CN114480428A

CN114480428A - 水稻抗虫关键基因OsMYC2及其应用

Info

Publication number: CN114480428A
Application number: CN202210185083.0A
Authority: CN
Inventors: 刘景澜; 李济同; 梁昕彦; 廖光荣; 冯玲; 陈林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2022-05-13

Abstract

本发明涉及一种水稻抗虫关键基因OsMYC2及其应用，水稻抗虫关键基因OsMYC2，核酸序列如Seq.No 1所示。水稻抗虫关键基因OsMYC2表达蛋白，氨基酸序列如Seq.No 2所示。含有osmyc2缺失突变体，采用CRISPR‑Cas9技术构建水稻osmyc2缺失突变体。水稻抗虫关键基因OsMYC2在调控水稻抗虫性中的应用。通过本发明，克隆了OsMYC2基因，同时采用了CRISPR‑Cas9技术构建了水稻osmyc2敲除突变体，并进行抗虫性鉴定及褐飞虱为害后激素表达情况测定。本发明得到了显著结果，通过构建水稻osmyc2突变体，验证了OsMYC2基因表达量下降后水稻抗虫性显著降低，茉莉酸含量显著升高，说明OsMYC2是水稻抗褐飞虱的关键基因，通过对OsMYC2基因进行克隆和功能研究为水稻对褐飞虱抗性提供一定的理论依据。

Description

水稻抗虫关键基因OsMYC2及其应用

技术领域

本发明涉及一种水稻抗虫关键基因OsMYC2及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

转录因子(transcription factor，TF)也称为反式作用因子，它是一类能够与基因启动子区域中的顺式元件特异性结合，激活或者抑制目的基因的蛋白质分子。转录因子一般包括四种功能区域：DNA结合域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。其中DNA结合域决定了转录因子与顺式元件的特异性结合，转录调控域则进一步激活或者抑制相关基因的表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号做出调节反应。

髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis proteins，MYC)类转录因子，是植物激素茉莉酸(Jasmonic acid,JA)响应途径中的激活转录因子，广泛存在于动植物中。MYC2转录因子属于bHLH类转录因子家族，是当前MYC类转录因子中研究最透彻的一个。目前关于MYC2的功能报道主要集中于参与防御的功能这一块。

此外，MYC2也作为双子叶模式植物中JA信号转导的重要调节因子而受到关注，之前有关MYC2的研究也大部分以此为基础研究对象。近年来，研究者把目光逐渐转移到一些与我们息息相关的农作物当中，MYC2在单子叶植物尤其是重要粮食作物水稻中的研究被不断提及。与双子叶植物如拟南芥或烟草中的MYC2不同，水稻OsMYC2的大部分功能尚不清楚。

随着人们对生物研究的不断深入，探究基因功能的基因编辑技术越来越应用广泛。其原理是利用外源DNA对目标染色体特异位点的定点识别与改造，从而实现对目标基因的编辑。从早期的一开始利用锌指核酸酶(zinc fnger nuclease,ZFN)、到使用转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)以及第三代的CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated system)，基因编辑技术不断朝着高效、稳定和便捷发展。相比传统的基因编辑手段，CRISPR/Cas9系统因其便捷性、高效性以及稳定性的特点，已逐渐成为当前生物技术研究的重要手段。其应用范围遍布医学、农学和生物工程学等领域。

水稻是我国重要的粮食作物，水稻害虫的威胁是制约其产量提升的重要因素。褐飞虱是通过口器取食水稻韧皮部汁液的单食性害虫，因其具有较强的繁殖能力和环境适应能力，一旦危害爆发即具有发生面积扩大、爆发频率提高和危害程度增加的特征。近年来，随着各类农药的大量使用，其带来的环境与抗药性问题日益突出。关注水稻本身对外来入侵者的抗性机制，开发与选育抗性品种可能成为响应国家“绿色防控，综合治理”这一方针的重要举措。

