CN117904174A

CN117904174A - 大豆sweet同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用

Info

Publication number: CN117904174A
Application number: CN202410100274.1A
Authority: CN
Inventors: 刘宝辉; 方超; 芦思佳; 孔凡江; 苏彤
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2024-01-24
Filing date: 2024-01-24
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明涉及植物育种领域，尤其涉及大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用。本发明提供了大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用；所述编辑位点位于：SWEET11基因和/或SWEET21基因的编码区的2bp～21bp和658bp～676bp。本发明利用CRISPR/Cas9技术对大豆GmSWEET11/21同时进行敲除，将为大豆SWEET基因的功能研究提供遗传材料，有望定向调控下胚轴长度，降低大豆株高，提高抗倒伏能力，提高产量。

Description

大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用

技术领域

本发明涉及植物育种领域，尤其涉及大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用。

背景技术

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是重要的粮油饲兼用型经济作物。随着国民消费水平的提高，对大豆的需求也在持续增长，目前我国大豆年均需求量已超1亿吨。在耕地面积有限的情况下，提高单产是打破大豆产业困局的有效途径。

密植是提高作物单产的重要措施，但也会导致作物株高增加，降低抗倒伏能力，限制了产量的提高。株高主要由节数、节间长度和下胚轴长度组成。其中下胚轴越长，倒伏可能性越大。但目前关于大豆下胚轴长度的研究极少，调控机制并不明确，有待进一步研究。

下胚轴长度受到多种因素的影响，蔗糖是其中一个重要的因素。已有报道指出，在光下，蔗糖会抑制拟南芥下胚轴的伸长。但是关于蔗糖对大豆下胚轴长度的调控机制尚不明确。报道指出，子叶中的蔗糖主要通过SUT(SU CROSE TRANSPORTER)和SWEET(SUGARSWILL EVENTUALLY BE EXPORTED TRANSPORTERS)向下胚轴中运输。其中，源器官中的蔗糖转运蛋白AtSWEET11/12的突变会造成叶片中蔗糖的严重积累，拟南芥植株生长缓慢。在作物中，如水稻、玉米和马铃薯等，其源器官重要的SWEET突变同样会造成植株生长缺陷，产量严重降低。可见SWEET对作物的生长发育十分重要。

大豆中已鉴定到52个SWEET基因，近年来，研究者已成功解析了库器官中重要的GmSWEET10参与调控大豆种子大小、油分和蛋白的机制。但关于源器官中SWEET的报道极少，作用机制并不明确。GmSWEET11/21作为大豆重要的源器官蔗糖转运蛋白，目前为止，未有报道通过CRISPR/Cas9技术对其进行编辑以改变大豆下胚轴长度和产量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术对大豆GmSWEET11/21同时进行敲除，将为大豆SWEET基因的功能研究提供遗传材料，有望定向调控下胚轴长度，降低大豆株高，提高抗倒伏能力，提高产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用；

所述编辑位点位于：SWEET11基因和/或SWEET21基因的编码区的2bp～21bp和658bp～676bp。

在本发明的一些实施方案中，上述编辑位点具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:1的序列为：5’-TGACCATGCATCGCGAGTCT-3’。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:2的序列为：5’-GGCACTAGAGGAGCCAGTGA-3’。

本发明提供了核酸分子，所述核酸分子具有：

(1)、如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

本发明还提供了表达盒，包括：上述核酸分子以及可接受的基因元件。

在本发明的一些实施方案中，上述表达盒中，所述基因元件包括：sgRNA载体。

在本发明的一些实施方案中，上述表达盒中，所述sgRNA载体为：pYLgRNA-AtU3d和pYLgRNA-AtU6-1。

本发明还提供了重组载体，包括：上述核酸分子和/或上述表达盒。

在本发明的一些实施方案中，上述重组载体还包括：pYLCRISPR/Cas9载体。

本发明还提供了上述重组载体的制备方法，取所述表达盒与所述pYLCRISPR/Cas9载体连接，获得所述重组载体。

本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。

在本发明的一些实施方案中，上述宿主中，转化和/或转染发根农杆菌感受态细胞K599。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在调控大豆的下胚轴长度中的应用。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在提高大豆产量中的应用。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在改良大豆品种中的应用。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在大豆育种中的应用。

