질간의 상동성이 매우 높음에도 두 효소간 기질 특이성의 차이가 존재함을 알 수 있다. 도 2e는 두 단백질의 크기가 모두 465 아미노산으로 이루어진 것을 바탕 으로 각각의 N-말단 영역이 서로 맞바꾼 재조합 단백질에 대한 모식도이다. 도 2f는 재조합 단백질의 경우 기질특이성이 어떻게 변화하는지를 보여주는 결과이다.

도 3은 CYP85A2가 결핍된 순수열성 호모 돌연변이체들인 cyp85a2 - 1와 cyp85a2 -2의 표현형을 나타낸 것으로서 도 3a는 두 돌연변이체에 삽입된 T-DNA의 위치를 나타낸 것이고 도3b는 각각의 돌연변이체에서 CYP85A2와 CYP85A1의 mRNA양을 조사한 것이다. 도 3c는 야생형과 비교한 CYP85A2 돌연변이체의 로제트(Rosette) 잎의 모양을 나타낸 것이고 도 3d는 10일간 키운 시딩(seedlings)의 표현형이다. 도 3e는 다자란 개체의 표현형을 야생형과 비교한 것이고 도 3f는 cyp85a2 돌연변이체가 나타내는 비정상적인 콜린(cauline) 잎의 개수를 보여준다. 도 3g는 꽃차례 줄기(inflorescence stem)에서 실리크(silique)가 잘 생성되지 않지만(박스) 성숙한 개체에서는 정상적인 실리크가 생성된다. 도 3h와 i는 꽃의 수술과 암술의 현미경 관찰 결과로서 돌연변이체가 야생형에 비해 수술 필라먼트(filament)의 생장이 잘 일어나지 않음을 알 수 있다.

도4는 cyp85a2 돌연변이체의 비정상적인 표현형이 CS과 BL의 처리에 의해 회복되는 것을 나타낸 것으로 도 4a는 1 uM의 CS과 BL를 처리하여 cyp85a2의 로제트 잎의 길이가 회복되는 것을 보여주며 도 4b와 c는 이와같이 CS과 BL에 의해 회복된 각각의 로제트 잎의 모양을 상세하게 나타내었다. 도 4d-4e는 CS과 BL의 처리에 의해 돌연변이체의 실리크가 정상적으로 생성되어짐을 나타낸 것이다.

도 5는 애기장대 CYP85A2 과발현체의 생화학적 기능 분석과 표현형에 대한 것이다. 도 5a는 7개의 독립적인 35S-CYP85A2 라인에서 CYP85A1과 CYP85A2 mRNA 함 량에 대한 RT-PCR 분석결과를 나타낸 것이고 도 5b는 야생형, bri1-9과 35S-CYP85A2 식물체에 BRs를 피딩한 결과를 나타낸 것이다. 도 5c는 야생형, bri1-9, bak1, BRI-GFP 식물체에서의 CYP85A1와 CYP85A2의 발현양을 나타낸 도이다. 도5d-5f 는 35S-CYP85A2 식물체의 로제트(rosette), 꽃차례(inflorescence)와 실리크(silique)를 각각 나타낸 도이다. 도 5g는 35S-CYP85A2와 야생형식물에서의 실리크당 시드(seeds)의 개수 및 패디셀(pedicel)의 길이를 비교한 것이다.

도 6은 cyp85a1 돌연변이체와 과발현체의 표현형을 나타낸 도로서 도 6a는 4개의 독립적인 형질전환체에서 CYP85A1 과발현에 대한 RT-PCR 분석 결과이고 도 6b-6c 는 35S-CYP85A1의 꽃차례와 로제트 잎을 각각 나타낸 것이다. 도 6d는 야생형, cyp85a1과 cyp85a2 돌연변이체의 표현형을 비교한 도이다.

본 발명은 베이어-빌리거 산화(Baeyer-Villiger oxidation) 활성을 가지는 CYP85A2 단백질, 상기 단백질의 세포내 발현 수준을 증가 또는 감소시켜 식물의 브라시노라이드 합성을 조절하는 방법 및 상기 단백질을 이용하여 브라시노라이드 등의 락톤 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

브라시노스테로이드 (Brassinosteroids)는 1979년 브라시노라이드 (Brassinolide, BL)가 처음 발견된 이후(Grove et al., Nature, 281, pp216-217. 1979), 뒤이은 연구에 의하여 약 40여종의 관련 화합물 (브라시노스테로이드로 총 칭함)이 식물계의 전반에 폭넓게 존재함이 밝혀졌다(Yokota, Trends Plant Sci. 2, pp137-143. 1997). 브라시노스테로이드는 세포의 신장과 분열을 활성화하여 줄기 (hypocotyl, epicotyl, peduncle 등) 신장을 촉진하고 브라시노스테로이드는 잎의 벤딩(leaf bending), 세포막 극성화 (membrane hyperpolarization), ATPase 활성화, 마이크로튜뷸린 재배열(microtubule reorientation), 생식기관 발달, source/sink의 상관관계와 노화 (senescence)등을 조절하고 트라치어리 요소(tracheary element)의 분화와 염 (salt), 가뭄(drought), 온도, 병원체 공격(pathogen attack) 등의 스트레스에 대한 적응기작에도 관여하는 것으로 보고되었다 (Clouse and Sasse, Annu . Rev. Plant Physiol . plant mol . Biol . 49, pp427-451, 1998; Sasse, Brassinosteroid, pp137-161, 1999).

이러한 결과들은 외부처리한 브라시노스테로이드의 효과로서 연구 초기에는 실제 식물체 내에서 브라시노스테로이드의 생리활성에 대한 불명확성 등이 제기되었으나 이후 애기장대, 토마토, 완두 등에서 동정된 브라시노스테로이드 결핍 돌연변이(det2 , dpy , dwf4 , cpd , d)의 표현형 연구를 통해 외부 처리한 브라시노스테로이드의 생리활성이 재확인될 수 있었다. 즉, 이들 돌연변이는 심한 왜성 (dwarfism), 암녹색/원형 잎(dark-green/round leaf), 노화 지연, 생식능력 저하, 비정상적인 유관속계의 발달, 어두운 상태에서 비정상적인 스코토모포제네시스( skotomorphogenesis) 등을 나타냈는데 브라시노스테로이드 결핍 돌연변이에 대해 오직 BL를 처리했을 경우에만 이들이 야생형으로의 회복(rescue)을 나타내어 브라시노스테로이드가 줄기 신장, 노화, 유관속계의 분화 등의 식물체의 정상적인 생장 과 분화에 필수적인 생리활성을 갖고 있음이 증명되었다 (Fujioka, S., and Yokota, T., Annu. Rev. Plant. Biol. 54, pp137-164, 2003).

