KR101815737B1 - 식물 성장 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CYP705A13 유전자, 그 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터를 포함하는 형질전환 식물체 및 그 유전자를 과발현시켜서 식물 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 유용한 농경 작물의 생산과 품질 향상 및 생산량 증대에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

식물 성장 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물체{GENE FOR PROMOTING PLANT GROWTH AND A TRANSGENIC PLANT COMPRISING THE SAME}

본 발명은 식물성장 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 CYP705A13 유전자, 그 유전자를 포함하는 형질전환 벡터, 그 벡터를 포함하는 형질전환 식물체 및 그 유전자를 과발현 시켜서 식물 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

유기 비료를 사용하여 농작물의 수율을 향상시키는 것은 잘 알려져 있고 수 세기간 행해져 왔으나, 최근에는 생명공학기술을 이용하여 식물 성장을 촉진시켜 바이오매스(biomass)를 증가시키기 위한 시도들이 활발하게 이루어지고 있다.

생명공학기술을 이용하여 작물의 수확율을 향상시키는 방법은 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 하나는 각종 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 조건에 대한 내성이 증가된 작물 품종을 개발함으로써 작물 수확율 손실을 감소시키는 것이고, 다른 하나의 방법은 기본 수확율 능력이 증가된 새로운 작물 품종을 개발하는 것이다.

생명공학기술을 바탕으로 하는 보다 최근에 개발된 시도는 기본적으로 식물 성장 및/또는 발달에 있어서 중요한 역할을 하는 식물 유전자의 발현의 시기, 위치 또는 수준을 변경시킴으로써 작물 수확율의 실질적인 향상을 달성하기 위한 잠재능을 제공하는 것이다. 식물 성장 조절과 작물의 수확율 특성 사이의 관계는 매우 복잡하기 때문에, 수많은 유전자들 중 작물 수확율을 향상시키기 위한 명백한 후보가 될 수 있는 유전자를 발견하는 것은 매우 어려운 일로 인식되어 왔다.

구조적으로 동물의 스테로이드와 유사한 폴리하이드록시스테로이드인 브라시노스테로이드 (Brassinosteroids , BR)는 식물의 전 일생에 걸쳐 줄기의 성장이나, 유관속계의 발달, 웅성 배우체의 성장 등 광범위한 식물체의 세포 과정에 영향을 미치는 중요한 식물성 스테로이드 호르몬이다. 가장 생물학적으로 활성이 높은 브라시노스테로이드인 브라시놀라이드 (BL)를 포함하여 70개가 넘는 BR 유도체들이 Brassica napus의 화분, Catharanthus roseus 현탁 배양액과 아라비돕시스에서 검출되었다 (Bajguz and Tretyn 2003; Mandava 1988; Yokota et al. 1992). BR이 식물에 처리되면 세포의 길이 생장과 분화, 그리고 노화와 생식, 다양한 스트레스에 대한 반응성이 변하는 한편, BR의 생합성이나 인식에 문제가 생긴 돌연변이체들은 세포 생장이 감소하거나 짙은 녹색과 구부러진 모양의 잎을 보여주며 개화와 노화가 늦어지는 표현형이 나타나는 것으로 보고되었다. 이는 BR이 식물의 성장과 발생을 조절하는 중요한 식물호르몬임을 시사한다 (Li et al. 1996; Szekeres et al. 1996).

BR의 생합성 경로는 주로 아라비돕시스에서 성장이 지연된 돌연변이체를 선별하여 BR의 전구 물질들을 단계별로 피딩하면서 기체 크로마토그래피 질량분석법(GC-MS)을 통해 분석하는 방법으로 이루어졌다 (Fujioka and Yokota 2003). 그 결과 현재 BR의 생합성은 콜레스테롤을 기본 구조로 한 시클로아르테놀 (cycloartenol)로부터 여러 단계의 생합성과정을 거쳐 최종적으로 카스트아스테론 (castasterone, CS) 이나 브라시놀라이드 (BL) 단계에 이르는 것이 밝혀졌다. 이 과정의 화학반응에는 옥시다아제, 리덕타아제, 하이드록실라제들이 작용하는데 그러한 역할을 담당하는데 싸이토크롬 일산소첨가효소(monooxigenase)인 P450 단백질 패밀리가 중요하다는 것이 밝혀졌다. 특히 CYP90과 CYP85 서브패밀리가 BR의 생합성에 직접적인 역할을 하고 있다. 그런데 최근에는 BR의 생합성이 그동안 밝혀졌던 기존의 효소들이 보다 다양한 기질을 사용하는 다중 경로에 의해서 진행되는 것으로 보고되고 있다 (Choe et al. 2001; Fujioka and Yokota 2003).