本发明还提供了大豆的培养方法，包括如下步骤：

S1：取上述宿主接种培养后，获得菌液；

S2：取所述菌液与预处理的大豆种子共培养后，取外植体诱导培养，获得幼芽；

S3：取所述幼芽培养至结荚，选取植株的叶片进行抗性筛选，获得的阳性植株为目的植株。

在本发明的一些实施方案中，上述培养方法中，所述预处理包括：在氯气中干燥和消毒的步骤。

在本发明的一些实施方案中，上述培养方法中，所述抗性筛选采用除草剂Basta。

本发明的有益效果：

(1)、本发明提供了对GmSWEET11/21基因进行编辑的有效靶标，可对GmSWEET11/21进行基因编辑，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得GmSWEET11/21不同的等位基因突变体；

(2)、本发明为调节GmSWEET11/21以改变大豆下胚轴长度和产量提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆产量提供了可靠的手段和素材，在作物的研究和生产上具有重要的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示敲除载体构建过程中的电泳图；其中：a示sgRNA表达盒扩增的第一轮PCR产物电泳图；b示sgRNA表达盒扩增的第二轮PCR产物电泳图；

图2示GmSWEET11和GmSWEET21基因插入有编辑位点的T1和T2的Cas9sgRNA表达载体示意图；Cas9 sgRNA表达载体以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架，带有AtU3d和AtU6-1启动子，靶点T1-T2和sgRNA的一个表达载体；两个靶点T1和T2同时对GmSWEET11和GmSWEET21基因进行编辑；

图3示农杆菌K599的菌落PCR产物电泳图；

图4示转基因毛状根检测靶点的编辑峰图；其中：a示阳性毛状根中GmS WEET11基因的编辑峰图；b示阳性毛状根中GmSWEET21基因的编辑峰图；

图5示sweet11/21突变体中GmSWEET11和GmSWEET21基因的编辑方式；a示sweet11/21突变体中GmSWEET11和GmSWEET21编码区序列编辑方式；b示s weet11/21突变体中GmSWEET11和GmSWEET21蛋白序列变化示意图；

图6示野生型材料和sweet11/21种植于长短日照条件下的下胚轴长度变化；其中：a示短日照条件下的野生型材料和sweet11/21表型图片；b示短日照条件下野生型材料和sweet11/21的下胚轴长度；c示长日照条件下的野生型材料和sweet11/21表型图片；d示长日照条件下野生型材料和sweet11/21的下胚轴长度；

图7示野生型材料和sweet11/21于2022年种植在石家庄试验田的表型；其中：a示野生型材料和sweet11/21表型图片；b示百粒重；c示单株粒数；d示单株粒重；**代表方差分析，0.01水平差异极显著。

具体实施方式

本发明公开了大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明提供了一种大豆GmSWEET11/21的编辑位点。该基因编辑位点为两段20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列分别为：5’-TGACCATGCATC GCGAGTCT-3’(SEQ ID NO:1)和5’-GGCACTAGAGGAGCCAGTGA-3’(S EQ ID NO:2)。其在大豆基因组的准确定位分别为5号染色体GmSWEET11基因CDS的2-21、658-676处，染色体的坐标分别为38625204-38625223、38627126-38627144；8号染色体GmSWEET21基因CDS的2-21、658-676处，染色体的坐标分别为786054-786073、787934-787952。

本发明提供了一种大豆GmSWEET11/21基因编辑位点，为一段20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列(SEQ ID NO:1)(SEQ ID NO:2)；Wm82中GmSWEET11的cDNA序列(SEQ ID NO:25)，GmSWEET21的cDNA序列(SEQ ID NO:26)及GmSWEET11氨基酸序列(SEQ ID NO:27)，GmSWEET21(SEQ ID NO:28)；经CRISPR/Cas9编辑后创制的sweet11/21中GmSWEET11的cDNA序列(SEQ ID NO:29)，GmSWEET21的cDNA序列(SEQ ID NO:30)及GmSWEET11氨基酸序列(SEQID NO:31)，GmSWEET21氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。

SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:29相比，在编码区第20bp处插入T，在编码区第662bp处缺失12bp；

SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:30相比，在编码区第20bp处插入T，在编码区第667bp处缺失21bp；

SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:31相比，在第41个氨基酸处存在终止密码子，导致蛋白提前终止；