브라시노스테로이드 결핍 돌연변이체들을 이용한 분자유전학적 실험은 방사성 동위원소로 표식한 관련 화합물의 피딩(feeding) 실험과 함께 식물체 내에서 브라시노스테로이드의 생합성 경로와 생합성 과정에 관여하는 효소의 특성 등을 규명하였다. 즉, 식물계에서 가장 폭넓게 동정되고 높은 활성을 갖는 CS은 BL의 직접적인 생합성 전구체로서 구조적으로 동일한 탄소 골격을 갖고 있는 캠페스테롤(campesterol)에서부터 캠페스타놀 (campestanol)로 전환된 후, B ring의 6번 탄소의 산화가 측쇄(side chain)의 수산화 보다 먼저 일어나는 초기 C-6 산화경로 (the early C-6 oxidation pathway)과 측쇄의 수산화가 6번 탄소의 산화 보다 먼저 일어나는 후기 C-6 산화경로 (the late C-6 oxidation pathway)의 두 경로를 통하여 CS으로 전환되는 것으로 알려졌다. 이러한 브라시노스테로이드의 생합성 경로에는 DET2 (Deetiolated2), DWF4 (Dwarf4), CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarfism), D (Dwraf) 등의 효소가 관여하는 것으로 보고되었다 (Fujioka, S., and Yokota, T., Annu. Rev. Plant. Biol. 54, pp137-164, 2003; Bishop and Yokota, Plant Cell Physiol. 42, pp114-120, 2001).

상기와 같이 브라시노스테로이드 생합성 과정에 관여하는 대부분의 효소가 알려졌지만 생합성 최종 단계인 CS의 BL로의 전환과정에 관여하는 효소, 즉, BL synthase의 특성에 대해서는 알려진 바가 없었다. 이러한 BL 합성에 대한 연구는 다음과 같은 이유에서 매우 중요하게 생각되어 왔다.

먼저, CS의 BL로의 전환은 일일초 (C. roseus )와 우산이끼, 애기장대에서 BL로 전환되는 것으로 증명되었다 (Suzuki et al., J. Plant Growth Regul ., 12, pp101-106., 1993; Noguchi et al., Plant Physiol . 124, pp201-209, 2000; Kim et al., Bull . Korean Chem . Soc ., 24, pp1385-1388, 2003). 결과적으로 CS는 BL의 직접적인 생합성 전구체로 여겨지고 있으나, 일부 식물에서는 높은 함량의 CS이 존재함에도 불구하고 BL가 전혀 검출되지 않고 있다. (Fujioka, Brassinosteroid, pp21-45, 1999). 또한 BL가 검출된 식물조차에서는 CS의 BL로의 전환율이 매우 낮은 것으로 알려졌다(Suzuki et al., Biosci . Biotech . Biochem ., 59, pp168-172, 1995; Noguchi et al., Plant Physiol . 124, pp201-209, 2000). 이러한 보고들은 CS이 BL의 생합성 전구체일 뿐만 아니라 CS 자체가 식물체에서 자신의 활성을 나타낼 수 있는 활성형의 브라시노스테로이드일 가능성을 제시하였다. 그러나, 이전까지 이러한 가능성을 증명하기 위해 반드시 필요한 BL syntase가 동정되지 않고 있다.

다음으로 CS의 BL로의 전환은 케톤구조의 B-ring의 탄소와 탄소 결합 사이에 하나의 산소 분자가 삽입되어 락톤 형태의 B-ring으로 전환되는 베이어-빌리거 산화(Baeyer-Villiger oxidation) 반응에 의해 일어난다. 이러한 베이어-빌리거 산화는 수많은 화학반응 중에서도 매우 독특한 것으로 여겨지고 있으며, 베이어-빌리거 산화를 촉매하는 미생물의 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)을 이용한 유기합성법은 이미 유용 락톤화합물을 대량으로 생산하기 위해 산업적으로 이용되고 있다 (Willetts, Trends Biotechnol. 15, pp55-62, 1997; Roberts and Wan, J. Mol . Catal., 4, pp111-136, 1998). 식물의 경우에도 식물이 생산해내는 많은 2차 대사 산물 중 알테미시닌(artemisinin), 코스투놀리드(costunolide), 네페탈락톤(nepetalactone), 디지토씨게닌(digitoxigenin) 등과 같은 다양한 구조의 락톤 화합물이 존재하고 있으며 이들 화합물은 제초제, 의약품 등의 유용 화합물로서 사용되고 있다 (Croteau et al., Biochemistry and molecular biology of plants, pp1250-1318, 2000). 그러나, 식물에는 BVMO가 존재하지 않는 것으로 알려졌고 (Fraaije et al., FEBS Lett. 518, pp43-47, 2002) 현재까지 식물의 유용 락톤 화합물을 합성하는 단백질이 전혀 동정되지 않았다. 이에 락톤 구조의 BL를 합성하는 효소의 동정은 식물 호르몬의 생체함량 조절뿐만 아니라 식물의 유용한 락톤 화합물을 산업적으로 이용하기 위한 핵심 효소로서 매우 중요한 의미를 가진다.

이런 이유로, CS의 BL로의 전환과정에 관여하는 효소, 즉 BL synthase 기능을 하는 단백질의 규명이 요구되어지고 있다.

이런 배경하에, 본 발명자는 효모균주를 이용한 CYP85A2 단백질의 기능 분석과 애기장대에서 CYP85A2 단백질 불활성화 돌연변이와 과발현 돌연변이를 이용한 분자유전학적, 생화학적 방법을 통해 식물체에서 CS을 BL로 전환시키는 효소가 사이토크롬 P450 모노옥시게나제(Cytochrome P450 monooxygease)인 CYP85A2 단백질이며 이를 이용하여 식물의 BL 합성을 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 베이어-빌리거 산화 활성을 가지는 CYP85A2 단백질 을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CYP85A2 단백질의 세포내 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 단계를 포함하는 식물의 브라시노라이드 합성을 조절하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CYP85A2 단백질을 과발현하는 원핵 생물 또는 진핵 생물을 케톤 화합물이 존재하는 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하는 케톤 화합물을 베이어-빌리거 산화 반응시켜 락톤 화합물을 생산하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분리된 상기 CYP85A2 단백질을 케톤 화합물이 존재하는 조건하에 제공하는 단계를 포함하는 케톤 화합물을 베이어-빌리거 산화 반응시켜 락톤 화합물을 생산하는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 베이어-빌리거 산화 활성을 가지는 CYP85A2 단백질을 제공한다.