BR의 신호전달은 세포막에 존재하는 류신-풍부-반복 세린/트레오닌 수용체-유사 키나제 (leucine rich-repeat serine/threonine receptor-like kinase) (LRR-RLK)의 한 종류인 BRI1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1) 단백질에 의해 시작된다 (Belkhadir and Chory 2006). BR이 존재하지 않을 때 BRI1의 음성 조절자인 BKI1 (BRI1 KINASE INHIBITOR 1)이 BRI1의 C-terminal tail에 결합하여 BRI1의 활성이 억제된다 (Wang et al. 2005; Wang and Chory 2006). BR이 BRI1에 결합하면 BKI1이 BRI1으로부터 분리되고 co-receptor인 BAK1 (BRI1-Associated Receptor Kinase 1)이 BRI1과 결합하여 두 단백질 사이에 인산화반응이 일어나면서 수용체 복합체가 활성화 된다. 그 후 BRI1/BAK1을 통한 BR 시그널은 cytoplasmic kinase protein인 BSK (BR-Signaling KINASE)와 CDG1 (CONSTITUTIVE DIFFERENTIAL GROWTH 1), 포스파타아제인 BSU1 (BRI1 억제자1), GSK3-유사 키나제인 BIN2 (BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2) 단백질들의 활성 변화로 이어진다 (Tang et al. 2008; Tang et al. 2011; Kim et al. 2011; Li and Nam 2002). 결과적으로 BSU1에 의한 BIN2의 탈인산화로 BIN2의 역할을 억제되고, 그 결과 bHLH 전사인자인 CYP705A13 (BRI1-EMS-억제자1, BZR2)과 BZR1 (BRASSINAZOLE-RESISTANT1)의 핵내 축적을 일으켜 BR 표적 유전자들의 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다 (Tang et al. 2011).

최근에는 위와 같이 각기 정립되어 있는 BR 생합성과 신호전달 체계가 어떻게 상호적으로 조절되는지를 규명하는 연구가 진행되고 있다. 현재 CYP705A13과 BZR1을 통하여 DWF4 , CPD와 다른 생합성 관련 유전자들의 발현을 억제함으로써 BR 생합성을 억제된다고 보고되었다. 한편 BR 생합성과 신호전달 체계에 관련된 효소와 전사조절인자 등은 다른 식물호르몬 활성을 조절하기도 하면서 BR과 다른 식물호르몬의 cross-talk을 가능하게 하기도 한다. 옥신에 의하여 유도되는 BRX 유전자의 발현은 CPD 유전자의 발현을 증가시킴으로써 줄기와 뿌리의 성장을 유도하고, BR 신호전달이 활성화되면 BRX 유전자의 발현이 억제된다는 보고는, BRX가 뿌리 성장 조절에서 옥신 시그널링과 BR 시그널링의 피드백 경로를 조절하고 있음을 나타낸다. DWF4 역시 옥신 반응성 요소(AuxRE)를 통하여 옥신 시그널링을 유도하며, DWF4 프로모터에 대한 BZR1의 결합을 감소시키는 것으로 나타났다. DWF4의 발현은 bHLH 전사인자인 TCP1과 CESTA (CES)에 의해서도 조절된다. TCP1의 R-도메인이 DWF4 프로모터에 결합하는 것이 ChIP 분석을 통해 밝혀졌고, CES 유전자를 과발현시킨 형질전환체에서 내생 BR 농도가 증가하였고, BR 생합성 유전자인 DWF4와 CPD의 발현 또한 증가하는 것으로 나타났다. CES 단백질이 CPD 프로모터의 G-box (CACGTG)와 결합하는 것이 증명되었다. 또한 CES 유전자의 발현이 BR에 의해 유도되며, BR 신호전달의 양성 조절자인 BEE1, BEE2, BEE3 전사인자와 직접적으로 상호작용하는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과들은 CES 단백질이 BR 시그널링에 의하여 조절되며 어떻게 BR 신호전달체계 요소인 CYP705A13과 BZR1, TCP1과 CES, BEEs들이 유기적으로 BR 생합성을 조절하는지 밝혀주는 중요한 지표이다 (Poppenberger et al. 2011; Guo et al. 2010).