SEQ ID NO:28与SEQ ID NO:32相比，在第41个氨基酸处存在终止密码子，导致蛋白提前终止。

生物材料具体为：

本发明所述编辑位点得到的sweet11/21突变体株系；

编码SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32蛋白序列的核酸分子；

带有编码SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32蛋白序列的核酸分子的各种重组载体；

带有编码SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32蛋白序列的核酸分子的各种重组微生物；

带有编码SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32蛋白序列的核酸分子的植物细胞器、植物组织或植物器官。

本发明涉及的序列：

本发明实施例1～实施例4中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1插入有GmSWEET11/21编辑靶位点的Cas9 sgRNA表达载体的构建(1)主要试剂和来源

大肠杆菌E.coliDH5α、PCR产物回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自全式金公司；sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU6-1和pYLCRISPR/Cas9载体(均在“A robustCRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants”中公开)由华南农业大学刘耀光教授实验室提供。BsaⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自BioLabs公司；KOD酶购自TOYOBO公司；胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由广州擎科生物公司完成。

靶点引物：

T1F：5’-gtcaTGACCATGCATCGCGAGTCT-3’(SEQ ID NO:3)；

T1R：5’-aaacAGACTCGCGATGCATGGTCA-3’(SEQ ID NO:4)；

T2F：5’-attgGCACTAGAGGAGCCAGTGA-3’(SEQ ID NO:5)；

T2R：5’-aaacTCACTGGCTCCTCTAGTGC-3’(SEQ ID NO:6)。

第一轮PCR引物为：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO:7)；

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO:8)。

第二轮PCR引物为：

B1’F：5’-TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO:9)；

B2R：5’-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO:10)；

B2’F：5’-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO:11)；

BLR：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO:12)。

载体测序引物：

SP3F：5’-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3’(SEQ ID NO:13)；

SP1R：5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACC-3’(SEQ ID NO:14)。

(2)操作步骤

第一步：靶点引物退火成双链

分别取100μmol/L的正反引物各1μL加入到PCR管中，并加入98μL无菌水至100μL，PCR程序设置为90℃30s，室温冷却退火，得到双链DNA。

第二步：双链DNA与gRNA表达盒酶切连接

将退火后的靶点双链DNA分别与sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d、pYLg RNA-AtU6-1连接，得到T1靶点-AtU3d和T2靶点-AtU6-1连接片段。反应体系为：2μL 10ng/μL的sgRNA载体，0.5μL 100μmol/L双链DNA，0.5μL BsaⅠ(10U/μL)，0.2μL T4 DNA ligase，1μL 10×NEB T4DNA ligase buffer，1μL 10×NEB CutSmart Buffer，4.8μL无菌水。PCR程序设置为37℃5min，20℃5min，5个循环。

第三步：2轮PCR

第一轮，扩增gRNA表达盒，反应体系为：

PCR程序设置为：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃10s；25个循环。

取PCR产物3μL，无菌水6μL和1μL 10×loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，查看是否存在200bp左右的条带(图1a)。

第二轮，针对T1和T2靶点分别使用特定的通用引物B1’F/B2R和B2’F/BLR扩增获得带有特异性接头的包含启动子、靶点和sgRNA的完整表达盒靶。

反应体系为：

PCR程序设置为：95℃2min，35个循环：95℃10s，58℃15s，72℃20s。取PCR产物3μL，无菌水6μL和1μL 10×loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，查看是否存在500bp左右的条带(图1b)。根据PCR回收试剂盒上的步骤进行PCR回收，并检测回收DNA片段的浓度。

第四步：sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体连接，得到Cas9 sgRN A表达载体(图2)

反应体系为：

PCR程序设置为：37℃5min，10℃5min，20℃5min，37℃5min，15cycles。

第五步，连接产物的转化

将E.coliDH5α感受态细胞放于冰上至溶融状态，随后向其中加入15μL上一步得到的表达载体，轻弹混匀。于冰上冰浴30分钟后，放入42℃水浴锅中热激45s，立刻冰浴2分钟。在超净工作台中加入500μL不含抗生素的LB培养液，37℃220rpm震荡培育1小时，4000rpm离心1min，倒掉部分上清液，重悬菌液，并均匀涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基中，于37℃培养箱过夜培养。于第二天挑取单克隆，使用引物SP3F/SP1R进行PCR检测，并将阳性克隆送擎科公司测序。

实施例2大豆转基因茅根靶点编辑效果检测

(1)主要试剂和来源

发根农杆菌感受态细胞K599购自全式金公司；提取毛根DNA来自栽培大豆Wm82(Glycine max Wm82.a2.v1)。质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为试剂公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8；毛根诱导培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，2％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂Basta，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由广州擎科生物公司完成。