CYP85A2 단백질이 카스타스테론의 케톤 화합물을 분자내에 －COO－결합을 갖는 브라시노라이드의 락톤 화합물로 산화시키는 활성을 가지는 것을 확인함으로써, CYP85A2 단백질이 베이어-빌리거 모노옥시게나제(Baeyer-Villiger monooxygenase: BVMO) 임을 밝혔다.

용어, "베이어-빌리거 모노옥시게나제(Baeyer-Villiger monooxygenase: BVMO)"란 C-C 결합에 산소를 삽입을 촉매하는 효소로, 다양한 게톤 기질을 이에 상 응하는 락톤이나 에스테로로 산화하는 능력을 가진다.

본 발명의 목적상, CYP85A2 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 또한, CYP85A2의 야생형 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. p38DX2 단백질의 변이체란, p38DX2 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.

상기 기술한 단백질 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이는 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있는 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이를 통하여, 베이어-빌리거 모노옥시게나제의 효소 촉매활성이 증가된 변이체이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CYP85A2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 제공한다.

상기한 바와 같은 야생형 또는 변이체 형태의 CYP85A2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 CYP85A2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산이다. 상기한 핵산은 게놈 또는 cDNA 형태이다. 또한 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유 전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다.

본 발명의 CYP85A2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 의해 제공된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CYP85A2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

벡터를 숙주세포로 형질전환하기 위하여 본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”에는 핵산을 세포내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바 와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매기된 형질전환, 입자총법, 원형질 세포법, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 곤충 세포, 식물 세포, 포유 동물 등의 진핵 생물 유래의 세포가 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 CYP85A2 단백질의 세포내 발현 수준을 증가 또는 감소시켜 식물의 브라시노라이드 합성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

CYP85A2 단백질은 카스타스테론의 브라시노라이드로의 합성 능력을 가지는 효소로, 이의 발현을 조절함으로써, 식물체 내의 브라시노라이드 합성을 조절할 수 있다.

하나의 구체적인 양태로서, CYP85A2 단백질을 코딩하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환 시킴으로써 CYP85A2 단백질의 세포내 발현 수준을 증가시켜 식물의 브라시노라이드 합성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. CYP85A2 단백질을 코딩하는 재조합 벡터는 상술한 바와 같다. 상기 벡터의 식물로의 형질전환 법은 바람직하게는 아그로박테리움법, 원형질세포법, 입자총법이다.

상기의 방법으로 브라시노라이드 합성을 증가시킬 수 있는 식물은 식량작물류, 채소작물류, 특용작물류, 과수류, 화훼류 및 사료작물류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적인 예로, 식량작물류는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수 등을 포함하고; 채소작물류는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근 등을 포함하고; 특용작물류는 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채 등을 포함하고; 과수류는 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나 등을 포함하고; 화훼류는 장미, 글라디올러스, 거베라(Gervera), 카네이션, 국화, 백합, 튤립 등을 포함하고; 사료작물류는 라이그라스(ryegrass), 레드 클로버(red clover), 오차드 그라스(Orchard grass). 알파파(Alfafa), 톨페스큐(Tall fescue), 페레니얼 라이그라스 (Perennial ryegrass) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기의 방법으로, 식물의 BL 합성을 증가시킬 경우 식물의 생장을 촉진시킬 수 있다.

용어, “식물의 생장”란 식물이 시간이 경과함에 따라 비가역적으로 그 크 기를 더해 가는 과정으로, 세포 분열(cell division), 세포 분화(cell differentiation)를 통해 이루어진다. 본 발명은, CYP85A2 유전자를 과발현시켜 식물체 내의 BL 합성을 증가시킴으로써 식물의 생장을 촉진하였다. 실제 식물체에서 CYP85A2 유전자가 과발현하도록 형질전환시킨 애기장대는 야생형에 비해 줄기 생장 촉진, 로재트 잎의 비대화, 꽃자루의 길이 증가, 씨앗의 수확량 증가 등의 표현형을 나타내었다.

따라서, 이런 방법을 통하여 다양한 식물의 생산량을 향상시킬 수 있다.

또 다른 구체적인 양태로서, CYP85A2 단백질을 코딩하는 게놈 유전자의 엑손으로 하나 이상의 외생 핵산 서열을 도입시켜 유전자를 불활성화시켜 CYP85A2 단백질의 세포내 발현 수준을 차단시키는 단계를 포함하는 식물의 BL 합성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “외생(exogenous) 핵산 서열”이란 숙주세포에서 정상적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 의미하고, 외생 핵산서열을 유전자 게놈의 엑손으로 삽입함으로써 유전자의 불활성을 유도할 수 있다. 본 발명에서는 T-DNA를 CYP85A2 유전자의 엑손으로 삽입시켰다.

상기의 방법으로, 식물의 BL 합성을 감소시켜 식물의 생장을 억제시킬 수 있다. 실제, CYP85A2 유전자의 기능이 상실한 돌연변이체는 둥글고 진한 녹색의 로제트 잎, 웅성불임성(male sterility), 비정상적인 줄기 생장, 비정상적인 콜린(cauline) 잎의 개수 등의 표현형을 나타내었다.

따라서, 이런 방법을 통하여 화훼식물 등의 표현형 조작 등에 유용하게 사용 될 수 있다.

CYP85A2 단백질은 락톤 화합물 생산의 산업용 효소로서 이용될 수 있다. 화합적 합성을 이용하는 방법은 에너지가 많이 소모되며 품질에 좋지 않은 영향을 미치는 여러 부반응이 일어날 수 있으나 CYP85A2 단백질을 이용하는 생물전환 공정은 효소 고유의 위치특이성과 입체특이성 및 다양한 기질특이성을 지니고 있어서 고순도의 락톤 화합물을 효율적으로 생산할 수 있다. 또 효소를 이용한 생산 공정은 환경 친화적이라는 장점이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CYP85A2 단백질을 이용하여 락톤 화합물을 생물학적 공정으로 생산하는 방법에 관한 것으로, CYP85A2단백질을 과발현하는 생물을 이용하는 인 비보(in vivo) 시스템이나 분리된 CYP85A2 단백질을 이용하는 인 비트로(in vitro) 시스템을 이용할 수 있다.

하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 상기 CYP85A2 단백질을 과발현하는 원핵생물 또는 진핵생물을 케톤 화합물이 존재하는 조건하에서 배양하여 케톤 화합물을 베이어-빌리거 산화 반응시켜 락톤 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “CYP85A2 단백질을 과발현하는 원핵생물 또는 진핵생물”이란, 상기에서 CYP85A2 단백질을 과발현하는 재조합 발현벡터 등으로 형질전환되어 CYP85A2 단백질을 과발현하도록 유전자 조작된 원핵생물 또는 진핵생물을 의미한다.