그러나 아직까지 BR 생합성 관련 유전자와 관련하여 유전자 조작 기술에 의해 식물의 성장을 촉진시키는 유전자 또는 그 방법에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다. 따라서 BR 생합성 관련된 식물의 성장을 촉진할 수 있는 유전자의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 식물 성장 및/또는 발달에 관여하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 성장 촉진 유전자에 의해서 형질전환되어 생산성이 향상된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 성장 촉진 유전자를 이용하여 식물의 성장을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 서열번호 2로 표시되는 단백질을 암호화하고, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는, 식물의 성장을 촉진하기 위한 CYP705A13 유전자에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 상기 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1의 염기 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CYP705A13-D 단백질을 코딩하는 재조합 DNA가 세포들의 게놈 내로 삽입된 식물로서, 상기 단백질의 과발현이 의해서 식물의 성장이 촉진되는 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 플라즈미드로 식물을 형질전환시켜 변형된 CYP705A13 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 식물의 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, CYP705A13 유전자를 과발현시키는 경우에 야생형에 비하여 그 성장이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법에 의하면 유용한 농경 작물의 생산과 품질 향상 및 생산량 증대에 크게 기여할 수 있을 것이다.

도 1(A)는 WS (야생형), bak1 -2, 및 bak1 - SUP2의 장미모양 잎(4w), 및 키(6w)의 표현형을 비교한 사진이고, 도 1(B)S는 WS, bak1 -2, 및 bak1 - SUP2의 잎의 폭, 잎의 길이, 잎꼭지의 길이, 및 키(height)의 성장 측정 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 2는 본 발명의 유전자 구조 내의 T-DNA 삽입 부위를 나타낸 모식도이다.
도 3은 bak1 - SUP2에서 At2g14100의 상대적인 발현을 나타낸 막대 그래프이다.
도 4는 WS, bak1 -2, 및 bak1 - SUP2, 및 cyp705a13 -D의 장미 모양 잎 (4w), 키(6w), 장각과(silique) (6w)의 표현형을 나타낸 사진이다.
도 5는 WS, bak1 -2, 및 bak1 - SUP2, 및 cyp705a13 -D의 잎의 폭, 잎 길이, 잎꼭지 길이, 키, 장각 길이, 화경 길이(peduncle length)의 성장 측정 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 6은 cyp705a13 -D /det2 이중 돌연변이체의 표현형을 나타낸 것으로, 도 6 (A)는 cyp705a13 -D /det2 의 장미보양 잎(4w), 키(6w)의 표현형을 나타낸 사진이고, 도 6 (B)는 cyp705a13 -D /det2 의 키, 잎의 폭, 잎 길이, 장각 길이의 성장 측정 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 7은 본 발명의 CYP705A13 -D 유전자를 포함하는 식물체의 성장이 촉진되는 것을 도시한 것으로, 도 7(A)는 현미경 사진이고, 도 7(B)는 배축 6번째 및 7번째 세포의 길이를 비교한 막대 그래프이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 간략화하거나 생략하기로 한다.

본원에서 사용되는 경우에, "유전자"라는 용어는 암호화 서열 및 연관된 발현 조절 서열을 의미한다. 암호화 서열은 특정 유전자에 따라 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA일 수 있는 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예로는 프로모터 서열, 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열이 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "벡터" 또는 "발현벡터"라는 용어는 외부 DNA에 이를 삽입시킬 수 있는 DNA 가닥을 말한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본원에서 사용되는 경우에, 용어 "형질전환 유전자 벡터"는 DNA의 삽입된 분절, 즉, 숙주 세포 내에서 mRNA내로 삽입되거나 또는 RNA로서 복제되는 "형질전환 유전자"를 의미한다.

본원에서 사용되는 경우에, "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 기관, 종자 및 식물 세포 및 이의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로　단자엽　식물 및 쌍자엽 식물 둘　다를 포함하는 형질전환 기술에 적용가능한 고등 식물의 부류, 및 조류와 같은 특정의 하등 식물과 같이　광범위하다. 이는 배수체, 이배체 및 반수체를 포함하는 각종의 배수성 수준의 식물을 포함한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "형질전환된 식물체"라는 용어는 프로모터와 작동 가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 외인성 DNA 구조체에 의해 형질전환된 식물체를 의미한다.

본 발명의 하나의 양상은 서열번호 2의 단백질을 암호화하고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 성장을 촉진하기 위한 CYP705A13 유전자에 관한 것이다. CYP705A13 유전자는 아리비돕시스탈리아나로부터유래되는것이지만, 관심대상의 다른 종으로부터의 CYP705A13 유전자 또는 유사 유전자도 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CYP705A13 유전자는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다.