检测Cas9骨架的引物为：

Cas9-F：5’-GTGGGAGGCGAGGTAGAG-3’(SEQ ID NO:15)；

Cas9-R：5’-CGTCGACCACATTGTTCCTC-3’(SEQ ID NO:16)。

检测靶点的引物为：

JC1F：5’-CATTTGCCAGTCGCTAACTAC-3’(SEQ ID NO:17)；

JC1R：5’-GGGGCATAAAGTAGGAAGATTGC-3’(SEQ ID NO:18)；

JC2F：5’-CAATGCTATACTCCTACCTACG-3’(SEQ ID NO:19)；

JC2R：5’-CAAATTAAGAGAGACTAAGTGTTGTGG-3’(SEQ ID NO:20)；

JC3F：5’-GTTCCATCAAATAGAGGAGTCAG-3’(SEQ ID NO:21)；

JC3R：5’-GCTTGTGATCAAATGTTATAACATGATC-3’(SEQ ID NO:22)；

JC4F：5’-CCATTGATGGGGGGTTCTCG-3’(SEQ ID NO:23)；

JC4R：5’-CAAATTAGAGAGGCTAATTCTTGCGC-3’(SEQ ID NO:24)。

(2)操作步骤

第一步：转化农杆菌K599

将测序正确的阳性克隆进行质粒提取。在50μL农杆菌感受态细胞K599中加入0.1μg阳性质粒，轻轻混匀，在冰上静置30分钟，于液氮中冷冻1分钟，37℃水浴5分钟。在无菌操作台中加入500μL YEP培养基，28℃220rpm摇床培养2小时，4000rpm离心1分钟。重新悬浮菌液，并涂布于同时具有壮观霉素和利福平抗生素的YEP固体培养基上，28℃倒置培养36小时。挑取其中单克隆用引物SP3F/SP1R进行菌落PCR。反应体系为：

PCR程序设置为：95℃2min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃90s；72℃2min。进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统查看是否出现1000bp左右的目的条带(图3)。

第二步：侵染大豆子叶

选取颗粒饱满均匀、种皮无裂痕的大豆Willam82种子，用10％H₂O₂对种子表面进行消毒1min，然后用无菌去离子水冲洗干净。将消毒的种子播种在萌发培养基中，在大豆人工气候室中培养5天，直到子叶竖起，与下胚约成直角状态。将第一步得到的含有目的质粒的发根农杆菌K599放于培养箱，28℃培养至OD＝0.6左右。用解剖刀蘸取菌液在大豆子叶的正面划网格状，将处理好的子叶摆放到根诱导培养基上，25℃光照培养15天左右，毛状根长出。

第三步：靶点编辑效果检测

根据DNA提取试剂盒上的步骤，将步骤二中的毛状根混合，提取DNA。以提取的DNA为模板，用CAS9骨架和靶点检测引物分别扩增靶点序列进行检测。PCR反应体系为：

PCR程序设置为：：94℃2min；35个循环：95℃30s，59℃30s，72℃1min；72℃5min。将利用CAS9引物PCR扩增有条带的样品对应的靶点扩增引物送到擎科公司进行测序，并通过BioEdit软件查看测序数据。根据靶点位置查看编辑效果，若测序结果显示，从靶点处开始出现双峰，则说明为有效编辑(图4)，该靶点编辑效率为70％。

实施例3大豆转基因纯合突变体的获得

(1)主要试剂和来源

本实验以大豆栽培品种Wm82为底盘材料。发根农杆菌感受态细胞K599购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8。共培养营养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.5％BBL琼脂，3％蔗糖，1mg/mL BAP，1mg/mL GA3，0.4mg/mL半胱氨酸胺，0.154mg/mL二硫苏糖醇，pH＝5.8。芽诱导培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g ME S，1mg/mLBAP，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8。茎伸长培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8，1mg/mL IAA，1mg/mLGA3，1mg/mL玉米素Zeatin-R。生根培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，0.5mg/mL NAA，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(K an，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由广州擎科生物公司完成。