CYP85A2 단백질을 과발현하도록 유전자 조작 가능한 원핵생물은 박테리아를 포함하고, 구체적으로 상기한 에스케리치아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 스트렙 토마이세스, 슈도모나스, 프로테우스 미라빌리스, 스타필로코쿠스 등이 그 예다.

CYP85A2 단백질을 과발현하도록 유전자 조작가능한 진핵생물은 효모 또는 식물을 포함한다. 구체적으로 효모는 상기한 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세르비시애, 쉬조사카로마세스, 뉴로스포라 크라사 등을 그 예로 들 수 있고, 식물은 상기한 바와 같다.

따라서, 또 다른 구체적인 양태로서, 분리된 CYP85A2 단백질을 케톤 화합물이 존재하는 조건하에 제공하는 단계를 포함하는 케톤 화합물을 베이어-빌리거 산화 반응시켜 락톤 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “분리된 CYP85A2”란 자연적으로 발생한 환경과 구별되는 물리적 환경에 다른 단백질로부터 충분히 분리된 “실질적으로 순수한” 상태로 존재하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어, “실질적으로 순수한”은 다른 생물학적 고분자가 실실적으로 없는 상태를 의미하고, 적어도 건조중량 당 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상 순수한 상태를 의미한다. 순수도는 컬럼 크로마토그래피, PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis), HPLC 분석 등의 적절한 방법으로 측정할 수 있다.

상기의 방법으로 다양한 락톤 화합물, 예들 들어 브라시노라이드를 생물학적 공정으로 생산할 수 있고 이들 화합물은 당 분야의 통상의 방법으로 분리할 수 있다.

효소를 사용하는 생물학적 공정으로 생산된 브라시노라이드는 식물의 생장 촉진제, 의약품 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다. 브라시노라이드의 생장 촉 진제로의 활성은 CN2003-135388, JP1988-232532, FR1985008513971 등에 기술되어 있다. 실제 본 발명자는, CUYP85A2의 기능이 상실된 cyp85a2 돌연변이체의 로제트 정중앙에 BL을 처리하면 잎자루(petiole)의 길이가 야생형으로 회복되는 등 표현형이 야생형과 비슷하게 회복되고 생식 능력도 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 종양 세포의 약물 저항성을 반전시키는 의약품으로서의 활성은 CN2003-140318 에 기술되어 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

애기장대에는 CYP85A1 (At5g38970)와 CYP85A2 (At3g30180)의 두 단백질이 브라시노스테로이드 C-6 oxidase로서 존재한다. 두 단백질은 단지 deoxoCS과 같은 탄소수 28개 (C28)인 브라시노스테로이드의 C-6 산화(oxidation)를 촉매하는 동일한 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 상기의 CYP85A1과 CYP85A2 단백질을 과발현하도록 형질전환된 효모 균주에 C27 브라시노스테로이드와 C28 브라시노스테로이드를 동시에 피딩한 뒤 그 대사산물의 비율을 비교한 결과 CYP85A2 단백질은 C28 브라시노테로이드뿐만 아니라 C27 브라시노스테로이드의 C-6 산화 또한 유사한 정도로 촉매함을 알 수 있었다. 그러나 CYP85A1은 C27 브라시노스테로이드에 대해서는 매우 낮은 활성을 나타내었다. 이에 CYP85A2와 CYP85A1은 C27 브라시노스테로이드와 C28 브라시노스테로이드에 대한 기질 특이성이 서로 다름을 확인하였다. 또한 CYP85A2의 경우 기존에 알려진 C-6 oxidase 활성이외에도 CS을 BL로 전환시킬 수 BL synthase 활성을 갖고 있음을 처음으로 제시하였다.

상기의 결과를 바탕으로 T-DNA 삽입에 의해 유도된 애기장대 돌연변이체들 중에서, 본 발명자들은 CYP85A2 유전자에 T-DNA가 삽입되어 결함이 생긴 순수 열성 돌연변이체를 분리하였으며, 이 돌연변이체는 CYP85A2 유전자의 결핍에 의해 나타나는 다양한 표현형을 갖는 것을 확인하였다.

또한, CYP85A2의 과발현 형질전환체를 제작하여 이의 생화학적 분석과 표현형을 야생형과 비교하였다. CYP85A2 과발현체는 CS의 BL로의 전환이 확인되는 bri1 돌연변이체와 마찬가지로 CS을 피딩할 경우 BL로 전환되는 것을 확인하였다. CYP85A2 과발현체의 표현형은 내생 BL의 함량이 증가하는 것으로 나타났으며 줄기 생장, 로제트 잎 및 꽃자루의 생장이 촉진되고 씨앗의 수확량이 30% 정도 증가하여 BL synthase인 CYP85A2의 인위적인 조작은 식물의 생장이 강화된 표현형을 만들 수 있음을 제시한다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 . BRs 관련 돌연변이체

본 발명에서 사용한 BRs 관련 돌연변이체는 미국 미시간 대학의 Jianming Li 교수로부터 기증받아 사용하였다. bri1 -9은 BRs의 수용체인 BRI1의 돌연변이로 BRs를 인식하지 못하는 bri1 돌연변이중의 하나로서 야생형에서는 검출되지 않는 BL가 검출될뿐만 아니라 CS의 BL로의 전환이 확인되는 것으로 알려져 있다.

bak1 (bri1-associated receptor kinase)은 BRI1과 결합하여 BRs의 신호전달 체계에 관여하는 BAK1 단백질이 결핍된 돌연변이체이다.

BRI1-GFP는 BRI1의 세포내 발현 위치를 확인하기 위해 BRI1의 프로모터와 유전자를 GFP (Green Fluorescence protein) 유전자에 결합시킨 결합체가 형질전환되어 야생형보다 2배 많은 BRI1을 가지는 돌연변이체이다.

참고예 . WAT21 효모 균주

본 발명에서 사용한 WAT21 효모 균주는 프랑스 국립 과학 연구센터(Franch National Center of Scienctific Research)의 Dr. D. Pompon으로부터 기증받아 사용하였다. WAT21 효모 균주는 애기장대 NADPH-CytP450 reductase 2가 형질전환되어 갈락토즈(galactose)에 의해 과발현이 유도되는 라인이다.