本发明通过进一步筛选出水稻转录因子OsMYC2，对其结构功能进行分析，利用CRISPR/Cas9技术构建OsMYC2基因定向突变的重组载体，利用该载体遗传转化中花11(ZH11)水稻，对转化株进行筛选及突变鉴定，获得了水稻基因的突变株；检测突变体对褐飞虱的抗性及激素水平含量变化，为水稻抗褐飞虱机理提供新的探索。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是克隆一种水稻抗虫关键基因OsMYC2及其对水稻抗虫性中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现：水稻抗虫关键基因OsMYC2，核酸序列如Seq.No1所示。

水稻抗虫关键基因OsMYC2表达蛋白，氨基酸序列如Seq.No 2所示。

以水稻为材料，克隆OsMYC2基因。所述水稻材料为水稻ZH11材料。

一种表达载体，含有osmyc2缺失突变体，采用CRISPR-Cas9技术构建水稻osmyc2缺失突变体。

所述载体质粒采用水稻U6启动子。

所述载体质粒采用了加强型玉米UBI启动子，高效表达Cas9蛋白。

所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装与其间的OsMYC2基因表达框架整合至水稻中。

所述载体质粒拥有CaMV35S启动子表达潮霉素抗性基因。

所述水稻抗虫关键基因OsMYC2在调控水稻抗虫性中的应用。

检测在缺失突变体中osmyc2的表达量，以及观察表型，进行抗虫性鉴定及褐飞虱为害后激素表达情况测定，验证了OsMYC2基因表达量下降后水稻抗虫性显著降低，茉莉酸含量显著升高，说明OsMYC2是水稻抗褐飞虱的关键基因。

本发明方法先进科学，通过本发明，水稻抗虫关键基因OsMYC2，核酸序列如Seq.No1所示。水稻抗虫关键基因OsMYC2表达蛋白，氨基酸序列如Seq.No 2所示。根据百格CRISPR-Cas载体构建试剂盒使用说明书构建含有osmyc2缺失突变体的表达载体，其特征是含有osmyc2缺失突变体，所述载体质粒，采用水稻U6启动子，能够高效的用于单子叶植物，特别是水稻。所述载体质粒，采用了加强型玉米UBI启动子，高效表达Cas9蛋白。所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装与其间的OsMYC2基因表达框架整合至水稻中。所述载体质粒，拥有CaMV35S启动子表达潮霉素抗性基因。检测在缺失突变体中MYC2的表达量，以及观察表型。osmyc2水稻突变体抗虫性鉴定，植株功能损失指数、平均受害级别、取食倾向以及EPG分析。褐飞虱为害后水稻激素表达量。本发明最后提供了所述水稻抗虫性关键基因OsMYC2在调控水稻抗虫性中的应用。

本发明以水稻ZH11为材料，克隆了OsMYC2基因，同时采用了CRISPR-Cas9技术构建了水稻osmyc2敲除突变体，并进行抗虫性鉴定及褐飞虱为害后激素表达情况测定。

本发明得到了显著结果，通过构建水稻osmyc2突变体，验证了OsMYC2基因表达量下降后水稻抗虫性显著降低，茉莉酸含量显著升高，说明OsMYC2是水稻抗褐飞虱的关键基因，通过对OsMYC2基因进行克隆和功能研究为水稻对褐飞虱抗性提供一定的理论依据。

附图说明

图1为通过CRISPR/Cas9构建OsMYC2突变体；其中，A为gRNA CRISPR/Cas9靶点位置，B为OsMYC2的外显子区域以及在外显子上的目标位置，C为osmyc2通过CRISPR/Cas9突变序列。

图2为OsMYC2基因表达及表型对比；其中，A为野生型水稻ZH11和osmyc2突变体基因表达差异，B为苗期osmyc2突变体和ZH11表型差异对比，C为分蘖期osmyc2突变体和ZH11表型差异对比。

图3为osmyc2突变体和ZH11抗虫性鉴定；其中，A为osmyc2突变体和ZH11平均受害级别，B为osmyc2突变体和ZH11功能损失指数，C为osmyc2突变体和ZH11的若虫数量，D为osmyc2突变体和ZH11的EPG功能研究。