싸이토크롬 P450 일산소첨가효소(monooxygenases) (싸이토크롬 P450s, CYPs)는 헴 코팩터 (heme cofactor)를 포함하고 있는 헴 단백질(heme protein) 수퍼패밀리에 속하는 단백질이다. CYPs는 생명체 내에서 방대하고 다양한 반응에 참여하고, 대개는 전자전달계에서 터미널 옥시다제(terminal oxidase)로 작용하는 효소로 크고 작은 다양한 기질에 대한 반응성을 보인다. CYP 단백질은 이. 콜라이(E. coli)를 제외한 동. 식물, 균류, 원생생물, 박테리아, 고세균, 심지어 바이러스와 같은 모든 생명체에서 확인 되었으며 게놈 프로젝트의 결과로 잘 보고 되어있고, C. elegans는 약 80개, 아라비돕시스탈리아나(A. thaliana ) 는 약 280개가 보고되었다. 아라비돕시스 게놈에는 적어도 45개의 P450 패밀리가 존재한다. P450s는 보존 도메인(conserved domain)을 가지고 있으며 인트론-엑손 경계가 P450 유전자들의 관련된 서브패밀리 안에서 보존적으로 존재한다. 이러한 것들이 진화적 관련성을 제공해준다.

인간의 경우 인간 게놈 프로젝트에 의하여 57개의 P450가 확인되었고, 대부분 미토콘드리아의 내막이나 세포 내 ER에 존재하는 막-결합 단백질인 것이 밝혀졌다. 보통 CYP의 기질은 매우 다양하지만, CYP19 (aromatase)와 같은 몇몇 CYPs는 다른 CYP들이 다중 기질을 대사할 때 오직 하나 또는 극소량의 기질만을 대사하기도 한다. 이러한 성질이 그것들을 약으로 사용할 수 있는 중요한 결정적 요인이 된다. 싸이토크롬 P450는 신체의 대부분 조직에서 존재하며, 에스트로젠과 테스토스테론과 같은 호르몬 형성과 대사작용, 콜레스테롤 합성, 비타민 D 대사에 중요한 역할을 한다. 싸이토크롬 P450는 또한 약을 포함한 간에서 생성되는 빌리루빈의 대사를 포함한 독극물 대사에 관여할 가능성도 있다.

식물의 P450는 식물 호르몬의 생합성과 phenylpropanoids, flavonoids, alkaloids, terpenoids, lipids, cyanogenic glycosides, glucosinolates와 같은 이차대사산물의 생성을 매개하는 다양한 반응을 촉매한다. 또한 P450는 외부로부터 들어온 제초제와 같은 비생체성분(xenobiotics)의 대사도 관여한다. 식물에서 대부분의 P450의 활성은 ER (endoplasmic reticulum)과 관련되어 있다. 최근 분자 유전학 연구를 통해 식물의 성장, 발달에 관여하는 식물 호르몬의 생합성에 관여하는 P450가 밝혀졌다 (Meunier B et al. 1988; Mansuy, 1998; Werck-Reichhart and Feyereisen, 2000; Bernhardt, 2006).

식물의 BR 신호전달 과정의 경우 BR 자체의 생합성은 여러 종류의 P450의 활성이 필요한 과정이다. 이제까지 보고된 BR 생합성 관련 CYP90A1 (CPD), CYP90B1 (DWF), CYP90C1 (ROT3), CYP90D1, CYP85A1, CYP85A2와 BR 이화작용(catabolism)에 관련된 CYP734A1 (CYP72B1, BAS1)과 CYP72C1 (SOB7/CHI2/SHK1)등은 전제 CYP의 분류기준에 의하면 비-A-타입에 속하고, 주로 비-A-타입 (non-A-type)에 속하는 P450은 스테롤이나 산소화 지방산 등과 같이 동, 식물 모두에 존재하는 물질의 대사 과정과 보다 더 밀접하게 연과 되어 있는 것으로 알려지고 있다. 이에 반해 A-타입에 속하는 P450s은 식물특이적인 이차 대사산물들의 대사와 관련이 있다. 그런데 본 발명자들이 발견한 CYP705 서브패밀리는 바로 이러한 분류상으로는 A-타입에 속한다. 아직까지 A-타입 CYP705 서브패밀리에 대해서는 개별적인 연구는 전혀 진행되지 않았다. 본 발명자들은 A-타입에 속한 CYP705 패밀리 중의 한 유전자가 식물의 성장을 촉진시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CYP705A13 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 실질적 동일성을 가지는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 염기 서열의 "실질적인 동일성"이란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 표준 매개변수를 사용하여 하기 기술한 프로그램을 사용하여 참조 서열과 비교할 때 60% 이상의 서열 동일성, 통상적으로 70% 이상, 보다 통상 적으로 80% 이상 및 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다.