(2)操作步骤

第一步：种子萌发

将表面光滑无破损的大豆种子在氯气中进行干燥表面消毒16小时后取出，置于超净工作台内吹30min除去氯气，然后播种于萌发培养基上，28℃光照培养3天。

第二步：农杆菌菌液准备

从新鲜YEP板上挑取单克隆(实施例2得到的含有目的质粒的发根农杆菌K599)放入2mL添加了卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的YEP液体培养基中，摇过夜培养，从中取2mL饱和菌液于加有卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的250mL的YEP液体中，于28℃摇至过夜，离心收集菌落，用CM液体悬浮菌液至OD650为1.0(EHA101)。

第三步：共培养

将菌液倒入培养皿中，用解剖刀切下发芽的种子，沿子叶下胚轴垂直剖开豆子，除去胚轴上的幼芽，在子叶节区域内垂直于轴切出7-8个切口；将切好的外植体放到有悬浮菌液的培养皿中侵染30分钟，用镊子将外植体转移到共培养营养基上，切口向下，封好后于培养箱中暗培养3天。

第四步：幼芽诱导

共培养3天后，将外植体置于芽诱导培养基上生长14天后，在子叶节部位齐平切取子叶节下胚轴，将新露出的伤口插入新的芽诱导培养基中，继续培养14天。

第五步：幼芽生长

切去分化外植体上的子叶，并在节的基部切一个新的切口，然后将外植体转移到茎伸长培养基上，在培养室中生长2-8周，每两周换一次新的培养基，每次都在外植体的基部切一个新鲜的水平切口。

第六步：生根

幼芽生长到3cm长时，把他们从组织上切下，然后将其转移到装有生根培养基的培养瓶中培养，2周之后，待幼苗长出足够多根后，将其转移到基质中于培养箱中培养4周，然后将小苗转移到温室培养至结荚。

第七步：转基因植株的检测

除草剂筛选：在转基因植株上选取完全展开的三出复叶中一片，用记号笔在一半作标记，另一半用棉签蘸取稀释好的除草剂Basta涂抹在叶片正面2-3天后观察叶片变化。如果叶片发生失绿、变黄，枯萎或者有色斑点产生则说明该植株不抗除草剂，为阴性的非转基因材料；如果叶片没有发生变化，说明其植株内有除草剂抗性，可能为阳性植株。

转基因植株的鉴定：提取抗除草剂的T₀代植株叶片，利用DNA提取试剂盒提取叶片DNA，并通过CAS9检测引物进行PCR鉴定，选取PCR阳性植株利用靶点检测引物进行扩增，筛选已编辑的阳性转基因株系，并进行T1代繁种。在T₁代苗中通除草剂涂抹、CAS9的PCR检测以及靶点引物检测，获得一种无cas9骨架的纯合双突变体sweet11/21。sweet11/21的编辑方式为：在GmSWEET11的第一个靶点处存在单碱基的T插入，在第二个靶点存在12bp的片段缺失；在GmSWEET21的第一个靶点处存在单碱基的T插入，在第二个靶点存在21bp的片段缺失(图5)。

实施例4突变体植株的表型观察

将所获得的纯合突变体sweet11/21分别种于长日照(16小时光照/8小时黑暗)和短日照(12小时光照/12小时黑暗)培养箱中，并于出苗第6天对其下胚轴长度进行观察统计。结果显示，无论长日照还是短日照下，相比于野生型Wm82，sweet11/21的下胚轴显著增加，说明GmSWEET11/21的突变导致了蛋白的提前终止，增加了大豆下胚轴长度(图6)。此外，将sweet11/21于2022年6月播种于石家庄(37°27＇N，113°30＇E)自然光照试验田中，每行种植20株，行长1.5m，行距80cm。并于2022年10月检测突变体单株产量，结果显示sweet11/21的百粒重和单株粒重与Wm82相比显著降低，说明GmSWEET11/21的突变影响了大豆的单株产量(图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.大豆SWEET同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用；

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有：

(1)、如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

3.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求2所述的核酸分子以及可接受的基因元件。

4.重组载体，其特征在于，包括：如权利要求2所述的核酸分子和/或如权利要求3所述的表达盒。

5.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求4所述的表达载体。

6.如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的表达载体和/或如权利要求5所述的宿主在调控大豆的下胚轴长度中的应用。

7.如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的表达载体和/或如权利要求5所述的宿主在提高大豆产量中的应用。

8.如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的表达载体和/或如权利要求5所述的宿主在改良大豆品种中的应用。

9.如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的表达载体和/或如权利要求5所述的宿主在大豆培养和/或育种中的应用。

10.大豆的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：取如权利要求5所述宿主接种培养后，获得菌液；