图4为osmyc2突变体和ZH11在接虫前后不同激素含量。

具体实施方式

下面通过具体实施对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1克隆水稻OsMYC2基因

(1)基于国家水稻数据中心，使用Snap Gene设计引物，其中OsMYC2正向引物为：5‘-ATGTGGGTTTTGTTATCTCC-3’，反向引物为：5‘-TTACCGGGCGGCGGTGCCAG-3’；高保真PCR反应体系如下：2×Primer star Buffer 25μl；正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μl，模板(水稻ZH11cDNA)，ddH₂O补足至50μl。反应程序：(98℃10s-55℃15s-72℃1分30s)×32个循环-4℃保存。

(2)CRISPR-Cas9靶点设计并进行转化；

根据百格基因科技(江苏)有限公司提供的Sg Sequence设计靶点引物，引物序列为：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’制备Oligo二聚体，然后构建CRISPR-Cas载体，连接反应体系，Vector 2μl，Enzyme Mix 1μl，Oligo二聚体1μl，H₂O 6μl，反应条件为25℃反应1h。转化感受态，转化感受态

取5μl上述反应液，加入20μl感受态细胞(DH5α)，混合后冰浴静置30min(不可晃动)；轻轻取出，42℃热激35s，立即置于冰上2min；加入100μl LB，37℃振荡培养1h；取60μl菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。挑选单克隆摇菌，抽提质粒并送测序。测序引物为PUV4-R：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA。

实施例2 OsMYC2基因的遗传转化

通过农杆菌侵染将构建好的CRISPR-Cas9载体转入水稻，实验步骤诱导10d，继代5d，农杆菌划线2d，共培养3d，筛选30d，分化30d，生根7d，总计87d。

(1)愈伤诱导与继代挑选成熟水稻种子(最好是当年新收种)，剥离颖壳，倒入50ml离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠消毒20min，倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍。移液枪吸去多余的水份(可用灭菌过的滤纸吸干)，将种子转移到诱导培养基上，每皿20-25颗种子。

(2)愈伤长出后可用原胚直接做转化，原胚旁边长出的小颗粒可挑取到新的诱导培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时同样可以进行转化。

(3)农杆菌培养，将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有相应抗生素的平板上划线，28℃黑暗培养2d至出现单菌落。

(4)农杆菌侵染，准备侵染液，用移液器吸取侵染液将平板上的农杆菌冲洗下来即共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。挑选足够数量的愈伤组织(愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右为宜，)放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置侵染20min,并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3d。

(5)筛选培养，共培养3d后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1ml的蓝枪头将共培养基上的愈伤播到已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两边，第三遍用含有500μl/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件28-30℃，暗培养。筛选时长3-4周。

(6)分化再生，筛选一个月后，可见颜色鲜黄的阳性愈伤长出，此时可将阳性愈伤挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤，置于28-30℃温室中光照培养。一般10d左右可将愈伤冒出绿点，在经过10d左右会有幼苗分化出。

(7)幼苗生根，待分化出的幼苗长到2-3cm左右，有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养基要倒在比较高的瓶子或管子里，生根后的苗子才有足够的空间长高，生根培养条件28-30℃，无菌光照培养。

实施例3水稻抗虫性鉴定

(1)水稻平均受害级别测定

选取ZH11和osmyc2品系水稻种子分别浸种催芽于塑料盘中，水稻生长至壮苗状态移栽至塑料杯中，每杯一株，在气候培养箱中生长至分蘖初期，留下主茎，用透明塑料罩罩住水稻，每株往里面接入20头三龄褐飞虱，用纱网扎住透明塑料罩顶端，定期观察，每个品系重复7次。当其中某个水稻品系受害级别达到9级时，按照国际使用统一标准，对其他水稻目测定级。

(2)功能损失指数测定

选取ZH11和osmyc2品系水稻浸种催芽，适龄转移至大塑料杯中，每杯一株，正常肥水管理至分蘖初期。用透明塑料罩分别罩住各株水稻，按20头/株接入三龄褐飞虱若虫，用纱网罩住上口，以补接虫为对照，重复7次。定期观察，当其中一个品系功能损失指数达到9级时，将被取食植株和对照植株都齐泥剪下，洗净后在110℃下杀青30min，再在70-80℃烘箱内烘至恒重。用Panda&Hieinrhcs改进的FPLI估计三种水稻品系对褐飞虱的耐虫性，计算方法如下:FPLI(功能植物损失指数)＝100-(受害植株干重/未受害植株干重)×(1-受害级别/9)×100。