서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 예는 문헌(참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)에 기술된 BLAST 알고리즘이다. "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 또한, 애기장대 유래의 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 식물 발현 벡터일 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 CYP705A13 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양상은 애기장대 유래의 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체에 관한 것이다. 본 발명은 CYP705A13 유전자의 과다발현 식물 형질전환체의 경우는 성장이 촉진됨을 확인할 수 있었다 (도 7 참고).

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물의 종자이며, 가장 바람직하게는 애기장대의 종자이다.

본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 가지는 CYP705A13 유전자를 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 형질전환한 후 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 식물을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 식물에서 상기 CYP705A13 유전자를 발현시켜서 식물 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 플라즈미드로 식물을 형질전환시는 단계는 구체적으로 다음의 네 과정으로 진행될 수 있다.

(1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열에서 CYP705A13 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라즈미드를 제조하는 단계;

(2) 숙주세포에 상기 재조합 플라즈미드를 도입하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 생성하는 단계; 및

(3) 상기 재조합 플라즈미드가 도입된 생장이 촉진되는 형질전환 식물을 선별하는 단계.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

본 발명의 기술된 방법을 사용하여 식물 성장 관련 유전자에 작동적으로 연결시켜 발현시키기에 적합한 프로모터는 형질전환될 식물의 동일한 종으로부터 또는 이종으로부터의 것을 사용할 수 있다. 또한, 프로모터는 사용될 본 발명의 유전자에 대해 동일한 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 이종으로부터 기원할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로모터는 또한 하나 이상의 하기에서 기술한 것과 공통되는 발현 프로파일을 갖는 프로모터의 조합을 포함할 수 있는 키메라 프로모터를 포함할 수 있다. 통상적으로, 벡터가 플라스미드인 경우, 당해 벡터는 또한 선별성 마커 유전자, 예를 들면, 카나마이신에 대한 내성을 암호화하는 카나마이신 유전자를 포함한다. 식물 형질전환의 가장 일반적인 방법은 표적 형질전환　유전자를 식물 형질전환 벡터 내로 클로닝시킨 후 헬퍼 Ti-플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투미파시엔스(Agrobacterium　tumifaciens)내로 형질전환시킨다. 이러한 방법은 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 식물 세포, 체외 배양편, 분열조직 또는 종자를 감염시키는 것이다. 당업자에게 공지된 적절한 조건 하에서, 형질전환된 식물 세포를 성장시켜 어린싹, 뿌리를 형성할 수 있으며, 식물로 더 발육시킬 수 있다.

이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

1. Bak1 억제자의 선별

bak1 돌연변이체의 추정 억제자를 발굴하기 위하여 활성화 태깅 방법을 이용해 4개의 35S 인헨서가 존재하는 pSKI015 플라스미드를 아그로박테리움투메파시엔스 (Agrobacterium tumerfaciens) (GV3101)에 형질전환시킨 후, 다시 이를 4-5주된 bak1 -3 식물에 floral dipping 방법으로 형질전환시켜서 bak1 -3 스크리닝 집단을 제작하였다. 형질전환식물체는 Finale (AgrEvo, Montvale, NJ)를 이용하여 선별되었고 (Weigel et al. 2000), bak1에 비하여 억제된 표현형을 보이는 모든 추정 억제자를 선발하였다.

2. TAIL- PCR 방법

선별된 추정 bak1 억제자 중에서 bak1 - SUP2를 분석하였다. 먼저, psKI015로부터 유래된 T-DNA의 삽입위치를 찾고자, TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced-PCR)를 수행하였다 (Liu et al. 1995). DNeasy Plant mini Kit (Qiagen)를 사용하여 대조구인 야생형(WS)과 실험구인 bak1 - SUP2, bak1으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 그 후 pSKI015 플라스미드의 좌측 보드 서열로부터 하기 표 1에 나타낸 바와 같은, AtLB1, AtLB2, AtLB3 프라이머와 두 개의 arbitrary degenerate 프라이머인 DEG1와 DEG2를 디자인하였다. 이 프라이머들을 이용하여 하기 표 2에 제시된 PCR 조건에 따라서 TAIL-PCR을 수행하였다.