실시예 1. 시료 애기장대의 생장조건 및 시약

본 발명의 실험에서 사용한 모든 애기장대는 70% 상대습도와 16시간 명조건/8시간 암조건의 주기로 조절되는 온실에서 재배하거나 4℃로 처리된 애기장대 씨앗을 작은 화분 또는 1% 수크로즈(sucrose)를 함유하는 고형 MS 배지에 심어 생육하였다. 이때 각 씨앗은 70% 에탄올과 30% 표백제로 표면 살균하였다. 실험에 사용한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

실시예 2. CYP85A1 및 CYP85A2 의 이형적 발현( heterologous expression )

CYP85A1과 CYP85A2 유전자를 클로닝하기 위하여 애기장대 유묘로부터 추출한 RNA를 주형으로 MMLV 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 만들어진 cDNA로부터 다시 다음과 같은 프라이머를 사용해 CYP85A1 (At5g38970)와 CYP85A2 (At3g30180) cDNA만을 특이적으로 증폭하였다. (CYP85A1 forward, 5'-ggatccATGGGAGCAATGATGGTGATGAT-3'; CYP85A1 reverse, 5'-ggtaccTTAGTAGGGTGAAATCCTAAGATG-3'; CYP85A2 forward, 5'-ggatccATGGGCATAATGATGATGATTTTG-3'; CYP85A2 reverse,5'-ggtaccTCAGTAAGGTGAACACTTAAGATG-3'). 이때 PCR은 Ex Taq 폴리머라제 (Takara, Shuzo, Japan)을 사용하였으며 온도 조건은 94°C 20초, 61°C 30초, 그리고 72°C 2분을 32번 반복하였다. CYP85A1와 CYP85A2 PCR 산물은 각각 pGEMT easy vector (Promega)내로 클로닝한 뒤 DNA 서열분석을 통해 염기서열의 정확성을 확인하였다. 얻어진 플라스미드는 BamHI와 KpnI으로 절단하여 각각 pYeDP60 vector (V60)로 서브클로닝하였다. 최종적으로 얻어진 CYP85A1/V60/WAT21와 CYP85A2/V60/WAT21 효모 균주를 대상으로 BR의 대사산물을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 갈락토즈(Galactose)에 의해 과발현이 유도된 균주를 20 mL의 YPL 배지에서 OD₅₅₀가 0.4에서 0.6이 되도록 배양한 뒤 각각의 기질을 5 ㎍씩 넣어주었다. 6시간동안 계속 배양한 뒤 대사산물을 20 mL의 에틸아세테이트로 추출한 뒤 농축건조하였다. 얻어진 추출물은 실리카 컬럼 (SepPak SiO₂ Plus; Waters, Milford, MA)에 로딩한 뒤 8 mL의 클로로포름, 2% (v/v) 메탄올/클로로포름, 그리고 8% 메탄올/클로로포름을 순차적으로 흘려주었다. 8% 메탄올/클로로포름 분획은 다시 C18 컬럼 (SepPak C18 Plus; Waters)에 흡착시킨 뒤 10 mL의 50% 메탄올과 5 mL의 90% 메탄올로 흘려주었다. 90% 메탄올로 흘려준 분획은 건조시킨 뒤 소량의 메탄올에 녹여 역상 HPLC (SenshuPak C18, 10 x 150 mm)로 정제하였다. 이때 유속은 분당 2.5 mL로 흘려주었으며 용출 용매로는 45% 아세토나이트릴을 사용하였다. 표준 CS (19 to 21 min), 28-norCS (13 to 15 min), 그리고 BL (13 to 15 min)이 용출되는 시간대의 분획만들 모아서 비스메탄네보레네이션(bismethaneboronation)한 뒤 GC-MS로 최종분석하였다.

실시예 3. N-말단 부위가 맞바꾸어진 재조합 단백질의 제조

CYP85A1과 CYP85A2의 단백질 구조와 활성과의 상관관계를 이해하고자 두 효소의 N-말단 부위가 맞바꾸어진 키메릭(chimeric) 효소를 제작하였다. 두 유전자는 동일한 엑손과 인트론 구조를 가지며 516번째에 NdeI 제한효소 절단 부위를 가진다. 또한 이 유전자가 클로닝 되어있는 pGEM Teasy 벡터에도 한 곳의 NdeI 절단부위가 존재하는 점에 착안하여 두 유전자가 클로닝된 플라스미드를 각각 Nde1으로 절단한뒤 각각의 DNA 절편을 젤로부터 회수하여 서로 맞바꾸어 접합 (ligation) 하였다. DNA 서열분석을 통해 제작된 키메릭 cDNAs가 정확함을 확인하였으며 이를 다시 효모용 벡터인 pYeDP60으로 서브클로닝하였다.

실시예 4. 35S- CYP85A1 과 35S- CYP85A2 형질전환 식물체의 제작

5'과 3' 비번역 영역(untranslated regions) 부위를 포함하는 완전한 CYP85A1과 CYP85A2 cDNA (1667 bp)를 RT-PCR을 사용하여 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머는 다음과 같다. CYP85A1 forward, 5'-ggatccCTTTCTCTCTTTCTCTGGTCTGTT-3'; CYP85A1 reverse, 5'-gagctcGAGCTCGGGTTTAATATAGTAGAACATCATC-3'; CYP85A2 forward, 5'-ggatccAACCAAAGACTCTTAACCATCT-3'; CYP85A2 reverse, 5'-cgagctcACAACATTTCAAATATTTTATTT-3'.

증폭된 cDNA 절편은 각각 pGEM T easy 벡터로 클로닝 한 뒤 DNA 서열분석을 통해 확인하였다. 이상과 같이 얻어진 cDNA 플라스미드는 BamHI과 SacI 제한효소를 이용하여 식물 형질전환용 벡터인 pBI121 binary 벡터에 (CLONTECH, Palo Alto, CA) 최종적으로 서브클로닝 한 뒤 아그로박테리아 (GV 3101)에 전기영동을 통해 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아는 플로랄 디핑(floral dipping) 방법을 사용하여 형질전환 애기장대를 제작하였다. (Clough and Bent, 1998)

실시예 5. cyp85a1 과 cyp85a2 돌연변이체의 선벼로가 회복 실험

T-DNA가 삽입된 돌연변이 식물체 라인 (cyp85a1; SALK_148384, cyp85a2-1; SALK_056270, cyp85a2-2; SALK_068754)은 Salk SIGnAL 웹 사이트 (http://signal.salk.edu)에서 검색한 뒤 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, OH)로부터 공급받아 사용하였다. 이들로부터 삽입된 T-DNA의 정확한 위치를 찾고 순수열성 돌연변이체를 선별하고자 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. CYP85A1 forward 5'-ATGGGAGCAATGATGGTGATGAT-3', CYP85A1 reverse 5'-TTAGTAGGGTGAAATCCTAAGATG-3', CYP85A2 forward 5'- ATGGGCATAATGATGATGATTTTG-3', CYP85A2 reverse 5'-TCAGTAAGGTGAACACTTAAGATG-3', T-DNA left border 5'-CTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATA-3', T-DNA right primer 5'-ATATTTGCTAGCTGATAGTGACCTTAG-3'

cyp85a2 돌연변이체의 CS과 BL 처리에 의한 엽병의 신장여부를 조사하기 위해서는 5% 에탄올에 녹인 1 μM의 CS 또는 BL를 개화 줄기가 생기지 않은 로제트 중앙에 직접 처리하되 하루에 한번씩 5일간 실시 한 후 10일째 되는 날 엽병의 길이를 측정하였다. BR처리에 의한 웅성 불임의 회복 여부를 조사하기 위해서는 10-12cm 정도 자란 개화줄기의 플로랄 버드(floral buds)에 1 uM의 BR을 하루에 한번씩 3일간 처리한 뒤 5일후 실리크의 생성여부를 관찰하였다.