(3)褐飞虱取食行为的EPG测定

在褐飞虱取食过程中，EPG的波形各有其生物学意义：

Np波代表褐飞虱口针未刺探；

N1波代表褐飞虱口针刺入水稻表皮；

N2波说明分泌唾液；

N3波则表示褐飞虱在临近韧皮部的细胞外移动；

N4表明褐飞虱正在吸食韧皮部汁液；

N5表明木质部水分被褐飞虱吸食。

在塑料盘中培育ZH11、osmyc2品系水稻至4叶期大小，移栽至塑料杯中，每杯一株，恢复生长15d后选取长势大小一样的水稻苗备用。实验前，对三龄褐飞虱若虫进行饥饿处理1h，用金线顶端蘸取可溶导电胶成小球，粘住褐飞虱中胸背板，分别把连接金线的导电铜针插入昆虫刺吸信号电子记录仪。将连接好的褐飞虱轻轻放置在供试水稻茎秆上取食，开始信息采集后，调整电压使波形处于采集区中央。采集时间为8h，实验过程中用屏蔽罩隔绝干扰，每株水稻接1头褐飞虱作为一个重复，每种品系设置9个重复。

(4)褐飞虱取食倾向测定

选ZH11、osmyc2品系水稻种子在培养箱中培养至四叶期，将3种水稻移栽到塑料杯中，株距为1cm，分别贴上标签，外面用透明塑料罩。两周后，在3株水稻苗中间位置接入30头3龄褐飞虱若虫，顶部用纱网罩住。接虫后，分别在1、2、4、8、12、24和48h观察3种水稻上的着虫数，本实验重复8次。

实施实例4水稻激素含量测定

(1)溶液配置

使用电子天平精密称取ABA、JA、IAA、ZT、ACC和SA标准品，用适量甲醇溶解得到浓度为1mg/mL的溶液，并梯度稀释为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL的溶液。利用100μg/mL的溶液配置混合标准溶液，进一步梯度稀释，配置浓度分别为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的溶液。利用0.1μg/mL的溶液进行质谱条件的优化。

(2)超高液相色谱-质谱方法

本实验采用UPLC-ESI-MS/MS分析方法，对6种目标植物激素进行定量检测。采用API5500三重四极杆串联质谱检测系统(AB Sciex,美国)，配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst1.6.2工作站。采用电喷雾离子源(ESI)，分析物在负离子扫描下以多反应检测(MRM)模式进行分析，可以大大提高灵敏度。同时优化质谱参数，在最优条件下可以实现目标化合物离子对的快速筛选和确定，优化的质谱分析条件如下：气帘气30；碰撞气8；离子喷雾电压-3000V；温度500℃；离子源Gas1:35；Gas2:45。色谱系统采用的是超高效液相色谱仪(Waters,美国)，根据植物激素的性质，采用Agilent Poroshell 120，EC-C18(100×3mm，2.7μm)液相色谱柱，进样量为3μL。流动相A(0.1％甲酸-水溶液)，流动相B(0.1％甲酸-乙腈)，梯度洗脱方法如下表所示：

梯度洗脱程序

Gradient Elution Procedures

(3)样品处理

选取ZH11、osmyc2水稻种子，在气候培养箱中浸种催芽15d后，移栽至塑料桶中，每桶三穴，每穴一株水稻。待桶中的水稻生长至分蘖期，用剪刀剪去多余的分蘖茎叶，留下主茎叶。使用透明塑料罩罩住待接虫的水稻，往每株水稻内接入30头3龄褐飞虱若虫，12h后用剪刀剪去各个处理水稻叶片，液氮速冻后转入超低温冰箱保存。