1차 TAIL-PCR 반응을 위하여 200 uM dNTPs, 20 ng의 게놈 DNA, 0.5 ul 10 pmole 씩의 프라이머 세트, 10 units의 Han-Taq 폴리메라제(Genemed)를 포함하는 반응 혼합물(전체 용적 20 ㎕)을 준비하였다. 1차 PCR의 산물을 50배 희석하여 AtLB2 프라이머를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 3차 PCR 반응은 2차 PCR 산물을 20배 희석하여 템플릿으로 사용하였고 AtLB3 프라이머를 이용하여 같은 방법으로 수행하였다. 증폭된 산물들은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석되었다.

3. 성장측정방법

식물 성장을 측정하기 위하여 각 식물의 종자를 Sunshine #5 토양에 직접 파종한 후 48 시간 동안 암 상태에서 춘화처리하였다. 그 후 22℃, long-day condition (16 hours Light/8 hours Dark)인 식물배양실로 옮겨 4-6주 키워 성장을 측정하였다.

실험결과

1. CYP705A13 의 과발현에 의한 bak1 의 성장촉진

활성화 태깅(activation tagging) 방법을 이용하기 위해 pSKI015를 도입시킨 bak1 스크리닝 집단에서 제초제인 BASTA 저항성을 이용하여 발굴된 형질전환체중에서 bak1에 대하여 억제된 표현형을 보이는 모든 추정 억제자들을 일차 선발하고, T1 세대에서 bak1 돌연변이 부위에 대한 유전자분석(genotyping)을 수행하여 계속적으로 연구할 가치가 있는 2종류의 추정 억제자를 선별하였다. 그 중에서 특히 T2 세대의 식물에서 bak1 - SUP2는 bak1 백그라운드(background)에 비해서 총 줄기 성장이 60%, 잎꼭지의 길이 성장이 40% 이상 증가된 형태로 나타났다 (도 1). 통계적 분석은 Student's t 검정 (Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의 하다고 판정하였다.

이 후 TAIL-PCR을 통하여 CYP705A 서브패밀리에 속하는 유전자 부위의 번역 개시 부위(translational start site)로부터 -178 bp 위치에 활성화 태깅 벡터(activation tagging vector)의 인헨서(enhancer)가 삽입된 것을 확인하였다 (도 2). 그 후 qRT PCR을 수행하여 이 유전자의 발현이 bak1 -SUP2에서 대조구들에서 보다 증가되어 있음을 확인하였다(도 3).

2. CYP705A13 의 과발현에 의한 야생형의 성장촉진

먼저 야생형인 WS와 bak1 - SUP2의 백크로스(backcross)를 통해 cyp705a13 -D 식물체를 분리해내었다. 그 결과 bak1 돌연변이 없이 WS에서 CYP705A13이 과발현되었을 때 표현형과 기능을 확인할 수 있었다. cyp705a13-D 식물체는 bak1과 비교하였을 때 식물의 성장이 촉진되는 것을 확인 할 수 있습니다. 야생형과 비교하였을 때는 잎의 길이, 잎꼭지 길이, 키에서 특이적으로 성장이 촉진되었다(도 4 및 도 5 참조). 통계적 분석은 Student's t 검정 (Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의 하다고 판정하였다.

3. CYP705A13 의 과발현에 의한 BR 생합성 돌연변이체의 성장촉진

CYP705A13 유전자의 식물 성장에 미치는 영향을 알아보고자 대표적인 BR 생합성 돌연변이체인 det2 와 교차를 통한 이중 돌연변이체를 선별하였다. 그 결과 cyp705a13 -D/ det2 이중 돌연변이체는 det2와 비교하였을 때 그 성장이 식물 전반에 걸쳐 촉진된다는 것을 알 수 있었다. CYP705A13 유전자의 과발현은 왜생(dwarfism)을 보이는 식물의 성장도 촉진할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 6). 통계적 분석은 Student's t 검정 (Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의 하다고 판정하였다.