실시예 6. RT - PCR 을 통한 CYP85A1 와 CYP85A2 의 발현 변화 조사

다양한 유전형의 식물체들로부터 추출한 RNA를 대상으로 MMLV 역전사효소를 이용해 cDNA를 일차적으로 합성하였다. RT 산물을 주형으로 하여 다음과 같은 프라이머를 이용한 PCR을 통해 CYP85A1과 CYP852의 발현양을 조사하였다. CYP85A1 forward, 5'-ATGGGAGCAATGATGGTGATGAT-3'; CYP85A1 reverse, 5'-TTAGTAGGGTGAAATCCTAAGATG-3'; CYP85A2 forward, 5'-ATGGGCATAATGATGATGATTTTG-3'; CYP85A2 reverse,5'-TCAGTAAGGTGAACACTTAAGATG-3'). 또한 표준화(normalization)를 위해 사용한 UBQ5의 프라이머로서는 forward, 5‘-GACCATAACCCTTGAGGTTGAATC-3’와 reverse, 5‘-AGAGAGAAAGAGAAGGATCGATC-3’를 사용하였다.

실시예 7. 피딩 ( Feeding ) 실험

야생형인 Col-0, 35S-CYP85A2와 BR 불감수성 돌연변이체 (bri1 -9)을 사용하여 BRs의 피딩 실험을 실시하였다. 표면 소독된 씨앗을 고형 MS 배지에서 7일간 생육시킨다음 이를 각각 30 mL의 액체 MS 배지가 들어있는 250 mL 크기의 삼각 플라스크로 30 또는 60 개체씩 옮긴 뒤 120 rpm으로 5일간 진탕배양하였다. 5일 뒤 기질로서 5 ug의 [²H₆]6-deoxoCS와 10 ug의 [²H₆]CS을 각각 피딩하고 4일간 동일조건하에서 배양하였다. 4일후 유묘와 액체 배지를 각각 메탄올과 클로로포름으로 추출한 뒤 농축 건조 하였다. 30-60 개체의 애기장대 유묘에 존재하는 내생 BRs의 함량은 거의 무시할 만한 수준이기 때문에 정량분석을 위한 표준화합물로서 CS과 BL를 각각 넣어주었다. 이후의 BRs 정제과정은 상기 실시예 2과 동일한 방법을 사용하였다.

실시예 8. 애기장대에서 내생 BRs 함량의 정량적 분석

야생형 (45 g), cyp85a2-1 (30 g), cyp85a2-2 (30 g), cyp85a1(40 g), 35S-CYP85A2 (45 g), 그리고 35S-CYP85A1 (45 g) 식물체들을 흙에서 6주간 생육시킨 뒤 수확하여 300 mL의 90% 메탄올로 각각 3번씩 추출한 뒤 중수소로 표지된 6-deoxoCS, CS와 BL를 정량 분석을 위해 250 ng 씩 넣어주었다. 얻어진 추출물은 다시 물과 클로로포름으로 solvent partitioning 한 뒤 클로로포름 층만을 농축건조하였다. 클로로포름 가용분획은 다시 80% 메탄올/n-헥산과 에틸아세테이트/인산 버 퍼 조합으로 partitioning하여 최종적으로 에틸아세테이트 가용분획을 얻었다. 에틸아세테이트 가용구는 소량의 클로로포름에 녹여 실리카 겔 크로마토그래피에 로딩한 뒤 150 mL의 용출 용매 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100% 메탄올/클로로포름, v/v)를 차례로 흘려주었다. 3에서 7% 메탄올 분획만을 모아 농축건조한뒤 이를 다시 SepPak C18 컬럼을 통해 정제하였다. 얻어진 분획은 다시 소량의 메탄올에 녹여 역상 HPLC를 이용해 최종정제를 시도하였다. 이때 컬럼은 SenshuPak C18 (10 x 150 mm)을 사용하였으며 농도구배의(gradient) 용매조건을 사용하여 0-20분; 45% 아세토나이트릴 용액, 20-40분; 41-100% 아세토나이트릴 용액, 40-70분; 100% 아세토나이트릴 용액을 분당 2.5 mL의 유속으로 차례로 흘려주었다. 표준 6-deoxoCS, CS와 28-norCS/BL의 용출시간이 동일 HPLC 조건에서 각각 41-43분, 19-21분, 13-15분인 점을 감안하여 각각에 해당하는 분획만을 모아 비스메탄네보레네이션(bismethaneboronation)화 한 뒤 최종적으로 GC-MS로 분석하였다. .

실시예 9. GC - MS

GC-MS 분석은 휴렛-팩커드 6890 가스 크로마토그래피와 연결된 Hewlett-Packard 5973 질량분석기를 사용하였다. 이때 질량분석기는 전자충격 이온화형으로 70 전자 전압(electron voltage)을 사용하였으며 가스 크로마토그래피에 사용된 컬럼은 HP-5 (0.25 mm x 30 m, 0.25-μm 필름 두께)를 이용하여 오븐 온도를 175°C에서 2분, 280°C까지 매분 40°C 증가시킨 뒤 280°C에서 계속 유지하였다. 운반 가스로는 헬륨을 분당 1 mL의 유속으로 흘려주었다.

GC-MS 분석전 수산화기를 가진 화합물들은 모두 메탄네보로닉산(methaneboronic acid)/피리딘 용액에 녹인 뒤 80°C에서 30분간 가열하여 유도체화 한 뒤 분석하였다.