取超低温冰箱保存样品约50mg，加入500μL试剂1(异丙醇：水：甲酸＝2:1:0.002)，加入2颗钢珠(1大1小)，研磨机研磨2min(提前预冷)，-20℃放置20min，冰浴中超声30min，加入1mL氯仿，-20℃放置20min，冰浴中超声5min，涡旋振荡1min，13000rpm离心5min，取下层900μL(分两次取，一次450μL,于1.5mL棕色LC-MS进样瓶中)，挥干，加入200μL甲醇：水(4:1)复溶(冰浴超声1min)，样品在上机之前存放于-20℃(整个过程保证低温)。

(4)数据分析

在Analyst软件(AB Sciex，美国)中采用默认参数对各MRM transition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。以分析物的质谱峰面积为纵坐标，以分析物的浓度为横坐标绘制线性回归标准曲线。样本浓度计算：将样品分析物的质谱峰面积，代入线性方程中，计算浓度；样品植物激素含量＝浓度×上样体积/样品质量。采用SPSS11.0统计软件分析所有数据。单因素或多因素方差分析，多重比较采用PLSD法，描述性统计值用平均值+标准误表示，显著性水平设置为α＝0.05。

从结果可以明显得出，osmyc2使得水稻抗虫性降低，更易受褐飞虱侵害，说明OsMYC2是调控水稻抗褐飞虱的关键基因。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 水稻抗虫关键基因OsMYC2及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2256