4. CYP705A13 유전자의 과발현은 세포의 길이를 성장시킴으로 식물 성장을 촉진한다.

그러면 이러한 식물 전반에 걸친 길이 성장을 세포 수준에서 생각할 때, 세포의 길이가 증가한 것인지 세포의 개수가 증가시킴으로 식물의 성장을 촉진한 것인지 확인하고자 하였다. 식물의 배축에 존재하는 세포의 길이를 측정하기로 하고 배축 접합부(hypocotyl junction)로부터 6,7번째 배축 세포(hypocotyl cell)의 길이를 측정해보았다. CYP705A13 유전자가 과발현된 식물체에서 세포의 길이가 모두 길어져 있는 것을 확인하였다 (도 7). 통계적 분석은 Student's t 검정 (Student's t-test) 으로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의 하다고 판정하였다. 이로 세포의 길이를 증가시킴으로 식물의 성장 촉진을 일으킨다는 것을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해 본 발명의 브라시노스테로이드(BR) 생합성 관련된 A-타입 CYP705 유전자 패밀리 중의 하나의 유전자인 CYP705A13 유전자가 식물의 성장을 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 유전자는 작물의 성장 및 작물의 수확량을 증대시키는데 이용될 수 있다는 사실을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 구체적인 실시 예들을 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양하게 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 보호범위는 특허청구범위 및 그와 균등한 범위로 정해져야 할 것이다.