실험예 1. CYP85A1 과 CYP85A2 과발현 효모 균주에 브라시노스테로이드의 피딩 및 대사산물 분석

CYP85A1와 CYP85A2 단백질을 과발현하도록 형질전환한 각각의 효모 균주(CYP85A1/V60/WAT21와 CYP85A2/V60/WAT21)에 동량의 6-deoxo-28-norcastasterone(6-deoxo-28-norCS)과 6-deoxocastasterone (6-deoxoCS)를 피딩한 뒤 그 대사산물의 함량을 비교하였다. 그 결과 도 2a와 2b에 나타낸 것과 같이 두 효소의 기질 특이성이 확연하게 다를 뿐만 아니라 CYP85A2의 경우 BL synthase의 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 표 1은 CYP85A1과 CYP85A2를 형질전환시킨 효모균주에 deoxoCS, CS을 각각 피딩(feeding)한 후 각각의 대사산물을 분석한 결과로서 BL synthase 활성은 CYP85A2의 경우만이 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 C-6 oxidase의 활성만을 상세비교하기 위하여 상기의 두 효모 균주에 6-deoxoCS을 농도별로 피딩한 뒤 그 대사산물의 양을 분석한 결과 CYP85A2가 CYP85A1보다 휠씬 높은 C-6 oxidase 활성을 가지고 있음을 확인하였다 (도 2c). 도 2d는 CYP85A1과 CYP85A2 단백질의 아미노산 서열을 비교한 것으로서 두 단백질간의 상동성이 매우 높음에도 두 효소간 기질 특이성이 크게 차이나는 것을 알 수 있다. 한편, 두 단백질의 N-말단 부위를 재조합시킨 단백질의 경우 기질특이성이 어떻게 변화하는 지 조사한 결과 CYP85A2의 N-말단 영역이 C27 BRs의 인식에 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다. (도 2e 와 2f).

실험예 2. CYP85A2 순수 열성 돌연변이체의 분리 및 표현형 비교

애기장대 생물자원센터 (Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)로부터 솔크 연구소 (Salk Institute)의 CYP85A2 유전자에 T-DNA 삽입되어 있는 것으로 예상되는 돌연변이군을 분양받아 본 발명에 사용하였다.

2-1. CYP85A2 돌연변이체 탐색

T-DNA Left border 프라이머와 CYP85A2 특이적 프라이머를 사용한 PCR을 통하여 두개의 독립적인 cyp85a2 결핍 돌연변이체 라인을 분리하였다. T-DNA가 삽입된 위치를 확인한 결과 도 3a에 나타낸 것과 같이 cyp85a2 -1은 CYP85A2 유전자의 첫 번째 엑손인 267번째 염기사이에 T-DNA 삽입되었고 cyp85a2 -2는 여덟 번째 엑손인 2542번째 염기에 T-DNA 삽입되어있는 것으로 나타났다. 이들 cyp85a2 돌연변이체는 둘 다 CYP85A2의 정상적인 mRNA 전사가 전혀 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 이들 돌연변이체는 CYP85A2의 결핍에 의한 CS의 부족을 보상하기 위하여 또 다른 BRs C-6 oxidase인 CYP85A1의 발현이 크게 증가하여 있는 것으로 나타났다 (도 3b).

2-2. cyp85a2 돌연변이체의 표현형 비교

최종적으로 선별된 cyp85a2 순수열성 돌연변이체는 야생형에 비해 로제트 잎의 모양이 둥글고 짧은 잎자루(petiole)를 가지는 표현형을 보였다 (도 3c). 또한 시딩(seeding) 시기부터 야생형보다 약간 작으며 성숙한 개체일 때에도 야생형보다 전반적으로 늦은 생장율을 나타내었다 (도 3d-3e). 또한 콜린 잎의 개수가 1개인 야생형과 달리 돌연변이체의 경우 2-4개까지의 콜린 잎이 생성되었다 (도 3f). 또한 cyp85a2 돌연변이체는 볼팅 초기에는 정상적인 실리크의 형성이 일어나지 않지만 성숙한 단계로 접어들면 정상적인 생식 능력을 나타내었다 (도 3g). 이러한 돌연변이체의 볼팅 초기에 핀 꽃을 현미경으로 관찰한 결과 돌연변이체의 경우 야생형과 달리 수술대가 정상적으로 신장되지 못하기 때문인 것으로 알 수 있었다 (도 3h-3i).

실험예 3. BL 와 CS 의 외부처리에 의한 cyp85a2 돌연변이체의 회복

상기의 표현형 관찰을 통하여 cyp852 돌연변이체는 야생형에 비해 커다란 표현형의 차이를 나타내지는 않으나 로제트 잎의 모양과 볼팅 초기의 생식능력저하라는 특징적인 표현형을 나타내었다. 이에 이러한 돌연변이의 표현형이 CS과 BL에 의해 야생형으로 회복될 수 있는지를 조사하였다.

3-1. CS 과 BL 에 의한 cyp85a2 돌연변이체의 잎자루( petiole ) 길이 회복 여부 조사

볼팅(bolting) 직전의 cyp85a2 돌연변이체의 로제트 정중앙에 1 uM의 CS 또는 BL를 일일 1회씩 일주일간 처리하여 잎자루(petiole)의 길이가 야생형으로 회복되는지를 조사한 결과 도 4a -4c에 나타낸 것과 같이 용매만을 처리한 대조군에 비하여 CS과 BL를 처리한 모두에서 잎자루의 길이가 야생형과 비슷하게 회복되었다.

3-2. CS 과 BL 에 의한 cyp85a2 돌연변이체의 생식능력 회복 여부 조사

볼팅 초기의 돌연변이체의 꽃에 1 uM의 CS 또는 BL를 일일 1회씩 일주일간 처리한 뒤 실리크(silique)의 생성 여부를 조사한 결과 도 4d-4e에 나타낸 것과 같이 CS과 BL 모두 돌연변이체의 생식능력을 회복시키는 것으로 나타났다.

이상과 같이 돌연변이체의 표현형이 BRs의 생합성 최종 산물인 BL 뿐만 아니라 전구체인 CS에 의해서도 회복되는 결과는 cyp85a2 돌연변이체가 나타내는 표현형이 BL의 결핍 때문이 아닌 CS의 부족 때문임을 의미한다. 이는 또한 BL이외에 CS 자체가 식물체에서 생리활성을 나타낼 수 있는 활성형의 BR임을 증명하는 결과이다.