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 1

atgtgggttt tgttatctcc tctcctcacc accaaaaatc cattccaccc catacccatc 60

cccacctttc ctctcctcct attctcttct tctcttgtag gagtcctctt ccaaatcaaa 120

tcaaatctag aagaagaaga aatcgagatc aaatcgatga acctttggac ggacgacaac 180

gcgtcgatga tggaggcgtt catggcctcc gccgacctcc cggccttccc gtggggggcg 240

gcctccaccc cgccgccgcc gccgccgccg cctcaccacc accaccaaca gcagcagcag 300

caggtcctgc cgccgcctgc agcagctccg gcggcggcgg cgttcaacca ggacacgctg 360

cagcagcggc tgcagtcgat catcgagggg tctcgggaga cgtggacgta cgccatcttc 420

tggcagtcct ccatcgacgt ctccaccggc gcctccctcc tcggctgggg cgacggctac 480

tacaagggct gcgacgacga caagcgcaag cagcgctcct ccacccccgc cgccgccgcc 540

gagcaggagc accgcaagcg cgtcctccgc gagctcaact ccctcatcgc cggcgcaggc 600

gccgcccccg acgaggccgt cgaggaggag gtcaccgaca ccgagtggtt cttcctcgtc 660

tccatgaccc agtccttccc caacggcctc ggcctccccg gccaggccct cttcgccgcc 720

cagcccacct ggatcgccac cggcttgtcc tccgccccct gtgaccgcgc caggcaggcc 780

tacaccttcg gcctccgcac catggtctgc ctccccctcg ccaccggcgt cctcgagctc 840

ggctccaccg acgtcatctt ccagaccggg gacagcatcc ccaggatccg cgccctcttc 900

aacctcagcg ccgccgccgc ctcctcctgg cccccccacc ccgacgccgc ctccgccgat 960

ccctccgtgc tctggctcgc cgacgcgccc cccatggaca tgaaggactc catctccgcc 1020

gcagacatct ccgtctccaa gccaccaccc ccgccgccgc accagatcca gcacttcgag 1080

aacgggagca ccagcacgct cacggagaat cccagcccgt cggtgcacgc gccgacgccc 1140

tcgcagccgg ccgcgccgcc ccagcggcag cagcagcagc agcagagcag ccaggctcag 1200

cagggcccct tccgccggga gctcaacttc tccgacttcg cgtccaacgg cggcgccgcg 1260

gccccgcctt tcttcaagcc cgagaccggc gagatcctaa acttcggcaa cgacagcagc 1320

agtggccgga ggaatccgtc gccggcgccc ccggccgcca ccgccagcct caccaccgcg 1380

ccggggagcc tgttctcgca gcacacgccg acgctgacgg cggcggcgaa cgacgccaag 1440

agcaacaacc agaagaggtc catggaggcc acctcccgcg ccagcaacac caacaaccac 1500

ccggcggcga cggcgaacga ggggatgctg tccttctcgt cggcgccgac gacgcggccg 1560

tcgacgggga cgggcgcccc ggccaagtcg gagtcggacc actcggacct ggaggcgtcg 1620

gtgcgggagg tggagagcag ccgcgtggtg gcgccgccgc cggaggcgga gaagcggccg 1680

cggaagcgcg ggcggaagcc ggcgaacggg cgggaggagc cgctgaacca cgtggaggcg 1740

gagcggcagc ggcgggagaa gctcaaccag cgcttctacg cgctgcgcgc cgtggtgccc 1800

aacgtgtcca agatggacaa ggcgtcgctg ctgggcgacg ccatctccta catcaacgag 1860

ctccggggga agctcacggc gctggagacg gacaaggaga cgctgcagtc gcagatggag 1920

tcgctcaaga aggagcggga cgcgcggccg ccggcgccgt cgggcggcgg cggagacggc 1980

ggggcgcggt gccacgcggt ggagatcgag gccaagatcc ttgggctgga ggccatgatc 2040

cgcgtgcagt gccacaagcg gaaccacccg gcggcgcggc tgatgacggc gctgcgggag 2100

ctggacctgg acgtgtacca tgccagcgtc tccgtggtca aggacctcat gatccagcag 2160

gtggccgtca agatggccag ccgcgtctac tcgcaggacc agctcaacgc cgcgctctac 2220

acccgcatcg ccgagcctgg caccgccgcc cggtaa 2256

<210> 2

<211> 751

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 2

Met Trp Val Leu Leu Ser Pro Leu Leu Thr Thr Lys Asn Pro Phe His

1 5 10 15

Pro Ile Pro Ile Pro Thr Phe Pro Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ser Leu

20 25 30

Val Gly Val Leu Phe Gln Ile Lys Ser Asn Leu Glu Glu Glu Glu Ile

35 40 45

Glu Ile Lys Ser Met Asn Leu Trp Thr Asp Asp Asn Ala Ser Met Met

50 55 60

Glu Ala Phe Met Ala Ser Ala Asp Leu Pro Ala Phe Pro Trp Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ser Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His His His His Gln

85 90 95

Gln Gln Gln Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala

100 105 110

Ala Ala Phe Asn Gln Asp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Glu Gly Ser Arg Glu Thr Trp Thr Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Ser Ser

130 135 140

Ile Asp Val Ser Thr Gly Ala Ser Leu Leu Gly Trp Gly Asp Gly Tyr

145 150 155 160

Tyr Lys Gly Cys Asp Asp Asp Lys Arg Lys Gln Arg Ser Ser Thr Pro

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Glu Gln Glu His Arg Lys Arg Val Leu Arg Glu Leu

180 185 190

Asn Ser Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ala Ala Pro Asp Glu Ala Val Glu

195 200 205

Glu Glu Val Thr Asp Thr Glu Trp Phe Phe Leu Val Ser Met Thr Gln

210 215 220

Ser Phe Pro Asn Gly Leu Gly Leu Pro Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ala

225 230 235 240

Gln Pro Thr Trp Ile Ala Thr Gly Leu Ser Ser Ala Pro Cys Asp Arg

245 250 255

Ala Arg Gln Ala Tyr Thr Phe Gly Leu Arg Thr Met Val Cys Leu Pro

260 265 270

Leu Ala Thr Gly Val Leu Glu Leu Gly Ser Thr Asp Val Ile Phe Gln

275 280 285

Thr Gly Asp Ser Ile Pro Arg Ile Arg Ala Leu Phe Asn Leu Ser Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Ser Ser Trp Pro Pro His Pro Asp Ala Ala Ser Ala Asp