<110> SOOKMYUNG WOMEN’S UNIVERSITY <120> GENE FOR PROMOTING PLANT GROWTH AND A TRANSGENIC PLANT COMPRISING THE SAME <130> P15-SMWU-01 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1734 <212> DNA <213> ARABIDODPSIS THALIANA <400> 1 atggcaacaa tcgtcgttga ctttcaaaaa attcattttc atcctcagat cctcttatcc 60 atattcacag tcatttgcat ctttgtattc ttcttcaaga agccaaaggg ctcacgaggc 120 tgtgatctgc ctccgagccc tccttctctt ccgataatcg gacatcttca ccttttactc 180 tttgatctac ctcacaaagc ctttcagaaa ctctcctcta agtatggacc tcttctctgt 240 ctccgcatct tcaatgtccc catagtcctg gtctcctctg cctctgtggc ctacgagatc 300 ttcaagacgc atgacgtgaa catctcatcc cacggccacc ctccgattga cgagtgtctc 360 ttttttgggt cttcaagctt tgtaatggct ccttatggag attactggaa gttcatgaag 420 aagctcatgg tcacaaagct gttcggacct caggcactcg agcagtcacg aggcgcccgt 480 gcagatgaac tagaacggtt tcacgcaaac ctgcttagta aggaaatgaa aagcgagact 540 gtcgagattg ctaaggaagc aataaagctg actaacaata gcatctgcaa gatgattatg 600 ggtaggggtt gtttagagga gaacggtgag gcagagagag ttaggggatt ggtcaccgag 660 acatttgcct tgtttaagaa acttttcttg acacaagtgt tacgcaggct gtttgagata 720 ctcagaatct caccgttcaa aaaagagaca ctggatgttt cccgcaaatt cgacgagctt 780 cttgaaagga ttattgtgga acacgaagag aaaacggact atgatcatgg tatggacctg 840 atggatgtgc tgttggctgt ttatcgagat ggaaaggcag agtataagat cactagggac 900 cacctcaagt ccttgttcgt ggagcttatc cttggaggca ctgacacctc agcgcaaaca 960 atcgagtgga caatggcaaa gatcattaag aagcctaaca ttcttgagag attgagaaaa 1020 gaaatcgatt ctgttgtagg caaaacaagg ttgattcaag agaaggatct accgaacctc 1080 ccttatttgc aagcggtcat caaggaaggg ctaagattac acccaccagc acctctcttg 1140 ggaaggaaag tcacagatgg atgtacgatt ggaggctgtt acgtaccaaa gaacacaaca 1200 cttgttgtta atgcttatgc cgtgatgaga gatcccgatt cttgggaaga tcctgatgag 1260 tttaagccag agaggtttct agcttcttca agaggaaaag aagaggagag agagcaagaa 1320 cttaagtaca ttccttttgg cagcggaaga agaggatgtc ctggagtaaa tctaggttat 1380 atatttgtag gaaccgcaat aggaatgatg gtgcattgct ttgactggag aaccaatgga 1440 gataaggtca acatggaaga gactgttgct ggaattacct taaacatggc tcatcctctt 1500 aggtgtactc ctgtttctcg aatgcaactg cagaaatcgc agttcgtgag ttcatgaatt 1560 ttgattagta aacaaagaag ctttgcattt tatgtttcca tgtctaagtt ttttccggtc 1620 tagttggtta cttttggttt attgtgaaaa cctataaaca gttgtgtatt gttcttctgt 1680 tgagttgtgg atcggtttca tatttaatga ctttcaattt tattttattt tttt 1734 <210> 2 <211> 518 <212> PRT <213> ARABIDOPSIS THALIANA <400> 2 Met Ala Thr Ile Val Val Asp Phe Gln Lys Ile His Phe His Pro Gln 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ser Ile Phe Thr Val Ile Cys Ile Phe Val Phe Phe Phe 20 25 30 Lys Lys Pro Lys Gly Ser Arg Gly Cys Asp Leu Pro Pro Ser Pro Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Leu Phe Asp Leu Pro 50 55 60 His Lys Ala Phe Gln Lys Leu Ser Ser Lys Tyr Gly Pro Leu Leu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Phe Asn Val Pro Ile Val Leu Val Ser Ser Ala Ser Val 85 90 95 Ala Tyr Glu Ile Phe Lys Thr His Asp Val Asn Ile Ser Ser His Gly 100 105 110 His Pro Pro Ile Asp Glu Cys Leu Phe Phe Gly Ser Ser Ser Phe Val 115 120 125 Met Ala Pro Tyr Gly Asp Tyr Trp Lys Phe Met Lys Lys Leu Met Val 130 135 140 Thr Lys Leu Phe Gly Pro Gln Ala Leu Glu Gln Ser Arg Gly Ala Arg 145 150 155 160 Ala Asp Glu Leu Glu Arg Phe His Ala Asn Leu Leu Ser Lys Glu Met 165 170 175 Lys Ser Glu Thr Val Glu Ile Ala Lys Glu Ala Ile Lys Leu Thr Asn 180 185 190 Asn Ser Ile Cys Lys Met Ile Met Gly Arg Gly Cys Leu Glu Glu Asn 195 200 205 Gly Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Leu Val Thr Glu Thr Phe Ala Leu 210 215 220 Phe Lys Lys Leu Phe Leu Thr Gln Val Leu Arg Arg Leu Phe Glu Ile 225 230 235 240 Leu Arg Ile Ser Pro Phe Lys Lys Glu Thr Leu Asp Val Ser Arg Lys 245 250 255 Phe Asp Glu Leu Leu Glu Arg Ile Ile Val Glu His Glu Glu Lys Thr 260 265 270 Asp Tyr Asp His Gly Met Asp Leu Met Asp Val Leu Leu Ala Val Tyr 275 280 285 Arg Asp Gly Lys Ala Glu Tyr Lys Ile Thr Arg Asp His Leu Lys Ser 290 295 300 Leu Phe Val Glu Leu Ile Leu Gly Gly Thr Asp Thr Ser Ala Gln Thr 305 310 315 320 Ile Glu Trp Thr Met Ala Lys Ile Ile Lys Lys Pro Asn Ile Leu Glu 325 330 335 Arg Leu Arg Lys Glu Ile Asp Ser Val Val Gly Lys Thr Arg Leu Ile 340 345 350 Gln Glu Lys Asp Leu Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ile Lys 355 360 365 Glu Gly Leu Arg Leu His Pro Pro Ala Pro Leu Leu Gly Arg Lys Val 370 375 380 Thr Asp Gly Cys Thr Ile Gly Gly Cys Tyr Val Pro Lys Asn Thr Thr 385 390 395 400 Leu Val Val Asn Ala Tyr Ala Val Met Arg Asp Pro Asp Ser Trp Glu 405 410 415 Asp Pro Asp Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Ala Ser Ser Arg Gly 420 425 430 Lys Glu Glu Glu Arg Glu Gln Glu Leu Lys Tyr Ile Pro Phe Gly Ser 435 440 445 Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Val Asn Leu Gly Tyr Ile Phe Val Gly 450 455 460 Thr Ala Ile Gly Met Met Val His Cys Phe Asp Trp Arg Thr Asn Gly 465 470 475 480 Asp Lys Val Asn Met Glu Glu Thr Val Ala Gly Ile Thr Leu Asn Met 485 490 495 Ala His Pro Leu Arg Cys Thr Pro Val Ser Arg Met Gln Leu Gln Lys 500 505 510 Ser Gln Phe Val Ser Ser 515

Claims (6)

1. 삭제
2. 서열번호 2의 단백질을 암호화하고, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 애기장대 유래의 CYP705A13 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물의 성장이 촉진되는 식물체.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 식물은 전체 식물, 식물 기관, 종자, 식물 세포 또는 이의 자손인 것을 특징으로 하는 식물의 성장이 촉진되는 식물체.
   
5. 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어지는 CYP705A13 유전자를 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환한 후 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 식물을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 식물에서 상기 CYP705A13 유전자를 발현시켜서 식물 성장을 촉진시키는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물 성장을 촉진시키는 방법.
   
   

Images