실험예 4. CYP85A2 과발현체의 표현형 및 생화학적 분석

4-1. CYP85A2 과발현체의 생화학적 분석

식물체에서 CYP85A2의 생리학적 중요성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 CYP85A2를 과발현하는 애기장대 (35S- CYP85A2 ) 형질전환체를 제작하였다. 과발현 형질전환체 제작과정에 사용된 벡터의 종류(프로모터, 벡터의 기원 등의 포함하는) 및 제작된 7개의 독립적인 형질전환체에서 CYP85A2의 발현수준을 RT-PCR을 통해 조사한 결과 야생형에 비해 CYP85A2의 발현이 매우 높게 유지되고 있는 것으로 나타났으며 CYP85A1의 발현에는 큰 변화가 없는 것으로 나타났다(도 5a). 이러한 결과를 바탕으로 이들 35S-CYP85A2 식물체에 deoxoCS과 CS을 피딩한 후 그 대사산물을 조사한 결과 야생형에서는 확인되지 않는 CS의 BL로의 전환이 확인되었을 뿐만 아니라 야생형보다 높은 6-deoxoCS C-6 oxidase 활성 또한 가지고 있는 것으로 나타났다 (도 5b). 한편, Noguchi (Plant Physiol., 124, pp201-209, 2000)등은 bri1 -9와 같은 BRs 불감성 돌연변이체에서 야생형에서는 확인되지 않는 CS의 BL로의 전환이 확인됨을 보고하였는데 본 실험에서는 BRs 불감성 돌연변이체에서의 CYP85A2의 발현을 조사하였다. 도 5c에 나타낸 것과 같이 bri1 -9과 bak1 돌연변이체의 경우 CYP85A1의 발현은 큰 변화가 없는 반면 CYP85A2의 발현에 높은 수준으로 유지되고 있는 것으로 나타났다. 또한, bri1 -9에 deoxoCS과 CS을 피딩한 결과 35S-CYP85A2와 같이 deoxoCS이 CS을 거쳐 BL로 전환되는 것으로 나타나(도 5b) CYP85A2가 식물에서 BL synthase의 활성을 갖는 효소임을 명확하게 증명하였다.

4-2. CYP85A2 과발현체의 표현형 비교

상기의 실험결과를 바탕으로 35S-CYP85A2의 표현형을 야생형과 함께 비교하였다. 도 5d에 나타낸 것과 같이 다자란 35S-CYP85A2 식물체는 야생형보다 훨씬 키가 크고 많은 가지수를 나타내었다. 또한 실리크(silique)가 야생형보다 크고 페디셀(pedicel)도 야생형보다 길게 생장하여 결과적으로 야생형보다 씨앗의 수확량이 30% 정도 증가한 것을 알 수 있었다 (도 5e-5f). 결과적으로 CYP85A2은 과발현을 통해 식물에게 있어 전반적인 생장을 촉진시키고 열매의 생산량을 증가시킬 수 있는 매우 중요한 유전자임을 확인하였다.

실험예 5. CYP85A1 순수열성 돌연변이체와 과발현체의 표현형 분석

BR C-6 oxidase 뿐만 아니라 BL synthase 활성을 가지고 있는 CYP85A2와는 달리 오로지 BR C-6 oxidase 활성을 가지는 CYP85A1는 식물체에서 얼마만큼의 중요성을 가지는지 비교하기 위하여 CYP85A1 순수열성 돌연변이체를 선별하고 이의 과발현체를 제작하여 그 표현형을 야생형과 비교하였다. 제작된 4개의 독립적인 35S-CYP85A1 식물체는 모두 야생형에 비해 높은 CYP85A1의 발현수준을 나타내지만 (도 6a) 야생형과 비교하여 전반적인 생장패턴의 변화가 나타나지 않았다 (도 6b). 또한 CYP85A1의 순수열성 돌연변이체인 cyp85a1 식물체의 경우에도 야생형보다 부족한 생장을 나타내는 식물체에 비교할 때 정상적인 생장을 나타내었다 (도 6c-6d). 이러한 결과는 애기장대 CYP85A1의 경우 CYP85A2와 일부 중복된 기능을 가지고 있지만 애기장대가 CYP85A2만 존재할 경우에도 정상적인 생장을 할 수 있음을 의미하는 것으로 CYP85A1은 CYP85A2의 보조적인 역할을 하는 유전자로서 생각되어진다.

실험예 6. CYP85A1 과 CYP85A2 관련 순수열성돌연변이체와 과발현체에서의 내생 BRs 의 함량분석

이상과 같은 CYP85A1과 CYP85A2 관련 돌연변이 및 형질전환체의 표현형이 실제 식물체가 가지고 있는 내생 BRs의 함량변화를 통해 나타나는 것인지 보다 구체적으로 확인하기 위하여 상기의 식물체들을 대상으로 내생 BRs의 함량을 조사하였다. 표 2에 나타낸 것과 같이 cyp85a2 돌연변이체는 야생형과 마찬가지로 BL가 검출되지 않고 내생 CS의 함량이 20-30% 정도 낮게 존재하는 것으로 나타났다. 이처럼 cyp85a2 결핍 돌연변이체가 내생 CS의 함량이 크게 줄어있지 않은 것은 CYP85A1의 기능적인 redundancy가 존재하고 있음을 나타내는 도 3b에 나타낸 결과를 통해 설명되어 질수 있다. 또한, 20-30%의 CS의 부족은 cyp85a2 결핍돌연변이체가 난쟁이화 또는 완전 불임과 같은 극심한 표현형을 나타내지 않고 약한 비정상도를 나타내는 것과 일치한다. 한편, 생장촉진현상을 보이는 CYP85A2 과발현체의 경우 28-norCS과 CS이 각각 25%와 30%정도씩 증가한 것으로 나타났으며 야생형에서는 확인되지 않는 BL 또한 검출되었다. 이와같이 CYP85A2 과발현체의 경우 CS 뿐만 아니라 가장 활성이 강한 BRs인 BL의 축적을 통해 식물로 하여금 높은 생장율과 생식능력 증가가 유도되어짐을 알 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본발명의 베이어-빌리거 산화(Baeyer-Villiger oxidation) 활성을 가지는 CYP85A2 단백질을 이용하여 식물의 생장을 효과적으로 조절할 수 있을 뿐만 아니라 브라시노라이드 등의 락톤 화합물을 효과적으로 생산할 수 있다.

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8. (a) CYP85A2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

   (b) 상기 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 브라시노라이드 합성을 증가시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라(Gervera), 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스(ryegrass), 레드 클로버(red clover), 오차드 그라스(Orchard grass). 알파파(Alfafa), 톨페스큐(Tall fescue) 및 페레니얼 라이그라스 (Perennial ryegrass)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. (a) CYP85A2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

    (b) 상기 발현 벡터로 원핵생물 또는 진핵생물을 형질전환하는 단계; 및

    (c) 상기 형질전환된 원핵생물 또는 진핵생물을 카스타스테론이 존재하는 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하는 브라시노라이드를 생산하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 원핵생물이 박테리아인 방법.
12. 제10항에 있어서, 진핵생물이 효모 또는 식물인 방법.
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