305 310 315 320

Pro Ser Val Leu Trp Leu Ala Asp Ala Pro Pro Met Asp Met Lys Asp

325 330 335

Ser Ile Ser Ala Ala Asp Ile Ser Val Ser Lys Pro Pro Pro Pro Pro

340 345 350

Pro His Gln Ile Gln His Phe Glu Asn Gly Ser Thr Ser Thr Leu Thr

355 360 365

Glu Asn Pro Ser Pro Ser Val His Ala Pro Thr Pro Ser Gln Pro Ala

370 375 380

Ala Pro Pro Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Gln Ala Gln

385 390 395 400

Gln Gly Pro Phe Arg Arg Glu Leu Asn Phe Ser Asp Phe Ala Ser Asn

405 410 415

Gly Gly Ala Ala Ala Pro Pro Phe Phe Lys Pro Glu Thr Gly Glu Ile

420 425 430

Leu Asn Phe Gly Asn Asp Ser Ser Ser Gly Arg Arg Asn Pro Ser Pro

435 440 445

Ala Pro Pro Ala Ala Thr Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Gly Ser Leu

450 455 460

Phe Ser Gln His Thr Pro Thr Leu Thr Ala Ala Ala Asn Asp Ala Lys

465 470 475 480

Ser Asn Asn Gln Lys Arg Ser Met Glu Ala Thr Ser Arg Ala Ser Asn

485 490 495

Thr Asn Asn His Pro Ala Ala Thr Ala Asn Glu Gly Met Leu Ser Phe

500 505 510

Ser Ser Ala Pro Thr Thr Arg Pro Ser Thr Gly Thr Gly Ala Pro Ala

515 520 525

Lys Ser Glu Ser Asp His Ser Asp Leu Glu Ala Ser Val Arg Glu Val

530 535 540

Glu Ser Ser Arg Val Val Ala Pro Pro Pro Glu Ala Glu Lys Arg Pro

545 550 555 560

Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Asn Gly Arg Glu Glu Pro Leu Asn

565 570 575

His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu Lys Leu Asn Gln Arg Phe

580 585 590

Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val Pro Asn Val Ser Lys Met Asp Lys Ala

595 600 605

Ser Leu Leu Gly Asp Ala Ile Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Arg Gly Lys

610 615 620

Leu Thr Ala Leu Glu Thr Asp Lys Glu Thr Leu Gln Ser Gln Met Glu

625 630 635 640

Ser Leu Lys Lys Glu Arg Asp Ala Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Gly

645 650 655

Gly Gly Asp Gly Gly Ala Arg Cys His Ala Val Glu Ile Glu Ala Lys

660 665 670

Ile Leu Gly Leu Glu Ala Met Ile Arg Val Gln Cys His Lys Arg Asn

675 680 685

His Pro Ala Ala Arg Leu Met Thr Ala Leu Arg Glu Leu Asp Leu Asp

690 695 700

Val Tyr His Ala Ser Val Ser Val Val Lys Asp Leu Met Ile Gln Gln

705 710 715 720

Val Ala Val Lys Met Ala Ser Arg Val Tyr Ser Gln Asp Gln Leu Asn

725 730 735

Ala Ala Leu Tyr Thr Arg Ile Ala Glu Pro Gly Thr Ala Ala Arg

740 745 750

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtgggttt tgttatctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaccgggcg gcggtgccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcccagtcac gacgttgtaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcccagtcac gacgttgtaa 20

Claims

1. 水稻抗虫关键基因OsMYC2，核酸序列如Seq. No 1所示。

2. 根据权利要求1所述的水稻抗虫关键基因OsMYC2，其特征是，水稻抗虫关键基因OsMYC2表达蛋白，氨基酸序列如Seq. No 2所示。

3.根据权利要求1所述的水稻抗虫关键基因OsMYC2，其特征是，以水稻为材料，克隆OsMYC2基因。

4.根据权利要求3所述的水稻抗虫关键基因OsMYC2，其特征是，所述水稻材料为水稻ZH11材料。

5.一种表达载体，其特征是，含有osmyc2缺失突变体，采用CRISPR-Cas9技术构建水稻osmyc2缺失突变体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征是，所述载体质粒采用水稻U6启动子。

7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征是，所述载体质粒采用了加强型玉米UBI启动子，高效表达Cas9蛋白。

8.根据权利要求5所述的表达载体，其特征是，所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装与其间的OsMYC2基因表达框架整合至水稻中。

9.根据权利要求5所述的表达载体，其特征是，所述载体质粒拥有CaMV35S启动子表达潮霉素抗性基因。

10.权利要求1所述的水稻抗虫关键基因OsMYC2在调控水稻抗虫性中的应用。